李明生 ， 靳冬武 ， 張 健 ， 馮玉萍 ，鄭 榮 ， 張 磊 ， 李 倬 ， 馬忠仁 ，3

（1.西北民族大學 生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州730030；2.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；3.甘肅省動物細胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030）

從豬、?；蜓蛞扰K中提取的蛋白質(zhì)分解酶胰蛋白酶[1]是絲氨酸蛋白酶家族中特有的成員，屬于肽鏈內(nèi)切酶，特異性的水解堿性的精氨酸和賴氨酸羧基所組成的肽鍵[2]。廣泛應用于動物細胞培養(yǎng)、食品、洗滌劑、皮革、醫(yī)藥等領(lǐng)域中[3-4]，尤其是在動物細胞培養(yǎng)領(lǐng)域中應用極為廣泛[5-6]。目前國內(nèi)外幾乎所有科研與生產(chǎn)用戶細胞培養(yǎng)用胰蛋白酶都依賴美國Gibco和Hyclone兩家公司，國內(nèi)生產(chǎn)幾乎為空白。這是因為在胰蛋白酶制備過程中酶原激活條件的重要性。這種酶在哺乳動物的胰腺中以無活性的胰蛋白酶原的形式合成和儲存，同時也包含有另一種相似的結(jié)構(gòu)和功能特性的絲氨酸蛋白酶糜蛋白酶[7]，在酶原激活過程中，胰蛋白酶和糜蛋白酶在一定的條件下相互轉(zhuǎn)化。而在體內(nèi)胰蛋白酶原是由胰臟中胰腺細胞合成并分泌到十二指腸，并在腸激酶的催化下將胰蛋白酶原激活為有活性的胰蛋白酶[8-9]，激活的胰蛋白酶能夠催化許多胰腺來源的無活性的酶原，例如胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、彈性蛋白酶原和羧肽酶，而蛋白酶活化受體直接或間接控制腸道消化效率[10]。因此，作者以豬胰臟為原料，酶活力為衡量指標，在單因素試驗基礎(chǔ)上通過正交試驗對胰蛋白酶原體外激活條件進行研究，采用離子交換層析對激活后的粗制胰蛋白酶進行純化，得到細胞培養(yǎng)用胰蛋白酶單品，最后探討該單品對BHK-21和Vero兩種貼壁依賴性細胞的消化效果，為細胞培養(yǎng)用胰蛋白酶的進一步研究和國產(chǎn)化奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬胰臟：由青海省樂都縣屠宰場提供；細胞培養(yǎng)用胰蛋白酶：購自美國Hyclone和Gibco公司；苯甲酰-L-精氨酸乙酯 （BAEE）：購自Sigma公司；DEAE Sepharose FF：購自美國GE公司；蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量預染marker：購自Bio-Rad公司；BHK-21細胞和Vero細胞：由甘肅省動物細胞工程技術(shù)研究中心提供；DMEM培養(yǎng)基：購自蘭州百靈生物技術(shù)有限公司；新生牛血清：購自蘭州民海生物工程有限公司；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

OA2000型實驗室數(shù)顯定時攪拌器：上海毆河機械設(shè)備有限公司；SG2型pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；DYY-12型電泳儀：北京市六一儀器廠；KjeltecTM 8200型凱氏定氮儀：丹麥Foss公司；LGJ--200F真空冷凍干燥機：北京松源興科技發(fā)展有限公司；Biomate 5型紫外分光光度計：美國Thermo公司；超濾儀：PALL公司；AKTA Purifier快速純化液相色譜系統(tǒng)：美國GE公司；CKX41型倒置生物顯微鏡：OLYMPUS。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝路線 新鮮胰臟預處理→提取→鹽析制備胰蛋白酶原→酶原的激活→超濾脫鹽→離子交換層析→冷凍干燥

1.3.2 單因素試驗 根據(jù)工藝路線，取胰臟2 kg，加入3倍體積pH 3.0的純化水攪拌提取24 h后，加入硫酸銨至0.75飽和度鹽析制備胰蛋白酶原。以激活激活劑濃度、激活時間、pH值、溫度4個因素進行單因素實驗，做平行實驗3次，確定影響胰蛋白酶活力的最佳單因素條件。

1）激活劑濃度對酶活力的影響：酶原的激活過程中，胰蛋白酶為誘導劑，控制體系的激活時間1.5 h、pH 8.0、溫度16℃，激活劑氯化鈣的終濃度分別設(shè)置為 0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mol/L。

2）激活時間對酶活力的影響：酶原的激活過程中，胰蛋白酶為誘導劑，控制體系的激活pH 8.0、溫度16℃，激活劑氯化鈣的終濃度0.2 mol/L。激活時間分別設(shè)置為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。

3）激活pH對酶活力的影響：酶原的激活過程中，胰蛋白酶為誘導劑，控制體系的激活時間1.5 h、溫度16℃，激活劑氯化鈣的終濃度0.2 mol/L，激活pH 值分別設(shè)置為 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。

4）激活溫度對酶活力的影響：酶原的激活過程中，胰蛋白酶為誘導劑，控制體系的激活時間1.5 h、pH 8.0，激活劑氯化鈣的終濃度為0.2 mol/L，激活溫度分別設(shè)置為 4、8、12、16、20 ℃。

1.3.3 正交試驗的設(shè)計 選擇激活劑的濃度、激活時間、pH值和溫度4個因素，根據(jù)單因素試驗得出的結(jié)果，選擇合適的水平采用L9（34）正交試驗確定胰酶提取的最佳工藝參數(shù)，正交試驗L9（34）因素水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗L9（34）因素水平Table 1 Factors and levels for L9（34） orthogonal test

1.3.4 胰蛋白酶的純化 采用AKTA層析進行純化，具體洗脫條件為：DEAE Sepharose FF為介質(zhì)的層析柱；A 液：10 mmol/L pH 9.0的 Tris-HCl；B 液：10 mmol/L pH 9.0的 Tris-HCl和 0.2 mol/L NaCl組成；上樣液：蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在20～30 mg/mL；流速：1 mL/min。

1.3.5 胰蛋白酶活力和總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的檢測胰蛋白酶活力按照中華人民共和國藥典2010版二部胰蛋白酶效價測定法進行檢測；蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度按照中華人民共和國藥典2010版二部附錄ⅦM第一法凱氏定氮法檢測[1]。

1.3.6 SDS-PAGE分析 采用SDS-PAGE對胰蛋白酶純化效果進行鑒定，電泳條件：5 g/dL pH 6.8的濃縮膠，12 g/dL pH 8.8的分離膠；樣品中加入等量的 2×SDS上樣緩沖液，95 ℃變性 5 min，15 μL 上樣。80 V電泳2 h后將膠用考馬斯亮藍染色。

1.3.7 胰蛋白酶在細胞培養(yǎng)中的應用 將胰蛋白酶配制成0.25%活力為1∶250的胰蛋白酶液，選擇BHK-21和Vero兩種傳代細胞進行消化試驗，連續(xù)消化培養(yǎng)10代，記錄消化時間并進行細胞計數(shù)，顯微鏡觀察細胞形態(tài)并拍照。同時用Gibco和Hyclone的胰蛋白酶作為對照組。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理 每組實驗平行3次，實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，最后結(jié)果用均數(shù)±標準差（X±S）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 激活劑濃度對酶活力的影響 Ca2+是細胞內(nèi)調(diào)節(jié)各種細胞活動的關(guān)鍵離子，諸如從胰腺腺泡細胞中酶原的分泌[11-12]。胰腺分泌的消化酶是由Ca2+濃度、神經(jīng)遞質(zhì)和激素對胰腺腺泡細胞的受體結(jié)合調(diào)控來實現(xiàn)[13]。作者以CaCl2為激活劑，對Ca2+的濃度進行研究。由圖1可以看出，隨著激活劑濃度的提高，酶活力呈先升高后降低的趨勢。在激活劑濃度為0.1～0.15 mol/L范圍內(nèi)，胰蛋白酶活力急劇增加（p＜0.05），在激活劑濃度為 0.2 mol/L 時，酶活力達到最大值，為1 896.69±6.79，當激活劑濃度提高至0.25 mol/L時，酶活力與最高值沒有明顯的差異（p＞0.05），隨后急劇下降（p＜0.05）。 因此，激活劑的濃度以0.2 mol/L為最佳。

圖1 激活劑濃度對酶活力的影響Fig.1 Effect of activation concentration on trypsin activity

2.1.2 激活時間對酶活力的影響 選擇最佳激活時間，既能使胰蛋白酶充分激活，又能避免活化后的胰蛋白酶自身降解，是把握激活時間的關(guān)鍵[14]。作者對胰蛋白酶的激活時間進行了研究，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，隨著激活時間的增加，酶活力呈先升高后降低的趨勢，不同時間的酶活力差異極其顯著（p＞0.01）。 在 0.5～1.5 h 范圍內(nèi)，胰蛋白酶活力急劇增加（p＜0.01），在1.5 h時酶活力達到最高值，為2 522.77±219.55，隨后隨著時間的延長酶活力急劇下降（p＜0.01），說明激活時間對胰蛋白活力尤為重要。因此激活時間1.5 h為最佳。

圖2 激活時間對酶活力的影響Fig.2 Effect of activation time on trypsin activity

2.1.3 激活pH對酶活力的 由圖3可以看出，隨著激活pH的增加酶活力呈先升高后降低的趨勢。在7.0～8.0 h范圍內(nèi)，胰蛋白酶活力差異明顯 （p＜0.01），在pH 8.0時酶活力達到最高值，為2 660.10±49.94。隨后隨著pH的變化，酶活力逐漸下降（p＞0.05），因此激活pH 8.0為最佳。Khandagale AS等[15]人從印度馬鮫魚中分離純化了胰蛋白酶，并對胰蛋白酶的特性進行了研究。Senphan T等[16]人從太平洋白蝦的肝胰腺中分離純化了胰蛋白酶，Liu CH等[17]人從斜帶石斑魚中分離純化了胰蛋白酶。其激活的pH為均為8.0。這與本研究的激活pH相一致。

圖3 激活pH對酶活力的影響Fig.3 Effect of activation pH on trypsin activity

2.1.4 激活溫度對酶活力的影響 由圖4可以看出，隨著激活溫度的增加，酶活力呈先升高后降低的趨勢。不同溫度下酶活力差異極為顯著（p＜0.01）。在4～16℃范圍內(nèi)，胰蛋白酶活力差異明顯 （p＜0.01），16℃時酶活力達到最高值，為 2 845.21±49.45，當激活溫度提高至20℃時，酶活力明顯下降（p＜0.05），這可能是因為在胰蛋白酶提取液中含有大量的糜蛋白酶，在激活過程中胰蛋白酶與糜蛋白酶相互轉(zhuǎn)化，而激活溫度過高，胰蛋白酶急劇轉(zhuǎn)化為糜蛋白酶。因此，激活溫度以16℃為最佳。

圖4 激活溫度對酶活力的影響Fig.4 Effect of activation temperature on trypsin activity

2.2 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定影響酶活力的4個因素（激活劑濃度、激活時間、pH值、溫度）的主要水平。通過L9（34）正交試驗確定胰蛋白酶原激活的最佳條件，其結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

由表2的K值可得胰蛋白酶激活的最優(yōu)組合為A2B2C3D2，即激活劑的濃度為0.2 mol/L，激活時間為1.5 h，激活pH為8.5，激活溫度為16℃，在此條件下通過驗證可得酶活力達到2 953.68 U/mg，優(yōu)于表2中實驗號為2的結(jié)果（2 892.84 U/mg），因此確定最優(yōu)激活組合為A2B2C3D2。由極差R可以看出，影響胰蛋白酶活力的四因素的主次順序為D（激活溫度）＞B （激活時間）＞C （激活 pH）＞A （激活劑濃度）。

2.3 胰蛋白酶的純化

激活后粗品胰蛋白酶液經(jīng)超濾濃縮至蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度在20～30 mg/mL范圍內(nèi)，電導500 us/cm以下，調(diào)pH至9.0后采用0.45 μm膜過濾后直接上樣于已平衡好的DEAE Sepharose FF層析柱，然后采用100%10 mmol/L pH 9.0的Tris-HCl洗脫并收集洗脫峰，超濾濃縮后凍干，純化過程的參數(shù)詳見表3。可以看出，在提取過程中胰蛋白酶經(jīng)純化后其總蛋白質(zhì)質(zhì)量為137.4 g，回收率為36.52%；酶活力為3 980 U/mg，純化倍數(shù)達到2.26。

表3 胰蛋白酶分離純化過程參數(shù)Table 3 Summary of purification process for trypsin

李明生等[6]采用了CM-Sepharose-FF層析純化了胰蛋白酶，我們采用DEAE Sepharose FF層析純化進行分離。從圖5可以看出，圖中總共有4條峰。經(jīng)SDS-PAGE進行純度檢測，圖中泳帶M為Marker，0為激活后未純化的粗品胰蛋白酶，1為層析圖譜中的Peak 1，H為Hyclone的胰蛋白酶，經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)峰1為胰蛋白酶，相對分子質(zhì)量在23 000左右，其純度高于Hyclone胰蛋白酶。峰2、3為其他雜蛋白質(zhì)，峰4為經(jīng)100%B液洗脫后所得峰，經(jīng)酶活力檢測發(fā)現(xiàn)該酶為糜蛋白酶（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖5 胰蛋白酶離子交換層析圖譜和電泳圖譜Fig.5 Elution curve of ion exchange chromatography and electrophoretic pattern on trypsin

2.4 胰蛋白酶在BHK-21和Vero細胞中的應用

采用已純化的自制胰蛋白酶消化BHK-21和Vero兩種貼壁細胞，同時以Hyclone和Gibco兩種胰蛋白酶為對照。連續(xù)消化傳代細胞10代次，從圖6可以看出，BHK-21和Vero細胞生長良好，形態(tài)正常，自制胰蛋白酶與Hyclone和Gibco胰蛋白酶沒有明顯的差異。

圖6 BHK-21和Vero細胞形態(tài)圖Fig.6 BHK-21 and Vero cells morphology

BHK-21和Vero細胞按1.5×106/瓶濃度接種，每代細胞采用自制胰蛋白酶消化傳代，并記錄消化時間和細胞計數(shù)，同時以Hyclone和Gibco兩種胰蛋白酶為對照，連續(xù)消化傳代10代，結(jié)果見圖7。從圖7可以看出，用自制、Hyclone和Gibco胰蛋白酶消化BHK-21細胞，消化時間分別為3.257、3.076、3.197 min，差異不顯著（p＞0.05），細胞濃度分別達到7.61×106、7.66×106、7.49×106個/瓶，差異不顯著（p＞0.05）；用自制、Hyclone和Gibco胰蛋白酶消化Vero細胞，消化時間分別為 3.397、3.261、3.291 min，差異不顯著（p＞0.05），細胞濃度分別達到 6.72×106、6.65×106、7.11×106個/瓶，差異不顯著（p＞0.05）。 說明自制胰蛋白酶對BHK-21和Vero細胞沒有顯著的影響。

圖7 BHK-21和Vero細胞細胞生長密度和消化時間Fig.7 Cell proliferation concentration and digestion time for BHK-21 and Vero cells

3 結(jié)語

胰蛋白酶原的最佳激活條件為激活劑的濃度0.2 mol/L，pH 8.5，溫度 16 ℃，激活時間 1.5 h，在該條件下激活后胰蛋白酶的活力達到2 954 U/mg。激活后粗胰蛋白酶經(jīng)DEAE Sepharose FF純化后其酶活力為3 980 U/mg，酶活力的純化倍數(shù)達到2.26。

自制胰蛋白酶對BHK-21和Vero兩種細胞沒有明顯的影響，其細胞形態(tài)、細胞生長濃度和消化時間與Hyclone和Gibco胰蛋白酶沒有明顯的差異，這為細胞培養(yǎng)用胰蛋白酶的進一步研究和國產(chǎn)化奠定理論基礎(chǔ)。

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