韋 康， 王麗鴛， 王新超， 陳建興， 胡惜麗， 楊廣誼， 成 浩*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2.縉云縣農(nóng)業(yè)局，浙江 縉云 323000）

“中黃2號”是由縉云農(nóng)家茶園中發(fā)現(xiàn)的黃化單株選育而來。由它制成的黃茶具有三黃透三綠的特點，即外觀色澤，金黃透綠，光潤勻凈；湯色，鵝黃隱綠，清澈明亮；葉底，玉黃含綠，鮮亮舒展[1]。這些性狀都與中黃2號在芽葉萌發(fā)階段葉色發(fā)黃有關(guān)，見圖1。經(jīng)過近8年的無性繁育觀察及3年多的品比試驗，中黃2號的葉色及品質(zhì)性狀一直表現(xiàn)穩(wěn)定，其特有的滋味及香氣深受消費者的喜愛[2]。目前，中黃2號已發(fā)展4 000余畝，不僅在浙江縉云種植，在四川、貴州等省也開始大力發(fā)展，是中茶所近年來重點推廣的幾個優(yōu)質(zhì)品種之一。

圖1 中黃2號芽葉萌發(fā)照片F(xiàn)ig.1 Germinating leaves and buds of yellow tea cultivar“Zhonghuang 2”

中黃2號的優(yōu)異品質(zhì)來源于芽葉的黃化。經(jīng)過長期觀察發(fā)現(xiàn)，中黃2號在芽葉萌發(fā)初期葉色最黃，隨著成熟度的提高，葉片逐漸返綠，而其成熟葉葉色與普通綠茶無異。那么，中黃2號黃化的機理是什么，在其萌發(fā)過程中哪些亞細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，這些變化與普通綠茶有哪些差異？這些問題目前還不得而知。對于其他植物的研究發(fā)現(xiàn)，芽葉的黃化或白化通常與葉綠素合成受阻有關(guān)[3-8]。而通過透射電鏡對茶樹白化品種亞細胞結(jié)構(gòu)觀察也發(fā)現(xiàn)，葉綠體結(jié)構(gòu)變化與白化性狀息息相關(guān)[9-10]。作者利用透射電鏡技術(shù)系統(tǒng)分析了中黃2號第2（黃化）、6葉（返綠），龍井43第2、6葉亞細胞結(jié)構(gòu)的異同。通過亞細胞水平觀察不同細胞器形態(tài)、構(gòu)成的差異，初步推斷中黃2號黃化的機制，為深入研究茶葉黃化對品質(zhì)、香氣等產(chǎn)生的影響打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及取樣

2012年6月20日在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所茶園內(nèi)分別取10個中黃2號與龍井43穗條，采用葉綠素儀（SPAD）分別測定其第2葉與第6葉葉綠素含量（n=10）。

取上述測定完成的中黃2號和龍井43穗條第2、6葉葉片用刀片分別切成小塊，放入1.5 mL離心管，加入2.5%戊二醛溶液，抽真空后放入4℃冰箱過夜。

另一方面，2012年6月20日在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所中黃2號茶園內(nèi)設(shè)置遮蔭處理。處理1周后取遮蔭處理及大田對照未遮蔭處理中黃2號第2葉用于透射電鏡研究。將樣品用刀片分別切成小塊后放入1.5 mL離心管，加入2.5%戊二醛溶液，抽真空后放入4℃冰箱過夜。

1.2 透射電鏡觀察

樣品前處理參照陳常頌等的研究方法[11]。待樣品包埋好后，用Reichert超薄切片機切成70～90 nm的切片，用檸檬酸鉛溶液處理切片15 min，用醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液再染色15 min，染色后的樣品即可通過JEM-1230型透射電鏡進行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 中黃2號與龍井43葉綠素相對含量比較

通過SPAD儀測定得到中黃2號、龍井43第2、6葉葉綠素相對含量的比較見圖2。發(fā)現(xiàn)中黃2號第2、6葉的葉綠素相對含量都明顯低于對照品種龍井43。特別是對第2葉的比較發(fā)現(xiàn)，中黃2號的葉綠素相對含量僅為龍井43的21.8%，這說明中黃2號在芽葉萌發(fā)初期葉綠素合成受阻。

圖2 中黃2號與龍井43第2、6葉葉綠素相對含量比較Fig.2 Chlorophyll contents of the second and sixth leaves in tea cultivar Zhonghuang 2 and Longjing 43

2.2 透射電鏡比較中黃2號與龍井43亞細胞結(jié)構(gòu)

進一步通過透射電鏡對中黃2號及龍井43亞細胞結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，中黃2號第2葉葉綠體較龍井43小，僅是后者的50%左右（圖3A、C）。通過進一步放大透射電鏡觀察倍數(shù)可以發(fā)現(xiàn)，中黃2號葉綠體內(nèi)基粒片層少且簡單，沒有形成片層堆疊（圖3B）。而龍井43葉綠體內(nèi)的基粒片層則極為發(fā)達，具有復(fù)雜的片層堆疊結(jié)構(gòu)（圖3D）。

中黃2號第6葉葉綠體明顯增大，同時合成淀粉粒的能力明顯提高（圖4A）。在多個葉綠體中都能發(fā)現(xiàn)淀粉粒的存在。而進一步放大觀察可以發(fā)現(xiàn)中黃2號葉綠體中基粒片層明顯增多（圖4B）。但是和龍井43第6葉葉綠體結(jié)構(gòu)相比，其基粒片層還是略少，同時片層的堆疊仍不如龍井43發(fā)達（圖4D）。這些葉綠體內(nèi)基粒片層結(jié)構(gòu)的差異與之前樣品葉綠素含量的結(jié)構(gòu)正好吻合，說明中黃2號黃化可能與其葉綠體基粒片層結(jié)構(gòu)合成較慢，無法有效形成片層堆疊有關(guān)。

2.3 遮蔭對中黃2號葉綠體結(jié)構(gòu)的影響

為進一步明確中黃2號黃化是否與其葉綠體基粒片層結(jié)構(gòu)有關(guān)，對遮蔭及對照條件下中黃2號第2葉亞細胞結(jié)構(gòu)進行了觀察，見圖5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，遮蔭后中黃2號葉綠體基粒片層堆疊明顯增多（圖5B）；而對照葉綠體片層結(jié)構(gòu)則十分松散，數(shù)量也很少（圖5A）。該結(jié)果與之前中黃2號與龍井43亞細胞結(jié)構(gòu)的比較一致，說明中黃2號黃化可能主要與葉綠體片層結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。

圖3 中黃2號與龍井43第2葉亞細胞結(jié)構(gòu)比較Fig.3 Comparison of subcellular structures in the second leaves of Zhonghuang 2 and Longjing 43

圖4 中黃2號與龍井43第6葉亞細胞結(jié)構(gòu)比較Fig.4 Comparison of subcellular structures in the sixth leaves of Zhonghuang 2 and Longjing 43

圖5 遮蔭與不遮蔭條件下中黃2號第2葉葉綠體結(jié)構(gòu)比較Fig.5 Effect of shading on chlorophyll structures in the second leaves of Zhonghuang 2

3 結(jié)語

對于茶葉品質(zhì)而言，黃化或白化品種與普通綠茶相比最大的特點是氨基酸含量高，酚類物質(zhì)含量低[9]。這導(dǎo)致黃化或白化茶滋味更加鮮爽，口感也更容易被更多消費者接受。前期通過采集多個地區(qū)種植的多個綠茶品種春茶樣品，來研究氣候條件和葉綠素相對含量對兒茶素組分、茶葉品質(zhì)的影響[12]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，適度低溫、較低的葉綠素相對含量往往對應(yīng)于較好的綠茶品質(zhì)。這說明培育低葉綠素品種可以作為改良茶葉品質(zhì)的一條途徑。但葉綠素相對含量過低往往對茶樹的生長造成影響，完全無法合成葉綠素的茶樹在苗期即死亡。如何平衡品質(zhì)與生長的關(guān)系是茶樹育種研究的關(guān)鍵。

過去對白化茶樹品種的研究較多，如安吉白茶[10]、小雪芽[9]等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些品種通常發(fā)生葉綠體退化、解體，葉綠體內(nèi)部含有大量囊狀小泡。對于黃化茶樹品種的研究則很少。黃化茶是否也與葉綠體合成受阻有關(guān)，如果兩者相關(guān)，為什么白化茶為全白色，而黃茶仍帶有顏色，對于這些問題目前還缺乏相關(guān)報道，而透射電鏡技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用則為我們解答這些問題提供了條件。

作者首次采用透射電鏡技術(shù)比較了中黃2號、龍井43第2、6葉亞細胞結(jié)構(gòu)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：中黃2號葉綠體結(jié)構(gòu)完整，沒有出現(xiàn)解體或大量囊泡，但基粒片層堆疊明顯少于龍井43。這說明中黃2號黃化與基粒片層合成減緩有關(guān)，但葉綠體受損情況沒有白茶嚴重[9-10]，這也解釋了中黃2號為黃色而不是白色的原因。

總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)中黃2號黃化可能與其葉綠體基粒片層堆疊減少有關(guān)。對于該現(xiàn)象的分子機制，特別是哪些基因的變化阻礙了基粒片層的合成，它們對品質(zhì)性狀是否有調(diào)控作用，其機制是什么，這些還需要通過二代測序技術(shù)、轉(zhuǎn)基因等手段進一步分析。本研究的完成為后續(xù)深入研究黃茶黃化機理打下了基礎(chǔ)。

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