張龍，張保榮

(1.濰坊醫(yī)學院口腔醫(yī)學院，山東濰坊261053；2.航空總醫(yī)院口腔診療中心，北京100002)

牙周炎是口腔常見疾病之一，在普通人群中具有較高的發(fā)病率。根據(jù)不同流行病學調(diào)查顯示，在普通人群中發(fā)病率為80%～90%[1-2]。而慢性牙周炎因其牙槽骨的嚴重吸收，造成牙齒動度的增加，已成為人類牙齒缺失的首要原因。因此對于慢性牙周炎病因的關注，一直以來是牙周病學的研究熱點。傳統(tǒng)意義上牙周炎的發(fā)生、發(fā)展與多種因素相關，比如菌斑、抽煙、遺傳、口腔衛(wèi)生習慣等[3-5]，而牙菌斑作為牙周炎的始動因子，在牙周病的發(fā)生、發(fā)展過程中，發(fā)揮了不可替代的重要作用。自一百多年以來，隨著各種新的微生物培養(yǎng)技術和生化技術的進步，人們對牙菌斑在牙周炎發(fā)病中的作用，有了不斷深入的認識，但是采用的傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)及動物實驗，均無法證明其中的一種或多種細菌為牙周炎的明確致病菌。傳統(tǒng)方法對細菌及其代謝產(chǎn)物，以及其對人體代謝的影響均基于體外動物實驗與相關的生理生化實驗[6-7]。而對處于牙周炎疾病過程的菌群變化及其基因表達及代謝產(chǎn)物的分析，受到實驗條件以及技術手段限制成為牙周炎病因研究的難點。因此，對于牙菌斑及其細菌及代謝產(chǎn)物在牙周炎發(fā)病過程中的處于疾病狀態(tài)時變化，是探究牙周炎病因的關鍵。本實驗采用基于二代測序技術的對慢性牙周炎患者齦下菌斑的轉錄組進行分析，首次將齦下菌斑微環(huán)境中的整個轉錄組作為研究對象，從轉錄組學的高度對慢性牙周炎的病因進行了探討，為新一代測序技術在慢性牙周炎病因學的研究應用提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 牙菌斑及炎性組織的采集選取航空總醫(yī)院口腔診療中心2015年3月至2016年12月收集的20例慢性牙周炎患者為觀察對象，采集齦下菌斑樣本采樣部位，對所有患者進行牙周炎的程度進行評估：探診深度、牙周袋深度、附著喪失程度和探針出血情況[8]。納入標準：3個月內(nèi)無牙周病治療史，無抗生素藥物服用或其他抗炎藥物服用，無吸煙史，無全身性疾病(糖尿病等)，婦女無妊娠，全口牙存留不少于16顆，每個區(qū)都有存留牙且至少有一個位點的牙周袋深度大于4 mm。所有患者知情同意。采樣前囑患者漱口，用棉簽去掉齦上菌斑干擾。每個牙齒均取6個位點[9]。每個樣品均溶于1.5 mL HANK液，立即進行-80℃冷凍。

1.2 主要儀器及試劑RNeasy mini kit RNA提取試劑盒(QIAGEN公司)、Illumina HiSeqTM2000(深圳華大)Agilent 2100(安捷倫科技公司上海)Hanks液(北京諾博萊德)干冰若干、冰盒、高速離心機(Thermo Scientific公司，法國)。

1.3 轉錄組測序前準備

1.3.1 總RNA的提取采用QIAGEN公司的RNeasyMiniKitRNA提取試劑盒。配置所需的了裂解體系Buffer-RLT 500 μL，5 μL B-球基乙醇。取100 μL預處理樣品混勻。樣品預處理：4℃下解凍，3 min 12 000 r/min離心。取上清液。對于炎性組織則采用液氮研磨后，取上清液。加1:1 70%乙醇洗脫裂解液。12000 r/min 15 s再加入700 μL的Buffer-RW1洗脫。700 μL Buffer-RWE洗脫乙醇(兩遍):600 μL RNA-free水洗脫后靜置2 min，室溫下12 000 r/min、離心2 min。

1.3.2 提取后的RNA濃度將提取后的RNA送交華大基因公司進行上機前提取RNA質(zhì)量檢測評估。提取RNA總量為0.2032～1.3759 μg，RIN值為2.2～2.9，總體符合RNA建庫要求[10]。

1.4 上機測序及建庫采用深圳華大基因的Illumina HiSeqTM2000進行測序建庫[11]。

1.5 測序后數(shù)據(jù)處理去除含N的堿基數(shù)目總和達到一定比例的短序列(默認10%，設置為10%)；去除拼接接頭污染(默認接頭序列與所得序列有15 bp的重疊(設置為15 bp)；去除連續(xù)低質(zhì)量值堿基數(shù)達到一定長度的序列(默認是序列中小于Q20的堿基數(shù)目小于20%，設置為84，20%)：宿主相關RNA的去除，將所得原始數(shù)據(jù)用BLAST軟件比對到NCBI的人基因組Nonredundant Database(NR)蛋白數(shù)據(jù)庫[12]去除人相關RNA基因(一致性為90%的前提條件下，與宿主比對上的序列被認為是宿主序列。具體參數(shù)設置為：r:1/l:35/M:4/p:2)。所得總的測序可用數(shù)據(jù)為569782640～8751961080 bp。符合后期分析所需數(shù)據(jù)要求[13]。

1.6 序列的組裝對所得短序列，采用Trinty組裝，所得Trinty組裝結果我們稱之基因序列。組裝得到的基因序列，首先使用Tgicl將其去冗余和進一步拼接，然后再對這些序列進行同源轉錄本聚類，得到最終的非冗余基因序列(Unigene)。可以看出在不同樣品中300 bp長度的Unigene數(shù)量最多分布范圍為2 018～12 906 bp。不同樣品組裝得到的Unigene聚類軟件做進一步序列拼接，去冗余處理以及同源轉錄本聚類，得到盡可能長的合并非冗余基因序列(merge-Unigene)。在進行同源轉錄本聚類以后，merge-Unigene分為兩部分，一部分是簇merge-Unigene(clusters)，同一個clusters里面有若干條相似度高(大于70%)的merge-Unigene(以CL開頭，CL后面接基因家族的編號)；其余的是單獨merge-Unigene(以Unigene開頭)，代表單獨的Unigene。

1.7 基因功能注釋基因功能注釋主要基于氨基酸序列比對。將基因的氨基酸序列與各數(shù)據(jù)庫進行比對，得到對應的功能注釋信息。由于每一條序列比對結果超過一條，為保證其生物意義，保留一條最優(yōu)比對結果作為該基因的注釋。所有的注釋均使用BLAST(version 2.2.21)軟件結合各個數(shù)據(jù)庫的特點完成。主要采用數(shù)據(jù)庫有：Nonredundant Database(NR):Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)[14-16]；Version：59 Carbohydrate-Active Enzymes Database(CAZy)[17]；Cluster of Orthologous Groups of proteins(COG)。

2 結果

2.1 慢性牙周炎患者齦下菌斑細菌種類和數(shù)量主要細菌為7種：文氏密螺旋體占12.4%、齒垢螺旋體占3.6%、牙齦二氧化碳噬纖維菌占2.8%、牙髓卟啉單胞菌占2.6%、普雷沃菌占2.6%、梅毒螺旋體占2.1%、中間普氏菌占2.0%，而螺旋體占28.1%。

2.2 基于COG數(shù)據(jù)庫的功能注釋對比COG中二十五大類功能，與之有比對功能的序列涵蓋了其中24種。其中含量最為豐富的是與細菌翻譯相關的過程，有超過5 000條merge-unigene，見圖1。

圖1 COG數(shù)據(jù)庫merge-unigene功能分析

2.3 基于KEGG數(shù)據(jù)庫的功能注釋將merge-Unigene BLAST到KEGG數(shù)據(jù)庫，得到與KEGG數(shù)據(jù)庫中代謝通路相關的merge-Unigene分布情況。在所有樣品中主要與之相關的代謝通路為氨基酸的代謝轉運、代謝相關。其中數(shù)量最多的基因數(shù)量集中于精氨酸、脯氨酸代謝通路上，有1 149條merge-Unigene與之相關，見圖2。

圖2 KEGG數(shù)據(jù)庫與氨基酸代謝通路有關的merge-unigene功能

2.4 基于糖類活性酶(carbohydrate-Active Enzymes Database，CAZy)的功能注釋merge-Unigene最多的兩類碳水化合物酶：碳水化合物結合結構域為43、糖苷水解酶為34、糖苷轉移酶為17、碳水化合物酯酶為4，但是與多糖裂解酶相關的merge-unigene數(shù)量為0。

3 討論

慢性牙周炎患者齦下菌斑轉錄組分析可以看出，在慢性牙周炎患者的齦下菌斑中，傳統(tǒng)意義上致病力較弱的螺旋體其基因表達最多，而通常意義上與牙周炎關系密切的牙齦卟啉單胞菌基因表達并不明顯。提示了傳統(tǒng)方法對于慢性牙周炎的研究有其自身的局限性和不足之處，而通常意義上在研究細菌基因時多關注在DNA層面[18]，忽視了RNA水平上基因表達差異的變化。本實驗首次抽取齦下菌斑RNA進行了轉錄組測序，而這個可能為我們解釋微量或者低致病性細菌對牙周炎的發(fā)生提出新的認識。

本實驗的研究結果表明：(1)慢性牙周炎患者齦下菌斑中螺旋體的RNA含量最高，表明螺旋體在牙周炎的疾病過程中基因表達會較其他細菌較多。這與我們通常意義上的牙周炎致病菌認識是不同的[19]。(2)通過轉錄組分析數(shù)據(jù)，與不同的蛋白庫比對，筆者在整個轉錄組高度上發(fā)現(xiàn)了牙菌斑作為一個整體，在牙周炎的發(fā)病過程中與其細菌基本生理活動以及牙菌斑生理代謝過程及通路相關基因的表達情況，并且通過與碳水化合物活性酶相關基因比對，發(fā)現(xiàn)齦下菌斑中細菌整體不能利用多糖，但可以通過糖苷水解酶利用單糖及其他雙糖等碳水化合物提供強有力的證據(jù)[20]。證明單純的食物殘渣進入齦下菌斑，并不能對牙周炎產(chǎn)生致病性。

綜上所述，基于高通量的轉錄組測序分析能為筆者對齦下菌斑致病性的研究提供新思路，并且補充了許多傳統(tǒng)實驗局限帶來的對牙周炎認識的不足之處。提示在牙周炎的發(fā)生、發(fā)展過程中，螺旋體的基因高表達為牙周炎的發(fā)生發(fā)展起了推動作用。

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