蔡世芹

（黑龍江省林口縣畜牧獸醫(yī)局157699）

1 胚胎回收

牛胚胎大約在靜立發(fā)情后約第4天進入子宮，可在6～8d后回收胚胎，此時胚胎應處于桑葚胚或早期囊胚階段，胚胎周圍仍有透明帶包被。在回收胚胎之前，可采用直腸觸診法檢查超排反應效果，也可采用直腸內(nèi)超聲掃描來評估，后一種方法能更加準確地估計黃體數(shù)量和未排卵的卵泡數(shù)，但難以估計黃體的準確數(shù)量，特別是當卵巢上有多個黃體存在時更為困難。如果只有一兩個黃體，或是有卵泡囊腫，建議不要回收。沖胚先對母牛進行硬膜外麻醉，以阻止努責和排糞。沖胚過程中，應對會陰部、陰唇內(nèi)部進行清洗干凈，并用溫和的消毒劑仔細消毒，盡可能地減少污染非常重要。

最常用的采胚管是福利氏（Foley）橡膠導管，這種導管可經(jīng)直腸小心控制，由子宮頸導入子宮角的理想位置，當導管尖部到達子宮角中部時，將氣囊中裝滿鹽水或空氣。應注意在插入導管及充滿氣囊過程中切勿損傷子宮內(nèi)膜，否則會導致沖洗液回收不全或引起出血。如果出血，則隨后出現(xiàn)的血凝塊會干擾胚胎鑒定。在小母牛沖胚時可能有必要使用子宮頸開張器，應當注意開張器在進入最后一個子宮頸環(huán)后不要穿入子宮。

兩個子宮角可分別進行沖洗，或沖洗整個子宮體。常用的沖胚液一般為改良的Dulbecco's磷酸鹽緩沖液（DPBS），添加1～2%的牛血清白蛋白（BSA）或者犢牛血清（FCS）及各種抗生素。為了防止胚胎黏附到過濾器、培養(yǎng)皿和導管上，沖胚液中應加入足夠的、沒有被病毒污染的蛋白質(zhì)。有兩種沖胚方法，即連續(xù)沖胚法，或用30～50ml沖胚液的注射-抽吸式重復間斷式?jīng)_胚法。所需沖胚液的量在不同動物略有不同，每個子宮角約0.5L，經(jīng)產(chǎn)牛用量大些。不論采用哪種方法都要回收所有注入的沖胚液，因為其中可能會有胚胎。

回收的沖胚液隨后轉(zhuǎn)入特殊設計的孔徑為70μm的濾器中，使體細胞（如紅細胞）和組織碎片通過，但能留下胚胎（直徑約150～200μm）。 然后將濾器中的物質(zhì)再轉(zhuǎn)入有方格標記的皮氏培養(yǎng)皿中，同時用沖胚液反復洗滌濾器底部。采用漏斗或其他錐狀玻璃器皿用沉淀法收集胚胎，檢胚時，黏液和其他碎片可能會把胚胎包裹起來干擾操作。檢胚在立體顯微鏡50～100倍放大下進行，找到胚胎后將其轉(zhuǎn)入小的加有5～10%FCS的DPBS小培養(yǎng)皿中。

2 胚胎質(zhì)量的評價

在不含血液和組織碎片的皮氏培養(yǎng)皿中對胚胎發(fā)育階段和質(zhì)量進行評價。對胚胎形態(tài)學評估應按國際胚胎移植協(xié)會標準，評價胚胎所處的發(fā)育階段和胚胎質(zhì)量。在第6～7天回收的受精卵中，大多數(shù)胚胎都處于致密桑葚胚、早期囊胚、囊胚或擴張囊胚階段。如果在發(fā)情后第8天前回收胚胎，則很少能見到孵化囊胚。致密桑葚胚至少應有16個細胞，單個卵裂球的表面應清晰。雖然在早期囊胚期囊胚腔小，但可區(qū)別內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞。當在培養(yǎng)皿中觀察時，胚胎可能會吸入一些液體，形成一個或小或大的囊胚腔，這是胚胎健康又質(zhì)量高的標志。但體外生產(chǎn)的胚胎卻很少看到這樣的現(xiàn)象。胚胎質(zhì)量一般評定為優(yōu)質(zhì)、良好、一般、較差4等，另外還需辨別出未受精的卵子（UFOs）。 要清晰地辨別出優(yōu)質(zhì)和良好的胚胎比較困難，因為它們都呈球形，卵裂球無退化應現(xiàn)象。質(zhì)量屬于一般范疇的胚胎，有些卵裂球或許發(fā)生退化，位于滋養(yǎng)層細胞之外，不再參與胚胎形成。質(zhì)量屬于較差范疇的胚胎，正常卵裂球數(shù)極少。未受精卵子可能會呈現(xiàn)不同的形狀，有時會出現(xiàn)退化現(xiàn)象，或者會包含有降解的分布不均勻的卵質(zhì)。

體內(nèi)產(chǎn)生的牛桑葚胚和囊胚活力很強，可保存在小皮氏培養(yǎng)皿（內(nèi)有適量培養(yǎng)液）中，或是保存在人工授精用細管中，在室溫下保存24h而活力并不喪失。如果回收后在4℃條件下保存48h，也能得到令人滿意的妊娠率。此外，體內(nèi)生產(chǎn)的胚胎對冷凍和玻璃化過程的耐受性也很強。

胚胎回收的結(jié)果有很大差異，因為它們?nèi)Q于供體對超排的反應性。雖然如此，一般來說期望能得到如下結(jié)果，5%的供體由于對超排刺激的反應性很低而不能沖胚；20%的供體回收的胚胎不宜移植或沒育后力；每個供體胚胎或UFOs的總數(shù)為8～10個，其中約6個胚胎可以移植。