萬 威， 李林強(qiáng)， 王瑞琴

（陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710119）

我國的動(dòng)物血資源極其豐富，每年約在2.3×106t以上，除少部分提取物得到利用外，大部分被廢棄掉，既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境[1-2]。牛血清蛋白（BSA）是牛血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，具有許多重要的生理功能，常用于生物、醫(yī)藥和保健食品等領(lǐng)域，對(duì)其進(jìn)行快速高效的分離純化廣受關(guān)注[3-4]。磁性微球分離、富集BSA是一種新興技術(shù)，其易操作、效率高、成本低、易再生等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。殼聚糖是甲殼素脫乙?；a(chǎn)物，作為堿性多糖其羥基、氨基含量豐富，易于通過化學(xué)修飾賦予多種功能[7]，由殼聚糖包覆磁性粒子制成的磁性殼聚糖微球兼有殼聚糖無毒與生物相容性好的特點(diǎn)[8]，但其對(duì)BSA吸附量較小，需對(duì)其進(jìn)行改性以提高其吸附效果。通過在微球上連接羧基使其表面帶負(fù)電荷，以提高其吸附能力，一直是研究的熱點(diǎn)之一[9-14]。L-谷氨酸具有安全無害、廉價(jià)易得、不造成污染等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，其所含氨基基團(tuán)能夠在弱堿條件下通過環(huán)氧氯丙烷與殼聚糖上的-NH2、-OH以共價(jià)鍵的方式結(jié)合，同時(shí)引入兩分子的羧基基團(tuán)。

作者采用反相懸浮法制備磁性殼聚糖微球，并通過環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)谷氨酸與磁性殼聚糖微球，探討溶液pH值、BSA質(zhì)量濃度、吸附時(shí)間等因素對(duì)BSA吸附效果的影響，并考察微球的可重用性，以期對(duì)磁性分離技術(shù)用于牛血清蛋白的分離回收提供一種便捷的新途徑。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

殼聚糖（脫乙酰率≥90.0%）、L-谷氨酸：購于上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；牛血清蛋白：購于美國Amresco公司；Span-80、液體石蠟：化學(xué)純；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Quanta 200環(huán)境掃描電子顯微鏡：FEI公司；Tensor27紅外光譜儀：德國Bruker公司；MS2000激光粒度分析儀：英國馬爾文儀器公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；雷磁PHS-3C酸度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器公司；D2F-6020型真空干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 磁性殼聚糖微球的合成及谷氨酸改性 根據(jù)文獻(xiàn)[15]制備殼聚糖包覆Fe3O4磁性微球的方法并加以改進(jìn)，采用反相懸浮法制備磁性殼聚糖微球[16-17]，并連接谷氨酸[18-19]。用3%的鹽酸配置60 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%殼聚糖溶液，加入100 mL FeCl3溶液（0.15 mol/L）超聲使其徹底混合均勻，在機(jī)械攪拌下加入 30 mL NaHSO3（0.1 mol/L）溶液，當(dāng)溶液由黃色變?yōu)榧t色再次變成黃色的瞬間用12%的氨水調(diào)節(jié)pH至11，70℃劇烈攪拌2 h后磁鐵吸附收集，用去離子水洗滌多次后加入3%的鹽酸使其再次溶解，得到磁性殼聚糖鹽酸溶液。

在40℃恒溫水浴條件下，加入200 mL液體石蠟和8 mL Span-80于500 mL燒瓶，機(jī)械攪拌混勻后，加入40 mL磁性殼聚糖鹽酸溶液，劇烈攪拌1 h，加入5 mL 25%戊二醛繼續(xù)攪拌1 h。將0.4 g谷氨酸、2 mL環(huán)氧氯丙烷、適量DMF和5 mL Na2CO3（0.5 mol/L）溶液于40℃攪拌活化1 h后滴加到燒瓶中。60℃劇烈攪拌3 h，產(chǎn)物用去離子水、無水乙醇、石油醚、丙酮反復(fù)多次沖洗，用磁鐵吸附分離于60℃真空干燥24 h。使用紅外光譜儀（IR）檢測殼聚糖包覆Fe3O4效果、殼聚糖與谷氨酸的連接效果；使用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察GA-CMNs形貌；使用激光粒度儀檢測GA-CMNs的粒徑分布情況。

1.3.2 GA-CMNs對(duì)BSA的吸附容量 準(zhǔn)確稱量0.010 g GA-CMNs加入一定質(zhì)量濃度的BSA溶液，25℃恒溫水浴振蕩（120 r/min）一段時(shí)間。通過磁鐵吸附分離磁性微球，測定上清液在UV278 nm[13]吸光度值，并利用測定吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算BSA的初始和最終質(zhì)量濃度，利用下式計(jì)算吸附容量：

式中，c0為初始BSA質(zhì)量濃度 （mg/mL）；c1為吸附后BSA質(zhì)量濃度 （mg/mL）；V為溶液的體積，mL；m為 GA-CMNs的質(zhì)量（g）；Qe為吸附容量（mg/g）。

1.3.3 不同pH值溶液對(duì)BSA吸附量的影響 稱取10 mg的GA-CMNs，加入到4 mL pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 質(zhì) 量 濃 度 為 1 mg/mL 的BSA溶液中，25℃恒溫水浴振蕩100 min后分離，測定并計(jì)算吸附量，采用0.05 mol/L CH3COONa-CH3COOH緩沖液控制pH 4.0～6.0；采用0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液控制 pH 7.0～9.0。

1.3.4 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)BSA吸附量的影響 配置BSA質(zhì)量濃度為1 mg/mL，稱取10 mg的GA-CMNs加入到4 mL含不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)（分別為0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的 NaCl溶液）的 BSA溶液中，其余操作同上，測量并計(jì)算吸附量。

1.3.5 吸附時(shí)間對(duì)BSA吸附量的影響 稱取50 mg GA-CMNs，加入20 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL BSA溶液中，120 min內(nèi)每10分鐘取上清液測定并計(jì)算吸附量。

1.3.6 初始BSA質(zhì)量濃度對(duì)BSA吸附量的影響稱取10 mg GA-CMNs，加入4 mL質(zhì)量濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/mL 的 BSA 溶液中，pH值設(shè)置為5.0，吸附時(shí)間為100 min，測定并計(jì)算吸附量。

1.3.7 GA-CMNs的再生 取10 mg GA-CMNs將其飽和吸附BSA后，分離后用選取的NaCl溶液在室溫條件下于120 r/min振蕩30 min后，磁鐵吸附分離，取上清液在UV278 nm測定并用下式計(jì)算洗脫率：

洗脫率（%）=cV2/（c0-ce）V1×100%

式中c為洗脫液中 BSA的質(zhì)量濃度（mg/mL）；V2為洗脫液的體積 （mL）；c0為初始BSA質(zhì)量濃度（mg/mL）；ce為吸附后溶液中 BSA的質(zhì)量濃度（mg/mL）；V1表示加入的 BSA的體積（mL）。

2 結(jié)果與討論

2.1 GA-CMNs的表征

圖1解析結(jié)果表明，殼聚糖（a）中3 455 cm是O-H和N-H的伸縮振動(dòng)峰，2 923 cm-1和2 853 cm-1的強(qiáng)峰屬于CH伸縮聚合物骨架的振動(dòng)，而在約1 073 cm-1和1 487 cm-1分別是C-O和殼聚糖環(huán)貢獻(xiàn)的伸縮振動(dòng)峰。殼聚糖改性微球（b）中588 cm-1峰，屬于Fe-O伸縮振動(dòng)。a中的1 644 cm屬于伯胺（-NH2）的變形振動(dòng)，在b中消失，出現(xiàn)1 618 cm-1仲胺的振動(dòng)吸收峰；此外在b中可以觀察到在1 402 cm-1來自R-CH2-COOH的CH伸縮振動(dòng)和1 718 cm-1飽和C=O的伸展吸收峰，并且位于3 650～3 200 cm-1O-H伸縮的吸收峰變寬，進(jìn)一步說明分子中存在羧基。由此紅外光譜圖可以說明谷氨酸成功交聯(lián)到磁性殼聚糖微球上。

圖1 殼聚糖和谷氨酸改性殼聚糖微球的紅外光譜Fig.1 FT-IR spectrum of chitosan and GA-CMNs

由圖2（a）可見，在掃描電子顯微鏡下可見GACMNs為類球形結(jié)晶，表面較光滑且形狀規(guī)則，粒徑為 5～20 μm；由激光粒度儀測的數(shù)據(jù)圖 2（b）可見，顯示有40%的微球粒徑小于20 μm，已達(dá)到微米級(jí)。

圖2GA-CMNs的形貌圖(a)和GA-CMNS的粒度分布圖(b)Fig.2 MicroscopicmorphologyofGA-CMNsand particle size distribution of GA-CMNs

2.2 BSA溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

準(zhǔn)確稱取0.200 g BSA，用pH 5.0的緩沖溶液溶解，配制成2 mg/mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液，再稀釋成一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度，用紫外可見分光光度計(jì)掃描，得到最大吸收波長為 278 nm，與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在 0～2.0 mg/mL范圍內(nèi)其吸光度A與質(zhì)量濃度c線性關(guān)系良好，擬合方程為A=0.613 8c+0.012 1，R2=0.999 2。

2.3 溶液pH值對(duì)BSA吸附量的影響

由圖3可見，未改性微球?qū)SA吸附量隨著pH值的改變化不大，而GA-CMNs對(duì)BSA最大吸附量出現(xiàn)在pH 5.0，接近BSA等電點(diǎn)[20]。因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)時(shí)，BSA呈電中性，BSA分子間斥力最小[21]；pH在5.0以上，GA-CMNs上羧基以COO-形式存在，pH低于 5.0，GA-CMNs和牛血清蛋白的胺基為NH3+，不利于氫鍵的形成[22]。因此，在 pH 5.0 時(shí)，GACMNs對(duì)BSA的吸附量達(dá)到最大值。

圖3 pH對(duì)吸附效果的影響Fig.3 Influence of pH on adsorption of BSA

2.4 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)BSA吸附量的影響

由圖4可見，GA-CMNs對(duì)BSA的吸附量隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加逐漸減小。當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到0.5%，BSA的吸附量下降約20%；當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到1%，吸附量下降約50%，表明BSA吸附量受NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響顯著。可能由于NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，溶液離子氛圍增強(qiáng)使得蛋白質(zhì)分子間靜電斥力增大，導(dǎo)致遷移速度減慢；并且吸附劑結(jié)合空間位阻與靜電斥力的增加，影響B(tài)SA分子構(gòu)象，破壞了GA-CMNs與BSA分子間的靜電作用，僅靠范德華力與BSA分子結(jié)合，導(dǎo)致吸附效果明顯下降[22]。

用Lagergren一級(jí)吸附速率方程和二級(jí)吸附速率方程[23]進(jìn)行擬合分析，擬合所得方程分別為y=-0.033 5x+2.005 9和y=0.011x+0.065 7，決定系數(shù)（R2）分別為0.958 2和0.994 1說明準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型更能反映GA-CMNs對(duì)BSA的吸附過程。

圖4 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)吸附效果的影響Fig.4 Influence of ionic strength on the adsorption of BSA

2.5 吸附時(shí)間對(duì)BSA吸附量的影響

由圖5可見，在前30分鐘內(nèi)隨著時(shí)間的延長，GA-CMNs對(duì)BSA的吸附量顯著增大（p＜0.05）。而40 min之后吸附量無顯著變化（p＞0.05），表明在40 min左右達(dá)到吸附平衡。結(jié)果表明，GA-CMNs表面結(jié)合點(diǎn)在經(jīng)過一段時(shí)間吸附占用后，剩余吸附結(jié)合位點(diǎn)較難被利用，表明其對(duì)BSA的吸附可能是單層覆蓋。

圖5 吸附時(shí)間對(duì)BSA吸附量的影響Fig.5 Influence of adsorption time on the adsorption of BSA

2.6 不同BSA質(zhì)量濃度對(duì)吸附量的影響

由圖6可見，GA-CMNs對(duì)BSA的吸附量隨著BSA溶液質(zhì)量濃度的增大顯著增加（p＜0.05），最大平衡吸附量出現(xiàn)在BSA質(zhì)量濃度為1 mg/mL附近，再增大BSA的質(zhì)量濃度，吸附量變化不大，最大吸附量為83.5 mg/g。

用 Langmuir方程和Freudlich方程[24]進(jìn)行擬合分析，所得決定系數(shù)（R2）分別為0.997 7和0.975，結(jié)果表明單層吸附為主的Langmui模型擬合方程的決定系數(shù)比Freundlich模型擬合方程的決定系數(shù)高，表明GA-CMNs對(duì)BSA的吸附以單分子層為主。

圖6 BSA初始質(zhì)量濃度對(duì)吸附量的影響Fig.6 Influence of initial concentration of BSA on its adsorption

2.7 GA-CMNs的再生

當(dāng)溶液NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，GA-CMNs對(duì)BSA的吸附量下降了約80%，而繼續(xù)加大NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)，吸附量下降不明顯，故選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的NaCl溶液作為洗脫劑。經(jīng)過5次吸附-洗脫循環(huán)，洗脫率仍大于90%，重復(fù)吸附量基本不變，表明GA-CMNs具有很好的重復(fù)使用性。

3 結(jié)語

以廉價(jià)易得的試劑為原料[9-10]在溫和的條件[11-14]合成谷氨酸改性磁性殼聚糖微球。并以BSA為目標(biāo)蛋白質(zhì)，研究了GA-CMNs對(duì)BSA的吸附情況，考察pH值、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、時(shí)間、BSA初始質(zhì)量濃度等條件對(duì)其吸附效果的影響，并對(duì)GA-CMNs的再生進(jìn)行了研究。

紅外圖譜分析結(jié)果表明，谷氨酸成功地交聯(lián)在磁性殼聚糖微球的表面。掃描電子顯微鏡下觀察到GA-CMNs為表面較光滑、形狀規(guī)則的類球形結(jié)晶，粒徑為5～20 μm，由激光粒度儀檢測結(jié)果顯示，粒徑小于20 μm占總體積的40%左右。在25℃時(shí)GA-CMNs對(duì)BSA最佳吸附條件：pH值為5，BSA質(zhì)量濃度為1 mg/mL，飽和吸附時(shí)間為40 min，吸附量為83.5 mg/g左右。其對(duì)BSA吸附平衡過程符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程和Langmuir吸附等溫線模型。

用3%的NaCl溶液作為洗脫劑，洗脫率為97.2%，經(jīng)過5次吸附-洗脫循環(huán)，洗脫率均大于90%，重復(fù)吸附量基本不變，表明GA-CMN吸附洗脫性能良好。該方法制備過程簡單、成本低廉、洗脫率高，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，為進(jìn)一步研究動(dòng)物血液中血清蛋白回收等方面的應(yīng)用提供參考。

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