楊 艷 ，張宿義 ，秦 輝 ，李德林 ，羅 杰 ，蔡小波

(1.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000； 2.瀘州保諾生物科技有限公司，四川瀘州646000； 3.國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，四川瀘州646000)

黃水是固態(tài)白酒釀造過程中的副產物，又名黃漿水，為棕黃色黏稠液體[1]。在濃香型白酒的生產中，含水量為52%～55%的入窖酒醅經過厭氧發(fā)酵，其中的淀粉在酶、細菌和酵母菌等微生物的作用下，由糖轉變?yōu)榫疲⑸啥趸?。隨著發(fā)酵的進行，微生物代謝所生成的水與酒醅中尚未被微生物利用的水分逐漸沉降，從而將酒醅中的有機酸、酵母溶出物、可溶性淀粉、單寧、還原糖、香味前體物質等溶于其中，并沉積到窖底而形成黃水。因而，黃水中含豐富的有機酸(尤其是己酸、乳酸、丁酸、乙酸等羧酸含量最高)、醇、醛、酯等呈香呈味物質，同時還含有氨基酸、糖類、酒精、腐殖質、酵母菌體自溶物、微生物菌體以及活細胞等。許多學者和廠家對黃水的處理與利用進行了一系列的研究與探討[2-16]，但在其資源化利用和實用性技術方面的研究相對較少。目前我國大部分酒廠對黃水的處理都是采用將其拌糟回窖發(fā)酵或養(yǎng)窖、培養(yǎng)人工窖泥、回底鍋蒸餾等方法加以利用，不僅不能有效利用資源，而且無法從根本上解決發(fā)酵黃水的最佳綜合利用問題。

開展清潔生產以及產業(yè)內循環(huán)發(fā)展是21世紀可持續(xù)發(fā)展的主要目標。黃水的pH值為3.0～3.5，其BOD：25000～30000 mg/L，COD：25000～40000 mg/L，遠超過國家允許的廢水排放標準，因此如何綜合利用黃水資源，徹底解決黃水的最佳綜合利用問題，已經成為白酒行業(yè)面臨的重大課題。本實驗以黃水為原料，利用己酸菌進行生香發(fā)酵，提高發(fā)酵液中己酸等有機酸香味物質成分的含量，為后期的酯化、生香和老熟做好充分準備，最終得到生物發(fā)酵液產品，并將其應用于傳統白酒釀造，促進糟醅發(fā)酵生香，增加己酸乙酯含量，提高基礎酒產質量水平。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

黃水：由瀘州老窖羅漢釀酒基地提供，優(yōu)質己酸菌是從百年以上老窖池中分離富集所得。

試劑：無水乙醇(分析純)，2-乙基丁酸(色譜純)。

儀器設備：Agilent 6890 GC儀，FID檢測器；數據處理采用Agilent 6890工作站；檢測器與進樣口的溫度均為250℃。Agilent 5975I GC-MS，EI源，離子源溫度180℃，接口溫度200℃，電離電壓70 eV。

1.2 色譜條件

交聯石英毛細管柱DM-WAX30 m×0.25 mm×0.25μm，起始柱溫40℃，恒溫2 min后以5℃/min升至80℃，再以10℃/min升至260℃，繼續(xù)保持恒溫約10 min。載氣均為高純氮，全部采取分流進樣，分流比約為1∶30，色譜進樣1 μL。

1.3 樣品預處理

生物發(fā)酵液發(fā)酵結束后，取發(fā)酵液100 mL，加入50 mL無水乙醇后蒸餾，取餾出液100 mL進行理化和色譜分析。

定量分析時以60%vol乙醇為基體，2%2-乙基正丁酸的內標混合液，然后準確移取10 mL蒸餾樣，添加0.1 mL內標液混勻即可供進樣。

1.4 最佳工藝條件的確定

1.4.1 單因素試驗

以發(fā)酵溫度、接種量、乙醇添加量和發(fā)酵時間為因素進行單因素試驗，確定正交試驗各因素的水平。

1.4.2 正交試驗設計

所謂正交試驗設計，是以概率論和數理統計為理論基礎，用正交試驗表安排多因素試驗順序，把各因素均衡分布、因素之間均衡搭配，使各因素在試驗中對測試結果的影響基本上相同或相近，最大限度地排除了其他因素的干擾，突出了被考察因素的效應，基本上能夠反映試驗的全面情況[17-20]。

2 結果與討論

2.1 生物發(fā)酵液培養(yǎng)單因素考察

2.1.1 不同發(fā)酵溫度對生物發(fā)酵過程己酸生成量的影響

己酸菌液接種量10%，乙醇濃度5%，發(fā)酵時間10 d，發(fā)酵溫度設置為20℃、25℃、30℃、35℃和40℃，另設置1個不添加己酸菌液的空白對照樣，發(fā)酵結束后進行色譜檢測分析。不同發(fā)酵溫度下的己酸含量見圖1。

圖1 不同發(fā)酵溫度對己酸生成量的影響

由圖1可知，空白對照樣，不同溫度條件幾乎都沒有己酸的生成；隨著發(fā)酵溫度的升高，試驗樣的己酸含量呈上升趨勢，發(fā)酵溫度為35℃時，己酸的生成量最高，達到1.34 g/L，當發(fā)酵溫度為40℃時，試驗樣中己酸含量大幅下降。這是因為溫度較低或較高都不利于微生物的生長繁殖，同時過高的溫度對微生物酶的酶活也產生一定抑制作用，影響己酸的生成。根據圖1，本研究正交試驗發(fā)酵溫度的3個水平選擇為30℃、35℃和40℃。

2.1.2 不同接種量對生物發(fā)酵過程己酸生成量的影響

乙醇濃度5%，發(fā)酵時間10 d，發(fā)酵溫度設置為35℃，己酸菌液接種量分別設置為發(fā)酵液體積的0%、5%、8%、10%、12%和15%。發(fā)酵結束后進行色譜檢測分析。不同接種量條件下的己酸含量見圖2。

圖2 不同接種量對己酸生成量的影響

由圖2可知，隨著接種量的增加，己酸含量呈上升趨勢，當接種量達到10%時，己酸生成量達到最大值1.22 g/L，而接種量超過10%后，己酸生成量沒有增加，反而有小幅下降?？赡苁前l(fā)酵體系中底物濃度有限，隨著接種量的增加，發(fā)酵底物不能滿足微生物的生長所需，導致己酸菌的生長繁殖受到抑制，造成己酸生成量逐漸下降。根據圖2，本研究正交試驗接種量因素的3個水平選擇為8%、10%和12%。

2.1.3 不同乙醇濃度對生物發(fā)酵過程中己酸生成量的影響

發(fā)酵時間10 d，發(fā)酵溫度設置為35℃，己酸菌液接種量為10%，乙醇添加量分別設置為發(fā)酵液體積的0%、2%、5%、8%和10%。另設置1個不添加己酸菌液的空白對照樣。發(fā)酵結束后進行色譜檢測分析。不同乙醇添加量條件下的己酸含量見圖3。

圖3 不同乙醇添加量對己酸生成量的影響

由圖3可知，空白對照樣，不同乙醇濃度下幾乎都沒有己酸的生成；隨著乙醇添加量的增加，發(fā)酵液己酸含量呈上升趨勢，乙醇添加量為5%時，己酸含量達到最大值1.22 g/L，而乙醇添加量超過5%后，己酸含量隨乙醇添加量的增加而降低。適宜的乙醇含量能為微生物的生長繁殖提供碳源，乙醇濃度超過一定量后，會對己酸菌的生長繁殖產生一定的抑制作用，使生成的己酸含量減少，所以最佳乙醇添加量為5%。根據圖3，本研究正交試驗乙醇因素的3個水平選擇為2%、5%和8%。

2.1.4 不同發(fā)酵時間對生物發(fā)酵過程己酸生成量的影響

發(fā)酵溫度設置為35℃，己酸菌液接種量為10%，乙醇添加量為5%，發(fā)酵時間分別設置為5 d、8 d、10 d、12 d和15 d。設置空白對照發(fā)酵結束后進行色譜檢測分析。不同發(fā)酵時間條件下的己酸含量見圖4。

圖4 不同發(fā)酵時間對己酸生成量的影響

由圖4可知，空白對照樣，不同時間段幾乎都沒有己酸的生成；隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液己酸含量呈上升趨勢，發(fā)酵時間為10 d時己酸含量達到最大值1.26 g/L，而發(fā)酵時間超過10 d后，己酸含量隨發(fā)酵時間的延長基本保持穩(wěn)定。根據圖4，本研究正交試驗發(fā)酵時間因素的3個水平選擇為8 d、10 d和12 d。

2.2 生物發(fā)酵液生成己酸培養(yǎng)條件的優(yōu)選

2.2.1 正交試驗設計

采用正交試驗法對生物發(fā)酵液的培養(yǎng)工藝進行優(yōu)選，以生成的己酸含量為評定標準，本試驗選取4個因素：A(發(fā)酵溫度)、B(接種量)、C(乙醇添加量)、D(發(fā)酵時間)。每個因素設3個水平，選用L9(34)正交表，以生成的己酸含量為指標進行試驗，結果見表1。

表1 生物發(fā)酵液培養(yǎng)條件的因素-水平表L9(34)

2.2.2 生物發(fā)酵液最佳發(fā)酵工藝確定

正交試驗設計結果見表2，方差分析見表3。

表2 L9(34)正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析表

從統計分析結果可以看出，FA=117.874，FC=19.975，FD=5.534，P值均小于0.05。按α=0.05檢驗水準，可認為因素A、C、D有顯著性，為主要影響因素；FB=2.865，P值大于0.05，因素B無顯著性，為次要因素。根據對己酸生成量的極差R分析中可以看出，各影響因素作用的主次順序為A＞C＞D＞B，結合表2數據，各因素取均數估計最高者，確定最佳培養(yǎng)條件為：A2B3C2D1，即生物發(fā)酵液的培養(yǎng)條件為發(fā)酵溫度35℃，接種量12%，乙醇添加量5%，發(fā)酵時間為8 d。

2.2.3 重復性試驗

準確量取6份供試樣品溶液各100 mL，添加50 mL無水乙醇，按上述測定方法測定己酸含量。結果RSD=1.75%，表明樣品測定符合技術要求，重復性良好。

2.2.4 加樣回收率試驗

準確量取已知含量的供試品溶液(己酸含量為0.625 g/L)100 mL6份，置于150 mL容量瓶中，分別加入40 mg、40 mg、40 mg、60 mg、60 mg、60 mg的己酸，加無水乙醇定容至刻度，搖勻，按上述方法測定并計算加樣回收率。平均回收率為96.57%，RSD為1.16%，結果見表4。

2.2.5 最佳工藝驗證試驗

根據所篩選的最佳工藝條件應用于生物發(fā)酵液的培養(yǎng)，進行3次平行試驗，同法測得的己酸含量分別為 1.64 g/L、1.68 g/L和 1.65 g/L，RSD 為0.020817%，說明該工藝條件穩(wěn)定、可行。

3 結論

利用黃水、己酸菌液進行生物發(fā)酵，增加了己酸含量，為下一步酯化生香奠定了重要基礎。由以上研究可知，適宜的發(fā)酵溫度為35℃，接種量為12%，乙醇添加量為5%，發(fā)酵時間為8 d。

正交試驗的極差分析結果表明，各因素影響生物發(fā)酵液產己酸的主次順序為發(fā)酵溫度＞乙醇添加量＞發(fā)酵時間＞接種量；正交試驗方差分析結果表明，發(fā)酵溫度、乙醇濃度和發(fā)酵時間變化對生物發(fā)酵液己酸的生成量影響顯著，接種量對生物發(fā)酵液己酸的生成量影響不顯著。在優(yōu)化己酸的生成條件后，后期將進一步進行酯化、老熟、生香等研究，并將其應用于濃香型白酒的釀造生產過程中，以達到提高白酒產量和質量的目的。

表4 加樣回收率實驗結果(n=6)

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