王佶 馬學(xué)軍

102206 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所

早在20世紀90年代，人們就提出可以使用納米孔傳感器對DNA進行序列分析。自1996年P(guān)NAS發(fā)表的第1篇納米孔測序的報道開始，針對這種技術(shù)的研發(fā)工作就正式拉開帷幕。Oxford Nanopore Technologies (ONT) 公司開發(fā)出了商業(yè)化的納米孔測序儀—MinION。ONT于2014年春季推出了MinION Access計劃，旨在邀請全球各國學(xué)者共同體驗MinION的使用，并協(xié)助完善其在各個領(lǐng)域的應(yīng)用。也正是在那時起，有關(guān)納米孔測序的評估報告和學(xué)術(shù)研究開始不斷涌現(xiàn)在多個研究領(lǐng)域。

1 納米孔測序的原理

每1張與MinION配套使用的Flow Cell上都有512個傳感器，每個傳感器連接4個生物納米孔，這些納米孔嵌入在人造膜中。測序文庫中的DNA末端有特殊的“Y”型接頭并連接一個馬達蛋白。測序開始后，MinION對膜兩側(cè)施加電壓，馬達蛋白打開雙鏈DNA并引導(dǎo)其中一條單鏈穿過納米孔?？字械膲A基會造成穿孔電流的中斷，這種電流變化反映了DNA的序列信息。MinION每秒鐘可對穿孔電流測量上千次，并通過名為MinKNOW的軟件將數(shù)據(jù)寫入本地硬盤。MinION每產(chǎn)生一條read就會生成一個FAST5文件，用戶可利用不同的生物信息學(xué)分析流程從中提取所需要的信息；也可以通過選擇恰當(dāng)?shù)倪\行腳本來同時進行測序和堿基識別，這將產(chǎn)生FAST5和FASTQ兩種格式的數(shù)據(jù)集[1-3]。

2 納米孔測序的特點

相對于二代測序技術(shù)平臺(Second-Generation Sequencing，SGS)，MinION的主要特點是讀長長、簡單快速、便攜性高且可以實時分析測序數(shù)據(jù)。這些特點將進一步推動和改善現(xiàn)有的病毒基因測序工作，各國的研究人員也已經(jīng)逐步將MinION應(yīng)用于病毒檢測、病毒全基因組測序、新病毒的發(fā)現(xiàn)、病毒準種與進化研究等領(lǐng)域。

2.1Reads長度長MinION產(chǎn)生的reads可長達882 Kb[4]，這足以覆蓋絕大多數(shù)病毒的全基因組。較長的reads有助于減少數(shù)據(jù)組裝的難度，并且能更清楚地辨別基因組中的重復(fù)序列與復(fù)雜結(jié)構(gòu)。Elizabeth等[5]利用MinION分析缺陷型和野生型獸棚病毒(Flock House virus)基因組的全長，結(jié)合ClickSeq技術(shù)確定了RNA重組事件之間的相關(guān)性，并對病毒傳代過程中不同的缺陷干擾RNA的相對豐度做出量化。對于結(jié)構(gòu)復(fù)雜且GC含量高的病毒基因組，僅利用SGS數(shù)據(jù)難以測得全長。通過混合組裝Roche 454和MinION的reads，研究者成功測得了長達152 kb的人類皰疹病毒Ⅰ型的基因組[6]，應(yīng)用該方案對7個樣本的數(shù)據(jù)進行組裝，觀察到7個樣本的N(G)50和N(G)75全部有所增加，其中6個樣本的重疊群數(shù)量減少。該方法還從一例樣本中檢測到獨有序列和重復(fù)序列區(qū)之間的重排，這一現(xiàn)象僅用SGS的短reads是無法發(fā)現(xiàn)的。

2.2便攜性高2014—2016年西非地區(qū)的埃博拉病毒病爆發(fā)造成了上萬人死亡，對全世界的公共衛(wèi)生造成了巨大的威脅。埃博拉病毒能在曠日持久的疫情中快速分化出不同亞系，在疫情爆發(fā)期間實時監(jiān)測病毒基因組的變化能夠為指導(dǎo)防控措施提供高質(zhì)量的參考信息，但前提是測序數(shù)據(jù)的產(chǎn)出要足夠及時[7]。中國公共衛(wèi)生團隊于塞拉利昂建立了SGS測序平臺，在完成疫情防控任務(wù)的同時對埃博拉病毒進行基因組監(jiān)測。但SGS平臺較為笨重，需要占用3～4間病房來分區(qū)部署全部設(shè)備，人力的需求和運輸?shù)碾y度也客觀存在。相比之下，Joshua等[8]基于MinION設(shè)計了一整套測序系統(tǒng)，所有設(shè)備都能打包到常規(guī)大小的航空行李中送往幾內(nèi)亞疫區(qū)，一張普通的實驗臺即可擺放3臺手掌大小的MinION測序儀和配套筆記本電腦，MinION同樣在利比里亞被用于埃博拉病毒的測序工作[9]。有時出于政治、倫理或者交通方面的原因，樣本無法被運送到條件完備的測序?qū)嶒炇襕2]，或者身處諸如坦桑尼亞熱帶雨林[10]、南極麥克默多干谷[11]和國際空間站[12]這種極端苛刻的工作條件下，MinION具有非常顯著的優(yōu)勢。

2.3簡單快速MinION的安裝就像給電腦外接一塊移動硬盤一樣方便，且測序速度極快。MinION開始工作后短時間內(nèi)就有大量的文庫DNA鏈穿過納米孔并造成電流變化，電信號以極快的速度輸入電腦。當(dāng)電腦的硬件配置較低時，堿基識別的速度甚至?xí)s不上測序速度，以至于MinION停止運行后電腦還要繼續(xù)處理原始數(shù)據(jù)。相對于Sanger法或SGS平臺，MinION單條read的準確性較低[13]，但是較快的測序速度能夠在某種程度上彌補這一不足。本研究團隊基于MinION建立了針對腸道病毒的納米孔測序方法，利用重疊的擴增子進行全基因組測序，在6 h內(nèi)平均每分鐘可以獲得約3 000條reads[14]。在針對腸道病毒71型毒株的單樣本檢測中，MinION測序開始后的第一分鐘內(nèi)所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)即可達到與Sanger法結(jié)果98.5%的一致性，在14 min內(nèi)可達到99%的一致性。在這樣短的時間內(nèi)，通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定同等大小(2～3.8 Kb)的PCR產(chǎn)物都不可能實現(xiàn)，MinION使得高通量測序變得像實驗室里最簡單的基礎(chǔ)實驗一樣便捷。

3 病毒基因組測序策略中的應(yīng)用優(yōu)勢

目前病毒基因組測序策略主要有3種：PCR擴增子測序，宏基因組測序和雜交靶向富集測序。PCR擴增子測序適用于短基因組病毒并且引物結(jié)合位點多樣性較低；宏基因組測序最適合對未知病毒進行診斷性測序；靶向富集則對所有大小的病原體均適用，且單管化的樣本制備過程使其具有自動化的潛力[15]。

3.1PCR擴增子測序基于特異性引物的PCR是最常見的模板富集方法，對于基因組較小的病毒而言，僅僅幾次PCR擴增就可組裝出整個基因組，比如流感病毒。早年間基于Sanger法和SGS平臺的全基因組測序?qū)α鞲胁《镜难芯科鸬搅藰O大的推動作用[16-17]，類似的方案在MinION上也得以實現(xiàn)[18]。研究發(fā)現(xiàn)，與Sanger法和Illumina MiSeq方法相比，由MinION生成的基因組間核苷酸差異是最小的；MinION運行4 h所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量，足以生成可靠的基因組序列。在流感大流行期間，研究者可以在現(xiàn)場分析樣品，并對亞型、重配、致病性和抗病毒藥物敏感性等特點做出初步判斷。

擴增子測序的特異性和靈敏度都很高，適用于區(qū)分同源性較高的毒株或低濃度臨床樣本。基于MinION的擴增子測序能準確地對同源性超過98%的痘病毒(牛痘、改良型痘苗病毒安卡拉株、痘苗病毒李斯特株)實現(xiàn)毒株水平的鑒定[13]。為了降低高錯誤率所帶來的影響，研究者認為reads與正確物種(株)的比對速率必須遠高于會導(dǎo)致假陽性的錯誤比對的速率。即使利用Barcode在一次運行中對10株柯薩奇病毒A16型全基因組同時測序[14]，第1 min即可達到平均96.11% (94.12%～97.33%) 的準確性，在17 min內(nèi)可達到99%的準確性，足以實現(xiàn)不同毒株的區(qū)分與鑒定。多重PCR技術(shù)與MinION的結(jié)合使人們可以從<50個拷貝/反應(yīng)的樣品中靶向富集病毒基因組，繼而在1～2 d內(nèi)從臨床樣本中獲得病毒共有序列[19]。這套方案包括在線引物設(shè)計工具、新型多重PCR富集方法、文庫制備方法以及用于生成共有序列的生物信息學(xué)流程。已經(jīng)被幾個研究Zika病毒進化的團隊成功應(yīng)用，并且用于研究Zika病毒在美洲的傳播特征[20-21]，也可用于對其他RNA或DNA病毒基因組的測序。

然而擴增子測序的缺陷也很明顯，引物設(shè)計需要對病毒基因組有先驗知識，所以該方法對新病毒的檢測能力十分有限。即使是針對已知病毒，PCR條件優(yōu)化對于擴增子測序的影響非常大，引物結(jié)合位點高變，基因組多樣性以及復(fù)雜的基因組結(jié)構(gòu)都會影響PCR的成功率和擴增效率。如果待測病毒的基因組很大(如痘病毒和冠狀病毒)，擴增子測序很耗費模板核酸，而且工作量和污染風(fēng)險都會增加。

3.2宏基因組測序宏基因組學(xué)方法已被廣泛用于病原體的發(fā)現(xiàn)和對環(huán)境以及臨床樣本中微生物多樣性的特性描述。宏基因組學(xué)從樣品中提取包括宿主、細菌、病毒、真菌和其他病原體在內(nèi)的總DNA和/或RNA，構(gòu)建測序文庫然后由鳥槍測序法或RNA測序法(RNA-seq)對其測序。該方法無需設(shè)計引物或探針，能迅速應(yīng)對不明原因感染的病例或作為發(fā)現(xiàn)新病毒的策略。利用MinION對委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒實施宏基因組測序僅用3 h即可實現(xiàn)毒株水平的鑒定，同樣的方法也能快速檢測出埃博拉病毒，但這兩次測序所使用的毒株都預(yù)先經(jīng)過了培養(yǎng)[22]，不能充分證明MinION適用于臨床上不明原因感染的診斷。Greaninger 等[23]直接對臨床血液樣本實施宏基因組測序，從樣本處理到結(jié)果產(chǎn)出所需周轉(zhuǎn)時間不超過6 h。但值得注意的是，該研究中所檢測的基孔肯雅病毒、埃博拉病毒和丙型肝炎病毒的滴度高達每毫升105～108拷貝，這表明MinION對低濃度臨床樣本的宏基因組測序性能仍有待評估。除了臨床樣本或者病毒培養(yǎng)物，MinION也可對蚊蟲體內(nèi)的病毒進行宏基因組測序[24]。該次測序共產(chǎn)出82 259條reads, 其中目的病原體羅斯河病毒的reads有229條，占總數(shù)據(jù)量0.28%。在這0.28%的數(shù)據(jù)中，12%產(chǎn)生于前10 min，32.3%產(chǎn)生于前1 h，87.3%產(chǎn)生于前10 h。這表明通過實時數(shù)據(jù)分析，可以在極短的時間內(nèi)獲得初步的病毒檢測結(jié)果。

相對于擴增子測序，樣本中的病毒載量對宏基因組測序中的病毒基因組覆蓋度有很大影響。由于未經(jīng)過富集，高比例的非目的reads會降低對靶向病原體的檢測靈敏度，并且會增加生物信息學(xué)分析的難度[15]。除了技術(shù)上的不足，宏基因組測序會帶來一系列倫理問題[25]。對臨床樣本直接進行測序可能會有意外的發(fā)現(xiàn)，即使這些結(jié)果與科研目的無關(guān)，對于患者而言可能非常重要。比如檢測到目的病原體的同時發(fā)現(xiàn)了HIV感染，需要謹慎地考慮如何復(fù)核結(jié)果以及是否告知患者及其家屬。另外，宏基因組數(shù)據(jù)經(jīng)常含有大量的宿主基因組序列，將其發(fā)布在公開的數(shù)據(jù)庫中涉及到患者的隱私問題，這需要倫理道德委員會制定科學(xué)合理的指導(dǎo)方針[26]。

3.3雜交靶向富集測序在測序之前通過DNA雜交可以富集到復(fù)雜樣本中的目標DNA分子或減少非目標DNA分子，比宏基因組測序提高了特異性，較擴增子測序減少了PCR所引入的突變(無需擴增或少量擴增)，從而更準確地反映病毒基因組的體內(nèi)突變頻率。先前針對高通量測序平臺的富集方案僅能捕獲約200～300 nt的短片段，可能會丟失重要的結(jié)構(gòu)信息，如病毒或細菌中常見的重組或易位。Eckert等[27]改進了已有的富集方法，選擇性地富集特定細菌和病毒的DNA/cDNA大片段用于MinION測序。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，由于培養(yǎng)物的基因組背景太高，未經(jīng)富集的病毒樣本中沒有檢測到與相應(yīng)病毒匹配的reads。相比之下，富集過的流感病毒與人巨細胞病毒樣本分別有57%和99%的高質(zhì)量的匹配reads。

靶向富集法需要設(shè)計探針，它不同于PCR擴增法只需知道靶向區(qū)域兩側(cè)的序列，而需對該區(qū)域內(nèi)部的序列也有所了解，需要較強的專業(yè)技術(shù)背景。雖然利用探針之間的重疊序列可能會提高捕獲目的片段的概率[28]，靶向富集法在檢測新病毒方面仍存在諸多挑戰(zhàn)，而針對病毒組的捕獲測序法[29]不失為一種合理的設(shè)計思路。探針的合成與修飾比較昂貴，而且后續(xù)的雜交時間長達16 h[27]。綜合考慮時間與經(jīng)濟成本，在達到同樣靈敏度和覆蓋度的情況下，擴增子測序與靶向富集測序哪一種更適用于對已知病毒的研究需要進一步探索。

4 思考與展望

從單分子測序的角度，MinION與Pacbio一樣屬于第三代測序(Third-Generation Sequencing，TGS)平臺。但是相比于以往的測序技術(shù)，納米孔測序的技術(shù)原理是具有顛覆性的，有些學(xué)者將其定描述為第四代測序技術(shù)(Fourth-Generation Sequencing，F(xiàn)GS)[1,30]。然而FGS在某些文獻中也同時指代固態(tài)納米孔測序技術(shù)[1]，或者特指原位測序技術(shù)[31]，這都有別于MinION采用的生物納米孔測序技術(shù)。隨著不同學(xué)科在生物學(xué)領(lǐng)域中相互交叉、融合與滲透，新型測序技術(shù)將會不斷涌現(xiàn)，單純以高通量測序、單分子測序、TGS或FGS這種寬泛的概念來指代某種特定技術(shù)可能會引起歧義，這需要在表述時更加嚴謹。

相對于真核生物或細菌基因組，病毒基因組測序中存在其特有的挑戰(zhàn)，其中某些難點有望通過納米孔測序技術(shù)解決。RNA病毒的基因組以往必須通過逆轉(zhuǎn)錄與二鏈合成才能進行測序，從而不可避免地引入偏差。MinION可以直接對RNA進行測序，這有助于研究RNA病毒基因組以及核糖體RNA[32-33]，目前的方案要求RNA的樣本量達到500 ng且具有3′polyA結(jié)構(gòu)，而且其測序準確度還有待進一步提高。還有很多難點是納米孔測序尚不能解決的，比如不同病毒門之間缺少保守的同源性基因，難以設(shè)計通用引物(類似于細菌16 s rRNA)用于廣泛的病毒組學(xué)研究[15]。無論樣品是來自于病原體培養(yǎng)還是直接來自于臨床標本，對病毒基因組測序均會因宿主DNA的污染而變得復(fù)雜[34]。這種污染無法利用甲基化來去除，因為DNA病毒通常在宿主細胞內(nèi)被甲基化，其修飾方式與宿主類似[15]，這一點不同于細菌基因組基于甲基化的靶向富集[35]。盡管MinION可以檢測DNA的甲基化[36](Pacbio平臺也可以[37])，但這通常用于研究細胞的表觀遺傳學(xué)，與病毒基因組的靶向富集沒有太大關(guān)系。

除了用于診斷目的，病毒基因組測序還可用于耐藥性檢測，有些病毒的基因組較大[40]，或者耐藥基因散布在整個基因組中[41]，針對單耐藥基因檢測的時間和經(jīng)濟成本的無明顯優(yōu)勢，全基因組測序是更合理的策略。目前利用納米孔測序技術(shù)專門檢測病毒耐藥的研究并不多[6]，但相信隨著該技術(shù)的推廣普及，結(jié)合其經(jīng)濟便攜的特點，納米孔測序可以對病毒感染者的個性化醫(yī)療起到一定的促進作用。

未來的納米孔測序?qū)蛑扛?、便攜性更強、自動化程度更高的方向發(fā)展。高通量納米孔測序儀GridION X5本身即是一臺高性能的主機，可以裝載5個512通道的Flow Cell。而更高通量的PromethION最多可裝載48個3 000通道的Flow Cell，這足以滿足大規(guī)模商業(yè)化測序服務(wù)的需求。目前MinION的建庫過程已經(jīng)足夠簡單，但ONT仍致力于開發(fā)自動化微流控設(shè)備(VolTRAX)來簡化實驗流程并使文庫的質(zhì)量更加穩(wěn)定。它另一方面，更為小巧輕便的SmidgION測序儀也正在開發(fā)，它以類似配件的形式連接在手機上，將測序儀的便攜性推上了新的高度[3]。

納米孔測序技術(shù)將在病毒基因組的研究中扮演越來越重要的角色，甚至可能成為大多數(shù)分子生物學(xué)或微生物學(xué)實驗室的標準配置。然而這并不意味著納米孔測序短時間內(nèi)能夠徹底取代成熟的Sanger測序、SGS或者Pacbio。希望測序平臺之間良性的競爭有助于推動創(chuàng)新，提高設(shè)備性能并降低價格。同時，應(yīng)該根據(jù)具體的科研目的和臨床需求構(gòu)建適宜的測序方案，善加利用不同方法的技術(shù)優(yōu)勢以彌補彼此的缺陷，從而實現(xiàn)新的病毒學(xué)發(fā)現(xiàn)。

利益沖突:無

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