王賀偉 ， 劉書(shū)梅 ， 陳瑞利 ， 李進(jìn)萍 ， 王雙山

(1.河南省安陽(yáng)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 ， 河南 安陽(yáng) 455002 ； 2.安陽(yáng)工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院 ， 河南 安陽(yáng) 455000 ；3.河南省安陽(yáng)市人民公園 ， 河南 安陽(yáng) 455001)

2017年1月3日，安陽(yáng)市某公園1只1歲母狼死亡，疑似偽狂犬病(PR)，前來(lái)就診。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查、病理解剖學(xué)及實(shí)驗(yàn)室綜合診斷，確診為狼偽狂犬病。隨后采取了防控措施，沒(méi)有出現(xiàn)新的病例。本文通過(guò)臨床和實(shí)驗(yàn)室綜合診斷確定該病由偽狂犬病病毒引起，提示動(dòng)物(公)園在飼養(yǎng)狼及其他犬科動(dòng)物時(shí)，應(yīng)該重視該病的預(yù)防，采取綜合的管理和防制措施，有效預(yù)防和減少因感染該病而導(dǎo)致發(fā)病和死亡。

1 病例介紹

該公園飼養(yǎng)狼6只，近兩年來(lái)沒(méi)有發(fā)生不明原因死亡。2017年1月3日上午，飼養(yǎng)員發(fā)現(xiàn)1只狼口吐白沫，呼吸困難，呈現(xiàn)腹式呼吸、呼吸音粗厲、不斷后退且轉(zhuǎn)圈運(yùn)動(dòng)。逐漸發(fā)展為呻吟不安，陣發(fā)性抽搐，四肢麻痹，發(fā)病后約6 h死亡。

飼養(yǎng)員介紹：未出現(xiàn)過(guò)類(lèi)似病情。該狼發(fā)病前1天，精神狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)狀況、體質(zhì)、飲食情況等均與其他狼無(wú)異，死前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有外界因素的干擾；飼料來(lái)源于安陽(yáng)市某屠宰廠(chǎng)的豬肉胴體，飲用水為公園統(tǒng)一供應(yīng)。

2 病理剖檢

對(duì)送檢狼進(jìn)行剖檢，尸體脫水，皮膚干癟。肝有明顯的出血點(diǎn)和壞死點(diǎn)(見(jiàn)中插彩版圖1)，小腸(見(jiàn)中插彩版圖2)、大腸彌漫性出血(見(jiàn)中插彩版圖3)，肺臟水腫、充血。腦膜水腫、充血、出血，脊髓積液增多(見(jiàn)中插彩版圖4)。其他器官僅見(jiàn)輕微眼觀(guān)病變。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 細(xì)菌鑒定 無(wú)菌采取死亡狼的肝臟、脾臟、淋巴結(jié)和肺臟組織涂片鏡檢，未見(jiàn)細(xì)菌。同時(shí)接種血液瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)48 h觀(guān)察，亦未見(jiàn)細(xì)菌菌落。

3.2 動(dòng)物試驗(yàn)

3.2.1 病料處理 采集狼大腦、脾臟、肺臟以及扁桃體等不同部位的樣品，混合后在研磨器中進(jìn)行充分研磨，然后加入1∶10倍含有濃度分別為1 000 mg(μg)/mL青霉素和鏈霉素的無(wú)菌生理鹽水，放進(jìn)冰箱中，反復(fù)凍融3次，再在離心機(jī)上進(jìn)行離心，取上清液放置冰箱后備用。

3.2.2 試驗(yàn)觀(guān)察 將4只健康兔分為對(duì)照組2只和試驗(yàn)組2只，然后進(jìn)行編號(hào)和標(biāo)記。試驗(yàn)組分別在頸部皮下接種上述病料的上清液2 mL，對(duì)照組分別在頸部皮下接種無(wú)菌生理鹽水2 mL。接種后進(jìn)行觀(guān)察和體溫測(cè)定。

3.2.3 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)組兔體溫升高到41.8 ℃，精神沉郁、呼吸急促。隨后接種部位奇癢，兔子興奮不安、尖叫，舔咬頸部接種部位，用頸部摩擦兔籠，以致被毛脫落、皮膚損傷出血，直至完全麻痹，3 d死亡。 2只試驗(yàn)兔子病情相同。死后剖檢，大腦充血、出血，并采取病料做PCR檢測(cè)。對(duì)照組隔離觀(guān)察7 d，均沒(méi)有出現(xiàn)任何癥狀。

4.3 PCR檢測(cè)

4.3.1 DNA提取 分別無(wú)菌采取狼、動(dòng)物試驗(yàn)死亡兔的，腦、扁桃體和肺3個(gè)部位樣品約1 g，放入滅菌試管中，再加10 mL無(wú)菌生理鹽水，再用分散機(jī)進(jìn)行充分研磨直至無(wú)塊狀物，制成混懸液，然后分別將混懸液轉(zhuǎn)至1.5 mL滅菌離心管中，8 000r/min離心2 min，取0.2 mL上清于1.5 mL滅菌的離心管中。用深圳市康百得生物科技有限公司生產(chǎn)的豬偽狂犬病病毒PCR檢測(cè)試劑盒，按操作說(shuō)明書(shū)提取上清液中的DNA。

4.3.2 PCR反應(yīng) 按上述PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作。總體積為20 μL，含16 μL PCR反應(yīng)液(A液)、2 μL混合酶(B液)、2 μL模板DNA。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為： 94 ℃ 3 min ；循環(huán)94 ℃ 30 s、65 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s，共 40次；再72 ℃延伸10 min。

4.3.3 PCR結(jié)果 分別取狼、兔2個(gè)PCR產(chǎn)物10 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果顯示，采取狼和兔的臟器樣品，進(jìn)行PCR均擴(kuò)增出220 bp大小的特異性條帶，與陽(yáng)性對(duì)照相符，陰性對(duì)照則沒(méi)有出現(xiàn)目的條帶，表明所檢測(cè)病料PRV陽(yáng)性，結(jié)合臨床癥狀、病理剖檢、細(xì)菌分離和動(dòng)物試驗(yàn)，可診斷狼為PR感染。如圖5。

圖5 狼、試驗(yàn)死亡兔病料組織PRV PCR電泳檢測(cè)結(jié)果

5 討論

本次對(duì)公園死亡狼采用綜合臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷，確診死狼為狼偽狂犬病。狼并不是偽狂犬病病毒(PRV) 的原發(fā)宿主，目前普遍認(rèn)為豬是PRV 主要的自然宿主和儲(chǔ)存宿主，而且長(zhǎng)期帶毒和排毒的動(dòng)物，在偽狂犬病的傳播上起著重要的作用。近年 PR 在豬群中廣泛流行，其他動(dòng)物的偽狂犬病發(fā)病率在逐年上升，這與PR 在豬群中廣泛流行有密切關(guān)聯(lián)。而其他動(dòng)物主要通過(guò)食入鼠類(lèi)，或家畜、鼠類(lèi)尸體和尿液污染的飼料感染。該狼可能是生食帶PRV的豬肉軀體感染而死亡。

在試驗(yàn)動(dòng)物中，兔、豚鼠、小鼠等對(duì)PR均有易感性。在基層實(shí)驗(yàn)條件差的情況下，可采用兔做實(shí)驗(yàn)動(dòng)物診斷PR，此法簡(jiǎn)便易行，技術(shù)要求不高，但必須遵循實(shí)驗(yàn)規(guī)則。

目前，該病尚無(wú)理想的特效藥及治療方法，其豬主要依靠免疫接種滅活疫苗或基因缺失苗來(lái)防控豬偽狂犬病，起到了較好的預(yù)防效果。但狼相對(duì)于豬對(duì) PRV 更加敏感，商品用豬偽狂犬病疫苗對(duì)狼的安全性仍待商榷。因此，建議動(dòng)物園(公園)對(duì)該病應(yīng)引起重視并采取綜合防控措施：(1)必須加強(qiáng)對(duì)飼料的管理，尤其是豬的副產(chǎn)品應(yīng)熟喂，嚴(yán)禁飼喂來(lái)源不明的飼料；(2)加大對(duì)環(huán)境的衛(wèi)生消毒力度、做好滅鼠工作，切斷該病傳播途徑；(3)必要時(shí)可以考慮借鑒羊預(yù)防PR的辦法，進(jìn)行接種商品用豬偽狂犬病滅活疫苗。