黃筱萍, 黃國(guó)昌, 金丹鳳, 劉 蘭, 熊大維
(江西省科學(xué)院 微生物研究所,江西 南昌330029)
2-苯乙醇(2-Phenylethanol,2-PE)是一種具有玫瑰香味的芳香醇,亦是芳香族化合物中最重要的香料品種之一,廣泛應(yīng)用于食品香精、化妝品和日化產(chǎn)品中。天然2-PE是從植物(主要是玫瑰花)中提取,由于其含量太低、成本高,無法滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[1]。利用微生物轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生成2-PE是取代天然2-PE產(chǎn)品的有效途徑,酵母菌通過Ehrlich途徑轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的L-苯丙氨酸 (L-Phe)為2-PE可大幅度提高2-PE的產(chǎn)量[2]。酵母在自身生長(zhǎng)代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量的乙醇,乙醇和2-PE聯(lián)合作用對(duì)菌體產(chǎn)生的毒性是生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)2-PE中產(chǎn)物濃度不高的主要原因,也是制約生物法生產(chǎn)天然2-PE的技術(shù)關(guān)鍵[2-4]。目前采用兩相萃取技術(shù)原位轉(zhuǎn)移2-PE可一定程度解決產(chǎn)物抑制效應(yīng)[5-7],但分離純化困難,提取精制收率低。利用樹脂吸附技術(shù)原位轉(zhuǎn)移2-PE亦可提高2-苯乙醇產(chǎn)量[8-9]。本研究所采用的酵母靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-PE的方法是利用已經(jīng)培養(yǎng)好的酵母細(xì)胞,重新懸浮于緩沖溶液中催化L-Phe轉(zhuǎn)化成2-PE。以菌體細(xì)胞作為酶的載體,根據(jù)酶的特性添加促進(jìn)Ehrlich途徑中酶活的離子和輔酶NADH再生輔助底物,在單因子試驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用SAS軟件進(jìn)一步優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件,探討各因素的交互效應(yīng),得到較優(yōu)條件組合。酵母靜息細(xì)胞催化反應(yīng)專一性強(qiáng),底物轉(zhuǎn)化率高,生成的副產(chǎn)物少,細(xì)胞可以重復(fù)利用,無需在無菌條件下進(jìn)行操作[10-11]。在靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中添加大孔樹脂進(jìn)行原位產(chǎn)物吸附可顯著提高2-PE的產(chǎn)率,并使下游提取精制易于實(shí)施。目前靜息細(xì)胞的研究在許多領(lǐng)域已經(jīng)展開,如天然化合物的生物合成、藥物前體化合物轉(zhuǎn)化、乳酸、乙酸的生產(chǎn)等領(lǐng)域[12-15]。
菌種Saccharomyces cerevisiae SH003:由作者所在實(shí)驗(yàn)室篩選獲得,現(xiàn)保存于江西省科學(xué)院微生物研究所;斜面培養(yǎng)基(麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基g/L):葡萄糖 30,蛋白胨 5,酵母粉 3,麥芽汁 3,pH自然;細(xì)胞增殖培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 30,蛋白胨 5,酵母粉3,麥芽汁 3,pH 5.8~6.2;L-苯丙氨酸:河北冀海生物科技有限公司,純度99.5%;2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品:Sigma公司,純度98.5%;甲醇:色譜純;超純水自制,其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;SHIMADZU LC-20A高效液相色譜儀;Agilent HC-C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);Sartorius practum 224-1CN 分析天平,湖南湘儀高速冷凍離心機(jī)H2500R-2。
1.2.1 靜息細(xì)胞制備 從斜面挑取1~2環(huán)菌苔至30 mL細(xì)胞增殖培養(yǎng)液中,于28℃、180 r/min培養(yǎng)18 h,再以2%的接種體積分?jǐn)?shù)接種于細(xì)胞增殖培養(yǎng)液中,于28℃、180 r/min培養(yǎng)24 h,進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng),冷凍離心(8 000 r/min,15 min),用 0.1 mol/L的磷酸鈉緩沖液(pH 6.8)洗滌細(xì)胞兩次,將菌體重懸于0.1 mol/L的磷酸鈉緩沖液中,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法 用0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液配制不同濃度的靜息細(xì)胞液,加入底物L(fēng)-苯丙氨酸和輔助底物,于28℃、200 r/min反應(yīng)24 h,10 000 r/min離心10 min,上清液采用高效液相色譜法檢測(cè)L-苯丙氨酸和2-苯乙醇質(zhì)量濃度。
1.2.3 靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化方法
1)單因素優(yōu)化:取不同培養(yǎng)時(shí)間的酵母菌體離心,制成靜息細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇,對(duì)制備靜息細(xì)胞的菌體菌齡進(jìn)行優(yōu)化,測(cè)定靜息細(xì)胞濃度和不同的緩沖液體系對(duì)合成轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的影響。
2)靜息細(xì)胞輔酶輔助底物再生體系的構(gòu)建:通過添加不同的輔助底物還原糖(如葡萄糖、蔗糖、D-甘露糖、D-木糖、阿拉伯糖等)或醇類(如甲醇、乙醇、丙醇)進(jìn)行還原型輔酶NADH再生。
3)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選影響靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子:采用SAS軟件中多因素二水平試驗(yàn)設(shè)計(jì),以2-苯乙醇產(chǎn)量作為響應(yīng)用值Y,對(duì)影響轉(zhuǎn)化的因子如細(xì)胞濃度、底物質(zhì)量濃度、糖質(zhì)量濃度、pH、溫度、轉(zhuǎn)化時(shí)間進(jìn)行全面考察,篩選出主要影響因子。
4)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)合響應(yīng)面法分析篩選顯著因子的最優(yōu)水平:以Plackett-Burman設(shè)計(jì)結(jié)果為基礎(chǔ),選擇影響轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的顯著因子為自變量,以苯乙醇產(chǎn)量為響應(yīng)值,進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn),采用SAS軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸和圖形分析,得出優(yōu)化組合條件,再進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),檢驗(yàn)?zāi)P偷目尚行浴?/p>
5)靜息細(xì)胞重復(fù)利用:將首次轉(zhuǎn)化結(jié)束的靜息細(xì)胞離心,洗滌,重新懸浮,加入底物和輔助底物,在相同的條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化,驗(yàn)證靜息細(xì)胞催化穩(wěn)定性。
1.2.4 大孔樹脂HZ816對(duì)2-苯乙醇和L-苯丙氨酸的靜態(tài)吸附率與解吸率測(cè)定 準(zhǔn)確量取4 g/L L-苯丙氨酸和2 g/L 2-苯乙醇混合溶液100 mL加入具塞磨口三角瓶中,加入1 g預(yù)處理好的樹脂,于25℃、100 r/min振蕩3 h,真空抽濾,濾液測(cè)定2-苯乙醇和L-苯丙氨酸質(zhì)量濃度。計(jì)算樹脂的吸附率(mg/g)。收集吸附飽和的樹脂,用濾紙吸干表面水,加入具塞磨口三角瓶中,準(zhǔn)確量取10 mL 95%乙醇,于25℃、100 r/min振蕩4 h,計(jì)算樹脂解吸率(%)。
式中,c1為吸附前質(zhì)量濃度(mg/mL),c2為吸附后質(zhì)量濃度(mg/mL),V 為溶液體積(mL),m 為樹脂質(zhì)量(g)。
式中,c為解吸液質(zhì)量濃度 (mg/mL),V為解吸液體積(mL),m 為吸附質(zhì)量(mg)。
1.2.5 轉(zhuǎn)化液中加入大孔樹脂吸附2-苯乙醇試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取3 g樹脂加入30 mL靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中,加入底物L(fēng)-苯丙氨酸和輔助底物,于26℃、200 r/min反應(yīng)40 h,真空抽濾,濾液10 000 r/min離心5 min后檢測(cè)得L-苯丙氨酸和2-苯乙醇質(zhì)量濃度。樹脂加入具塞磨口三角瓶中,加入30 mL 95%的乙醇,于25℃、100 r/min振蕩4 h,5 000 r/min離心5 min,上清液檢測(cè)得L-苯丙氨酸和2-苯乙醇質(zhì)量濃度。
1.2.6 反相高效液相色譜法測(cè)定L-苯丙氨酸和2-苯乙醇含量[16]發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心10 min,取上清液,稀釋,用0.22 μm聚醚水性濾膜過濾后 HPLC 分析。 流動(dòng)相為 v(甲醇)∶v(水)=50%∶50%,流速為 1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng) 260 nm,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量 10 μL。
靜息細(xì)胞的轉(zhuǎn)化依賴胞內(nèi)酶的活性,菌體在不同的生長(zhǎng)階段相應(yīng)酶表達(dá)活性相差較大,考察了細(xì)胞不同生長(zhǎng)階段的轉(zhuǎn)化能力。轉(zhuǎn)化條件:分別取在擴(kuò)增培養(yǎng)液中生長(zhǎng)不同時(shí)間的菌體,用0.1 mol/L的磷酸鈉緩沖液(pH 5.5)配制成10%的菌體濃度,加入8 g/L L-苯丙氨酸,輔助底物20 g/L葡萄糖進(jìn)行轉(zhuǎn)化,結(jié)果見圖1。
圖1 菌齡對(duì)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的影響Fig.1 Effect of incubation time on 2-phenylethanol production by resting cell
隨著菌體培養(yǎng)時(shí)間的增加,2-苯乙醇產(chǎn)量也逐漸增加,當(dāng)菌齡達(dá)16 h時(shí),2-苯乙醇的增加漸緩,20 h產(chǎn)量達(dá)到最高,達(dá)2.34 g/L,隨后逐漸降低。這可能與菌體衰老自溶,胞內(nèi)酶釋放和活性降低有關(guān),因此選用菌齡為20 h的菌體制備靜息細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。
利用酵母細(xì)胞靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇,真正起作用的是細(xì)胞內(nèi)艾氏反應(yīng)途徑的酶系,菌體量直接影響參與反應(yīng)的酶量,進(jìn)而影響其催化轉(zhuǎn)化的反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率。用pH 5.5、0.1 mol/L的磷酸鈉緩沖液配制不同的細(xì)胞濃度,加入L-苯丙氨酸8 g/L,輔助底物葡萄糖20 g/L進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng),結(jié)果見圖2。當(dāng)細(xì)胞濃度為10%時(shí),2-苯乙醇產(chǎn)量達(dá)到最高,繼續(xù)提高細(xì)胞濃度不能增加2-苯乙醇的產(chǎn)量,這可能是由于過多的菌體導(dǎo)致溶氧供應(yīng)不足,同時(shí)影響溶液的傳質(zhì)效率,不利于轉(zhuǎn)化進(jìn)行,因此在轉(zhuǎn)化過程中細(xì)胞濃度控制在10%比較合適。
圖2 細(xì)胞濃度對(duì)轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇合成的影響Fig.2 Effect of cell concentration on 2-phenylethanol production by bioconversion
分別配制pH 5.5的0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液,0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液和0.1 mol/L磷酸鈉與磷酸鉀混合緩沖液,在細(xì)胞濃度為10%、L-苯丙氨酸為6 g/L、輔助底物葡萄糖為10 g/L進(jìn)行轉(zhuǎn)化,考察不同配比的緩沖液對(duì)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的影響,結(jié)果見圖3。
圖3 不同緩沖液對(duì)轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的影響Fig.3 Effect of buffer solution on 2-phenylethanol production by bioconversion
PO43+對(duì)細(xì)胞內(nèi)電子傳遞和還原性輔酶氧化起著重要調(diào)節(jié)作用,靜息細(xì)胞在K+濃度較高的緩沖液中轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇能力較高,轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的質(zhì)量濃度高10%左右,這表明K+也可能對(duì)艾氏代謝途徑的酶活具有一定的調(diào)節(jié)作用,有利于細(xì)胞的轉(zhuǎn)化合成。
酵母菌通過艾氏途徑轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇發(fā)生了氧化還原反應(yīng),即苯乙醛在脫氫酶的作用下生成了2-苯乙醇,由于細(xì)胞中脫氫酶在還原苯乙醛時(shí)要不斷消耗作為電子供體的還原型輔酶NADH,活性細(xì)胞需要不斷再生NADH以保持細(xì)胞內(nèi)正常的氧化還原狀態(tài)[17-18]。靜息細(xì)胞自身沒有再生輔酶能力,在轉(zhuǎn)化液中直接添加輔酶NADH可提高脫氫酶活性,但其價(jià)格昂貴。因此添加輔助底物構(gòu)建與細(xì)胞自身代謝耦合的輔酶再生系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇和重復(fù)利用的必要手段。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在轉(zhuǎn)化液通過添加輔助底物如還原糖和醇類進(jìn)行還原型輔酶再生。在細(xì)胞濃度為10%,L-苯丙氨酸為8 g/L,輔助底物質(zhì)量濃度20 g/L條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化,表1為添加不同輔助底物對(duì)轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的影響,對(duì)照為不添加輔助底物。
表1 不同輔助底物對(duì)轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的影響Table 1 Effect of co-substrates on 2-phenylethanol production by resting cells
從表1可以看出,在不添加輔助底物時(shí),基本上沒有2-苯乙醇的產(chǎn)生,這表明靜息細(xì)胞內(nèi)的NADH質(zhì)量濃度極低,制約了乙醇脫氫酶的活性。不同的輔助底物對(duì)合成2-苯乙醇的影響很大,乙醇、D-甘露糖、蔗糖和葡萄糖對(duì)轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇有明顯的促進(jìn)作用,而木糖、甲醇和丙醇沒有促進(jìn)作用,其中乙醇的促進(jìn)作用最為顯著,乙醇+葡萄糖、乙醇+蔗糖混合輔助底物的效果與乙醇相似,增加乙醇質(zhì)量濃度至40 g/L,2-苯乙醇產(chǎn)量無明顯增長(zhǎng)。
高質(zhì)量濃度的2-苯乙醇對(duì)生長(zhǎng)細(xì)胞有一定的毒性,可能是影響了原生質(zhì)膜的通透性,擾亂跨膜質(zhì)子電勢(shì)及糖類和氨基酸的運(yùn)輸系統(tǒng),乙醇和2-苯乙醇的聯(lián)合作用產(chǎn)生的毒性比它們各自產(chǎn)生的毒性累加作用要高[17-18],而在靜息細(xì)胞中添加高質(zhì)量濃度的乙醇對(duì)產(chǎn)物的合成沒有抑制作用,這也表明了靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸為2-苯乙醇主要依賴艾氏途徑的酶活性。
Plackett-Burman法是一種近飽和的二水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,選用實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)靜息細(xì)胞細(xì)胞濃度、底物質(zhì)量濃度、糖質(zhì)量濃度、轉(zhuǎn)化液pH、溫度、轉(zhuǎn)化時(shí)間進(jìn)行全面考察,另設(shè)3個(gè)虛擬變量用于估計(jì)誤差,每個(gè)因素取高(1),低(-1)兩個(gè)水平,應(yīng)用SAS(V9版)軟件分別計(jì)算各因素的效應(yīng)值,響應(yīng)值Y為2-苯乙醇產(chǎn)量,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2,各因素主效應(yīng)分析結(jié)果見表3。
表2 N=12的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與水平Table 2 N=12 Plackett-Burman experimental design and response value
表3 N=12 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素水平及各因素的主要效應(yīng)分析Table 3 N=12 Plackett-Burman experimental factors levels and main effect of various factors
從表3可以看出,6個(gè)因素對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響的主要因素主次關(guān)系依次為 X4>X9>X1>X7>X5>X2,乙醇質(zhì)量濃度、pH和轉(zhuǎn)化溫度對(duì)2-苯乙醇產(chǎn)量影響顯著,細(xì)胞濃度對(duì)2-苯乙醇產(chǎn)量有一定影響,反應(yīng)時(shí)間和L-苯丙氨酸濃度影響不顯著,系數(shù)R2=0.972 7,表明擬合程度良好。選擇乙醇質(zhì)量濃度、pH和轉(zhuǎn)化溫度3個(gè)因素作進(jìn)一步響應(yīng)面分析,其他因素正效應(yīng)取較高水平,負(fù)效應(yīng)取較低水平,即L-苯丙氨酸為8 g/L,反應(yīng)時(shí)間為24 h,菌體濃度為10%。
根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)確定的實(shí)驗(yàn)因素與水平,設(shè)計(jì)了三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),共有15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn),12個(gè)分析因子,3個(gè)為零點(diǎn),零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次估計(jì)誤差,以2-苯乙醇產(chǎn)量為響應(yīng)變量,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析結(jié)果見表4-5。
二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)表明:因素X1和X2對(duì)產(chǎn)2-苯乙醇效果的線效應(yīng)極顯著,因素X3對(duì)產(chǎn)2-苯乙醇效果的線效應(yīng)顯著;因素X12、X22對(duì)產(chǎn)2-苯乙醇效果的曲面效應(yīng)用極顯著,因素X32對(duì)產(chǎn)2-苯乙醇效果的曲面效應(yīng)用顯著;因素X1X2、X1X3和X2X3對(duì)產(chǎn)2-苯乙醇效果的交互影響不顯著。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多次擬合回歸,以2-苯乙醇產(chǎn)量(Y)為因變量,乙醇質(zhì)量濃度(X1)、轉(zhuǎn)化溫度(X2)、pH(X3)為自變量,建立回歸方程模型為:Y1=3.458+0.145 8X1-0.222X2-0.095X3-0.195X12-0.233X22-0.157X32。
表4 中心組合試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 4 Design and results of Box-Behnken
表5 回歸與方差分析結(jié)果Table 5 Results of regression and variance analysis
試驗(yàn)各因素對(duì)2-苯乙醇產(chǎn)量影響顯著程度大小依次為:轉(zhuǎn)化溫度>乙醇質(zhì)量濃度>pH,模型回歸F 值為 19.812 6,P=0.002 1(P<0.01),表明該模型極顯著;多元相關(guān)系數(shù)R2=0.972 7,表明模型對(duì)試驗(yàn)實(shí)際情況擬合較好,通過軟件求出回歸模型的極值點(diǎn),即最佳轉(zhuǎn)化條件為轉(zhuǎn)化溫度為26.04℃,乙醇質(zhì)量濃度為16.71 g/L,pH 5.11,產(chǎn)2-苯乙醇的理論最大值為3.55 g/L。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可靠性,在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),考慮到實(shí)際操作的方便,調(diào)整最佳培養(yǎng)條件為:轉(zhuǎn)化溫度為26℃,乙醇質(zhì)量濃度為17 g/L,pH 5.1,在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn),2-苯乙醇平均產(chǎn)量達(dá)3.54 g/L,與理論預(yù)測(cè)值相近,說明響應(yīng)用面法優(yōu)化釀酒酵母靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的轉(zhuǎn)化條件是可行的。
與生長(zhǎng)細(xì)胞相比,采用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化最大的特點(diǎn)就是在于菌體細(xì)胞可以重復(fù)使用,在上述優(yōu)化的轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)行菌體重復(fù)利用實(shí)驗(yàn),結(jié)果見圖4。
圖4 靜息細(xì)胞作為生物催化劑的重復(fù)利用Fig.4 Repeated utilization of resting cell as biocatalyst
靜息細(xì)胞第1次平均轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇產(chǎn)量為3.54 g/L,以第1次轉(zhuǎn)化靜息細(xì)胞的生物活性為100%計(jì),前3次重復(fù)利用試驗(yàn)中,靜息細(xì)胞的生物活性變化很小,均保持在98%以上,細(xì)胞重復(fù)使用第4次其活性開始下降,隨后靜息細(xì)胞的生物活性保持較平穩(wěn)的狀態(tài),重復(fù)利用第8次,其生物活性仍達(dá)91.6%,表明在優(yōu)化的轉(zhuǎn)化條件下,靜息細(xì)胞可以多次重復(fù)使用,2-苯乙醇產(chǎn)率無明顯下降。
從多種樹脂(數(shù)據(jù)未列出)中篩選出對(duì)產(chǎn)物吸附容量較大,對(duì)底物吸附容量低的大孔樹脂HZ816,表6為該樹脂對(duì)底物和產(chǎn)物的吸附率。
表6 HZ816樹脂對(duì)L-苯丙氨酸和2-苯乙醇的靜態(tài)吸附率Table 6 Static adsorption capability of L-Phe and 2-PE on HZ816
樹脂HZ816對(duì)2-PE的吸附率為103.5 mg/g,對(duì)底物L(fēng)-Phe的吸附率僅為5.8 mg/g,對(duì)產(chǎn)物的吸附量是底物的約18倍,是一種較理想的產(chǎn)物分離樹脂。用10倍樹脂體積的95%乙醇靜態(tài)洗脫2-PE,洗脫液中 2-PE 量為(98.3±3.8) mg,2-PE 的洗脫率為95%。
在靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化液中加入10%大孔樹脂,在最適轉(zhuǎn)化條件下轉(zhuǎn)化40 h,轉(zhuǎn)化18 h補(bǔ)加底物L(fēng)-Phe和輔酶輔助底物乙醇,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表7。
表7 大孔樹脂HZ816對(duì)靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-PE產(chǎn)量的影響Table 7 Effect of macroporous resin HZ816 on 2-PE bioconversion by resting cell
在轉(zhuǎn)化液中加入大孔樹脂,可大大提高2-PE產(chǎn)量,轉(zhuǎn)化液中2-苯乙醇質(zhì)量濃度較低,大量的產(chǎn)物2-PE被吸附在樹脂中。在L-Phe質(zhì)量濃度為8 g/L時(shí),加入樹脂的轉(zhuǎn)化液中2-PE產(chǎn)量提高55.4%,轉(zhuǎn)化率達(dá)90%,樹脂對(duì)2-PE的吸附率為82.4 mg/g,比其在水溶液中的吸附率(103.5 mg/g)低,這可能是高濃度的菌體降低了樹脂對(duì)產(chǎn)物的吸附。提高底物質(zhì)量濃度至15 g/L時(shí),產(chǎn)量達(dá)9.34 g/L,比未加樹脂產(chǎn)量提高171.5%,繼續(xù)提高底物質(zhì)量濃度,2-PE產(chǎn)量沒有提高,這可能是樹脂吸附已達(dá)飽和,需要進(jìn)一步增加樹脂的添加量。
通過釀酒酵母靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇,確定了培養(yǎng)20 h的菌體為制備靜息細(xì)胞最適菌齡;0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液有利于2-苯乙醇的合成;乙醇作為輔酶輔助底物可有效還原乙醇脫氫酶輔酶NAD為NADH,與糖類作為輔助底物相比,乙醇作為輔助底物便于后期產(chǎn)物的分離純化。
通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)法和響應(yīng)面試驗(yàn)建立了酵母靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件的二次多項(xiàng)式模型,得到靜息細(xì)胞最佳轉(zhuǎn)化條件為:乙醇質(zhì)量濃度為16.7 g/L,轉(zhuǎn)化溫度為 26℃,pH 5.1,2-苯乙醇產(chǎn)量為3.49 g/L,比優(yōu)化前產(chǎn)量提高了49.1%。此外,靜息細(xì)胞作為生物催化劑重復(fù)利用8次,其生物催化活性仍保持91.5%。在轉(zhuǎn)化液中加入樹脂進(jìn)行產(chǎn)物原位轉(zhuǎn)移,可大大提高2-苯乙醇產(chǎn)量,在底物質(zhì)量濃度為15 g/L時(shí),2-PE產(chǎn)量達(dá)9.34 g/L,底物轉(zhuǎn)化率為83.9%,比未加樹脂產(chǎn)量提高了171.5%。與生長(zhǎng)細(xì)胞相比,靜息細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇操作簡(jiǎn)便,無需在無菌條件下進(jìn)行操作,轉(zhuǎn)化液組成簡(jiǎn)單,細(xì)胞可多次重復(fù)使用,易于產(chǎn)業(yè)化,對(duì)未來工業(yè)應(yīng)用有潛在的優(yōu)勢(shì)。
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