□ 常 虹 海南省食品檢驗(yàn)檢測中心 唐 帥 海南省食品藥品檢驗(yàn)所瓊海分所 羅小菊 海南省食品檢驗(yàn)檢測中心

1 常規(guī)食品中蛋白檢驗(yàn)方法

食品中蛋白質(zhì)是人類最重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一，準(zhǔn)確測定蛋白質(zhì)含量是食品檢驗(yàn)工作的一項(xiàng)重要內(nèi)容[1]。食品中蛋白質(zhì)的測定具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義，食物中準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)含量為合理配膳提供數(shù)據(jù)，掌握食品的營養(yǎng)價(jià)值和品質(zhì)的變化，保證不同人群對(duì)蛋白質(zhì)的需要[2-3]。

目前，我國的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中有3個(gè)可以測定食品中蛋白質(zhì)的理化方法，分別為GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的第一法凱氏定氮法、第二法分光光度法、第三法燃燒法[4]。此外，還有雙縮脲法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lowry法）等檢驗(yàn)方法，可以對(duì)食品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量的測定。作為食品理化檢驗(yàn)工作從業(yè)者，筆者結(jié)合平時(shí)的檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，分析檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)淺談凱氏定氮法、分光光度法、燃燒法、雙縮脲法（Biuret法）的優(yōu)缺點(diǎn)，同時(shí)參考相關(guān)文獻(xiàn)，以進(jìn)一步證實(shí)筆者的總結(jié)。

2 各類方法優(yōu)缺點(diǎn)比較

2.1 凱氏定氮法

2.1.1 測定原理

在催化加熱條件下，食品中的蛋白質(zhì)被分解，分解后的產(chǎn)物氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收游離氨后以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法[5]。在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機(jī)氮都轉(zhuǎn)變成無機(jī)銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉(zhuǎn)化為氨，隨水蒸氣餾出并被過量的酸液吸收，再以標(biāo)準(zhǔn)堿滴定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗量計(jì)算出樣品中的氮量。

2.1.2 優(yōu)缺點(diǎn)分析

優(yōu)點(diǎn)：①測定結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，在國內(nèi)各大檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)中比較普及；②靈敏度低、干擾少，適用于0.2～1.0 mg氮，誤差為±2%。

缺點(diǎn)：①一般測定時(shí)間為8～10 h，費(fèi)時(shí)且試劑消耗量大；②有局限性，即難以把有機(jī)物定量轉(zhuǎn)變成氨，特別是含有硝酸鹽的樣品會(huì)影響總氮的結(jié)果，影響測定準(zhǔn)確性。

2.2 分光光度法

2.2.1 測定原理

在催化加熱條件下，食品中的蛋白質(zhì)被分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，其在pH 4.8的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長400 nm下測定化合物吸光度值，將其與標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行比較定量，結(jié)果乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。

2.2.2 優(yōu)缺點(diǎn)分析

優(yōu)點(diǎn)：①簡化了操作，省去了蒸餾、滴定的步驟，使用常見的分光光度計(jì)，便于廣泛推廣應(yīng)用，為蛋白質(zhì)的測定提供了凱氏定氮法的簡化方法；②消化時(shí)間相對(duì)較短，所用消化設(shè)備簡便，常用，易于推廣測量靈敏度高、快速，方便低濃度蛋白質(zhì)含量可檢測。本法采用硫酸銨作為銨離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，避免引入其他雜質(zhì)。

缺點(diǎn)：易受溶液中雜質(zhì)的影響、干擾因素較多，存在潛在的偏差，標(biāo)準(zhǔn)曲線不易繪制精確。

2.3 燃燒法

2.3.1 測定原理

試樣在900～1 200 ℃高溫下燃燒，燃燒過程中產(chǎn)生混合氣體，氮氧化物被全部還原成氮?dú)猓渲械奶?、硫等干擾氣體和鹽類被吸收管吸收，形成的氮?dú)鈿饬魍ㄟ^熱導(dǎo)檢測儀（TCD）進(jìn)行檢測。

川端康成在《睡美人》中，第一次將生與死的轉(zhuǎn)換具形化，如果老人們前往俱樂部只是為了等死，那么這就好比是自殺。但是在小說中，作者將死與生巧妙地融合在一起，并讓其互相連通與轉(zhuǎn)化，如此構(gòu)成了作者所想表達(dá)的“生死一如”的美好詩意。“姑娘把胳膊傳到江口眼簾深處的是生的交流,生的旋律,生的誘惑,而且對(duì)老人來說,又是生命力的恢復(fù)。”

2.3.2 優(yōu)缺點(diǎn)分析

優(yōu)點(diǎn)：①操作簡便，檢測周期短檢測樣品無需消化，自動(dòng)進(jìn)樣，5～8 min即可完成一個(gè)樣品的檢測；②檢測數(shù)據(jù)誤差更低，由于凱氏定氮法與燃燒法在實(shí)驗(yàn)原理上的不同，在實(shí)際檢測中，同個(gè)樣品用兩種方法檢測有時(shí)會(huì)出現(xiàn)不同的結(jié)果，而且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)燃燒法檢測出來的數(shù)據(jù)略高于凱氏定氮法；燃燒法能夠?qū)悠分械牡厝繖z測出來，以動(dòng)物性蛋白樣品為例，凱氏法只能測定出其中的有機(jī)氮，而燃燒法可以測出有機(jī)氮和無機(jī)氮；③檢測過程少污染，蛋白質(zhì)燃燒法檢測過程中不產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)，清潔，環(huán)保。

缺點(diǎn)：①對(duì)于不均勻的復(fù)雜樣品分析難度較大，樣品需要確保研磨均勻而且要較細(xì)顆粒，否則易出現(xiàn)燃燒不完全的情況，進(jìn)而影響后續(xù)的檢測結(jié)果；②儀器耗材消耗快，儀器昂貴，檢測成本高，在凈化過程中，燃燒過程中產(chǎn)生混合氣體被適當(dāng)?shù)奈談┏?。這些吸收劑在大批量的樣品檢測中有較大的消耗量，需經(jīng)常更換。而且燃燒法中用到的儀器杜馬斯定氮儀本身價(jià)格較為昂貴，因此限制了這一方法的推廣和應(yīng)用。

2.4 雙縮脲法（Biuret法）

2.4.1 測定原理

雙縮脲法是一個(gè)可以用于鑒定蛋白質(zhì)的分析方法。雙縮脲試劑是堿性的含銅試液，由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配制，呈藍(lán)色。當(dāng)?shù)孜镏泻须逆I（多肽）時(shí)，試液中的銅與多肽配位，生成的配合物呈紫色[6]。在紫外可見光譜中的波長為540 nm，可通過比色法分析濃度。檢測反應(yīng)的靈敏度為5～160 mg/mL。

2.4.2 優(yōu)缺點(diǎn)分析

優(yōu)點(diǎn)：較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，干擾物質(zhì)較少。

3 結(jié)語

基于凱氏定氮法的重現(xiàn)性較好，即便其消化時(shí)間長，目前國內(nèi)各大檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)主要采用常規(guī)凱氏定氮法。原因在于先進(jìn)的蛋白質(zhì)測定儀價(jià)格昂貴，且需專門試劑，目前尚難普及[7]。然而，就檢驗(yàn)時(shí)效而言，凱氏定氮法確實(shí)越來越難以滿足目前市場的要求，故應(yīng)當(dāng)從改進(jìn)凱氏定氮法消化時(shí)間方面進(jìn)行技術(shù)方面的改進(jìn)[8]。目前已有相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)于凱氏定氮法的消化過程進(jìn)行改進(jìn)：用過氧化氫-硫酸混合液為消化試劑，加液方式由一次性加入改為定時(shí)定量、逐滴緩慢加入，取代了凱氏定氮法復(fù)雜的消化體系和操作步驟，使反應(yīng)更加充分、快速[9]。因此，顯著縮短了消化時(shí)間，是常規(guī)消化法消化時(shí)間1/12。樣品經(jīng)快速消化法消化后，其粗蛋白含量測定結(jié)果與常規(guī)消化法基本一致。說明快速消化法不僅消化效果完全、可靠，而且省時(shí)、快速，尤其適合于大批量蛋白質(zhì)的測定分析。

國 家 標(biāo) 準(zhǔn) GB 5009.5-2016 中 的第三法燃燒法是比較理想的快速便捷方法，但由于儀器耗材消耗快，儀器昂貴，檢測成本高，在凈化過程中，燃燒過程中產(chǎn)生混合氣體被適當(dāng)?shù)奈談┏?。這些吸收劑在大批量的樣品檢測中有較大的消耗量，需經(jīng)常更換（如用來吸收酸的鐵絲，用來吸收氯的黃銅，用來吸收多余氧化物的碳粒以及吸水劑高氯酸鎂等）。而且燃燒法中用到的儀器杜馬斯定氮儀本身價(jià)格較為昂貴，因此限制了這一方法的推廣和應(yīng)用。當(dāng)然，有條件的實(shí)驗(yàn)室可以應(yīng)用該方法，建議收集各實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)加以進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性。

綜上所述，蛋白質(zhì)的檢測方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)應(yīng)該結(jié)合本單位實(shí)際，選用符合本單位的檢驗(yàn)檢測方法去進(jìn)行相關(guān)檢測工作。