閆志宇+翟蓓蓓+李術(shù)娜+李紅亞+王全

摘要： 為探明乙草胺降解菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌株L3的促生功能。以嗜鐵素、吲哚乙酸和小分子有機(jī)酸（包括甲酸、乙酸、乳酸等）為檢測(cè)指標(biāo)，應(yīng)用平皿生化反應(yīng)與薄層色譜法對(duì)供試菌株的發(fā)酵液進(jìn)行促生物質(zhì)的定性檢測(cè)，并使用光度法對(duì)嗜鐵素和吲哚乙酸進(jìn)行定量測(cè)定，最后利用特異性顏色反應(yīng)對(duì)菌株所產(chǎn)嗜鐵素類(lèi)型進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，菌株L3可產(chǎn)生嗜鐵素，其D680 nm/D680 nm（r）值為0.610，為羧酸型；菌株可產(chǎn)生吲哚乙酸，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h，其發(fā)酵液中吲哚乙酸濃度為75.6 mg/L；應(yīng)用薄層色譜法檢出菌株可產(chǎn)生小分子有機(jī)酸，但不能明確種類(lèi)。研究結(jié)果明確了乙草胺降解菌L3的促生功能，證實(shí)L3菌株除了可用于修復(fù)乙草胺污染的土壤外，還具有多方面的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞： 乙草胺降解菌；枯草芽孢桿菌；嗜鐵素；吲哚乙酸；小分子有機(jī)酸；促生物質(zhì)

中圖分類(lèi)號(hào)： X172 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）22-0295-04

近年來(lái)，土壤生態(tài)系統(tǒng)不斷遭到破壞，一方面各種農(nóng)藥的過(guò)量或不恰當(dāng)施用導(dǎo)致土壤中農(nóng)藥殘留不斷增多，進(jìn)而引發(fā)糧食、蔬菜等安全問(wèn)題；另一方面，化肥使用量逐年增加，造成土壤板結(jié)，肥力下降，農(nóng)產(chǎn)品減產(chǎn)減質(zhì)嚴(yán)重。面對(duì)日趨嚴(yán)峻的土壤惡化形勢(shì)，科學(xué)家和政府職能部門(mén)均在采用各種措施減輕土壤所受的污染，并尋求新的增產(chǎn)措施。

乙草胺是一種廣譜、高效的內(nèi)吸性酰胺類(lèi)除草劑，需在芽前施用于土壤中[1]。我國(guó)自1982年研制成功乙草胺并投入使用后，乙草胺一直是我國(guó)生產(chǎn)量和用量最大的三大除草劑之一，過(guò)量、頻繁地施用乙草胺或施用不當(dāng)已造成嚴(yán)重的土壤污染，加上乙草胺已被美國(guó)環(huán)保局定為B2類(lèi)致癌物，其降解問(wèn)題已倍受關(guān)注[2-3]。筆者所在研究室前期篩選到1株乙草胺降解菌株L3，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后對(duì)乙草胺的降解率為52.0%，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。據(jù)報(bào)道，枯草芽孢桿菌可通過(guò)分泌嗜鐵素、吲哚乙酸、抗菌蛋白、抗生素等不同物質(zhì)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，加上其在工業(yè)生產(chǎn)中的優(yōu)勢(shì)，對(duì)其促生應(yīng)用功能的研究正成為當(dāng)下的熱點(diǎn)[4]。本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察降解菌株的促生功能，探明此菌株對(duì)解決土壤問(wèn)題的綜合潛力與可行性，以期為該菌株的實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

目前對(duì)乙草胺降解菌的研究大多集中于降解菌的篩選、降解特性研究及降解途徑的分析方面，對(duì)降解菌的多功能發(fā)揮探究尚未見(jiàn)報(bào)道[5-11]。而在促生菌研究方面，目前研究較深入的是假單胞菌屬和芽孢桿菌屬，其中，枯草芽孢桿菌在促生方面的研究已有報(bào)道，但大多數(shù)研究集中于通過(guò)盆栽試驗(yàn)明確其對(duì)植物的增產(chǎn)增質(zhì)效果[12-15]。在對(duì)枯草芽孢桿菌促生物質(zhì)的種類(lèi)及產(chǎn)量研究中，易有金等明確了枯草芽孢桿菌可產(chǎn)生或誘導(dǎo)產(chǎn)生吲哚乙酸、赤霉素和玉米素核苷等促生物質(zhì)[16-17]。余賢美等篩選獲得的枯草芽孢桿菌CAS15和 Bs-15 均可產(chǎn)生促生物質(zhì)嗜鐵素[18-19]。

對(duì)乙草胺降解菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌株L3進(jìn)行盆栽試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，該菌株除對(duì)乙草胺具有較高的降解率（7 d后對(duì)土壤中乙草胺的降解率為34.93%）外，還對(duì)土壤中因乙草胺的施入而降低的一些酶和營(yíng)養(yǎng)元素具有一定的修復(fù)作用，且對(duì)小麥的生長(zhǎng)產(chǎn)生了積極的促進(jìn)作用，推測(cè)乙草胺降解菌L3可能產(chǎn)生了某些促進(jìn)植物生長(zhǎng)的物質(zhì)[20]。因此，本試驗(yàn)選取目前研究最為廣泛的幾種促生物質(zhì)，即嗜鐵素、吲哚乙酸和一些小分子有機(jī)酸作為檢測(cè)對(duì)象，探討菌株L3是否可以產(chǎn)生此類(lèi)物質(zhì)，進(jìn)而明確其在土壤修復(fù)與農(nóng)業(yè)增收增產(chǎn)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

乙草胺降解菌菌株L3，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 培養(yǎng)基和染液

NA培養(yǎng)基，用于L3的活化及保藏。

LB液體培養(yǎng)基，用于菌株發(fā)酵與產(chǎn)嗜鐵素的定量檢測(cè)。

鉻天青（簡(jiǎn)稱(chēng)CAS）定性檢測(cè)培養(yǎng)基：參考Schwyn等的檢測(cè)方法[21-23]，將CAS平板進(jìn)行改進(jìn)，改進(jìn)處如下：

取0.023 g十六烷基三甲基溴化銨加入8 mL蒸餾水中，得液體a；取0.018 g CAS溶于10 mL雙蒸水中，并與3 mL 1 mmol/L FeCl3溶液混勻，得溶液b；然后將溶液a和b混勻，即得染液c。向100 mL雙蒸水中加入4.95 g磷酸氫二鈉和5.10 g磷酸二氫鈉，將配制好的磷酸緩沖液用蒸餾水稀釋 8.5 倍，后取170 mL放入三角瓶中，然后滴入少量的 12 mol/L NaOH使pH值降到5.9，向上述三角瓶中添加3.2 g瓊脂粉，為培養(yǎng)基d。其他操作參照文獻(xiàn)[22]。該培養(yǎng)基用于菌株產(chǎn)嗜鐵素的定性檢測(cè)。

0.5%溴甲酚綠培養(yǎng)基，用于菌株產(chǎn)吲哚乙酸和小分子有機(jī)酸的定性檢測(cè)。

CAS檢測(cè)液的制備參照文獻(xiàn)[22]；以溴甲酚綠為指示劑，顯色范圍為3.8～5.4（黃～藍(lán)）；以對(duì)二甲氨基苯甲醛為顯色劑。

1.2 方法

1.2.1 菌株L3產(chǎn)嗜鐵素能力研究

在CAS定性檢測(cè)培養(yǎng)基上打孔，將培養(yǎng)48 h的L3發(fā)酵液經(jīng)φ0.45 μm濾膜除去菌體后，取上清液100 μL注入小孔內(nèi)，另將未接菌的LB液體培養(yǎng)基經(jīng)上述相同處理后注入孔內(nèi)作為對(duì)照，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察小孔周?chē)伾淖兓闆r，以確定菌株L3產(chǎn)嗜鐵素的能力。

將培養(yǎng)48 h的L3發(fā)酵液于8 000 r/min離心10 min，取 3 mL 上清液加入3 mL CAS檢測(cè)液中，充分混勻[23]。靜置 1 h 后采用分光光度法測(cè)定其在波長(zhǎng)680 nm下的吸光度，以蒸餾水調(diào)零，以未接菌、經(jīng)相同處理的LB液體培養(yǎng)基的吸光度作為本試驗(yàn)的參比值[簡(jiǎn)稱(chēng)D680 nm（r）[23]。endprint

為確定菌株L3所產(chǎn)嗜鐵素的結(jié)構(gòu)類(lèi)型，將培養(yǎng)48 h的L3發(fā)酵液作如下處理：兒茶酚型嗜鐵素檢測(cè)采用Arnows試驗(yàn)[24]；異羥肟酸型嗜鐵素檢測(cè)采用FeCl3試驗(yàn)[25]；羧酸型嗜鐵素檢測(cè)采用Shenkers試驗(yàn)[26]。

1.2.2 菌株L3產(chǎn)吲哚乙酸能力研究

在0.5%溴甲酚綠培養(yǎng)基上打孔，將培養(yǎng)48 h的L3發(fā)酵液經(jīng)φ0.45 μm濾膜除去菌體后，取上清液100 μL注入小孔內(nèi)，另將未接菌的LB液體培養(yǎng)基經(jīng)上述相同處理后注入孔內(nèi)，作為對(duì)照，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后觀察小孔周?chē)伾淖兓闆r，初步判定菌株L3產(chǎn)吲哚乙酸的情況。

利用薄層層析法進(jìn)一步鑒定菌株L3產(chǎn)吲哚乙酸的能力。制作濃度為30%的硅膠層析板，用等體積乙酸乙酯萃取菌株L3培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液，將上層有機(jī)溶劑倒入圓底燒瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮樣品，干燥后的粉末倒入燒杯中，加入5 mL甲醇溶解；設(shè)置未接L3菌株的對(duì)照組，與試驗(yàn)組進(jìn)行相同處理。用0.5 mm毛細(xì)管蘸取吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)樣，并取試驗(yàn)樣品和對(duì)照樣品依次點(diǎn)樣2個(gè)，以體積比5 ∶ 1的三氯甲烷、甲醇為展開(kāi)劑，晾干后用對(duì)二甲氨基苯甲醛顯色劑顯色。

對(duì)吲哚乙酸進(jìn)行定量測(cè)定，制作吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：向 5 mL 甲醇中加入5.0 mg吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，充分溶解后配成終濃度為1 mg/mL的吲哚乙酸母液。分別取0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60 mL上述母液，用甲醇定容至20 mL。搖勻后在280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各自的吸光度，以甲醇為對(duì)照調(diào)零。取培養(yǎng)至24、36、48 h的發(fā)酵液，經(jīng)乙酸乙酯萃取濃縮后置于4支1.5 mL的離心管中，8 000 r/min離心10 min，取上清液用甲醇溶液稀釋200倍后加入比色皿中，分別測(cè)其在280 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以甲醇溶液為對(duì)照調(diào)零。根據(jù)吲哚乙酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的產(chǎn)物濃度。

1.2.3 菌株L3產(chǎn)小分子有機(jī)酸的能力研究

利用薄層層析法定性判定菌株是否能產(chǎn)小分子有機(jī)酸及其種類(lèi)。制備菌株L3的發(fā)酵液，設(shè)置不接菌對(duì)照組，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。用與吲哚乙酸同樣的方法對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行萃取濃縮。分別在5支1.5 mL離心管中加入0.2 mL甲酸、乙酸、乳酸、蘋(píng)果酸、丙酸、正丁酸溶液，加入0.8 mL甲醇溶液搖勻以配制各小分子有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)液，并各取少量（等量）混勻。用 0.5 mm 毛細(xì)管蘸取標(biāo)準(zhǔn)酸混合液及濃縮樣品液、對(duì)照液依次點(diǎn)樣于薄層板，以體積比5 ∶ 4 ∶ 1的三氯甲烷、乙酸乙酯、甲酸為展開(kāi)劑，將展開(kāi)后的薄層板在通風(fēng)處晾置12 h后，用溴甲酚綠顯色劑顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株L3產(chǎn)嗜鐵素的能力研究

CAS定性檢測(cè)培養(yǎng)基呈天藍(lán)色固態(tài)，由于嗜鐵素是強(qiáng)鐵螯合劑，可競(jìng)爭(zhēng)培養(yǎng)基中與乙二胺四乙酸（EDTA）螯合的鐵離子，使培養(yǎng)基由藍(lán)色變成黃色，因此菌落周?chē)S色暈圈的大小可代表嗜鐵素的產(chǎn)量[12]。觀察培養(yǎng)48 h后的培養(yǎng)基，與對(duì)照孔相比，注入L3發(fā)酵液小孔周?chē)拈冱S色暈圈現(xiàn)象明顯，見(jiàn)圖1。因此可知菌株L3可以產(chǎn)生嗜鐵素。

經(jīng)測(cè)定，在波長(zhǎng)680 nm下，各處理的吸光度見(jiàn)表1。菌株L3 D680 nm均值為0.603，參比組均值為0.988，D680 nm/D680 nm（r）比值為0.603/0.988=0.610。D680 nm/D680 nm（r）比值作為定量指標(biāo)，比較各種微生物嗜鐵素的產(chǎn)量，D680 nm/D680 nm（r）比值越小，反映嗜鐵素的產(chǎn)量越大。

在嗜鐵素類(lèi)型檢測(cè)反應(yīng)中，菌株L3的發(fā)酵液在兒茶酚型嗜鐵素檢測(cè)和異羥肟酸型檢測(cè)試驗(yàn)所規(guī)定的波長(zhǎng)中均沒(méi)有吸收峰；而在羧酸型嗜鐵素檢測(cè)中，其發(fā)酵液上清與檢測(cè)液反應(yīng)，在240～280 nm范圍內(nèi)有明顯的吸收峰（圖2），表明菌株L3產(chǎn)生的嗜鐵素為羧酸型。

2.2 菌株L3產(chǎn)吲哚乙酸能力研究

溴甲酚綠的變色pH值范圍為3.8～5.4，顏色變化為黃色～藍(lán)色；本研究的溴甲酚綠培養(yǎng)基為偏中性，呈藍(lán)色，如菌株發(fā)酵液中含有吲哚乙酸，則導(dǎo)致孔周?chē)嗜跛嵝?，該范圍培養(yǎng)基中的溴甲酚綠變?yōu)辄S綠色。圖3所示為菌株培養(yǎng)48 h后發(fā)酵液所造成的顏色變化情況。由圖3可見(jiàn)，與對(duì)照孔相比，L3發(fā)酵液孔周?chē)囵B(yǎng)基趨近黃綠色，說(shuō)明菌株L3可產(chǎn)生一定量的吲哚乙酸。

對(duì)該菌株發(fā)酵液用硅膠薄層色譜法進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)，根據(jù)吲哚類(lèi)物質(zhì)遇對(duì)二甲氨基苯甲醛顯示玫瑰紅色的特性來(lái)定性檢測(cè)發(fā)酵液中的吲哚乙酸。48 h后發(fā)酵液的薄層色譜結(jié)果見(jiàn)圖4，表明菌株L3發(fā)酵液含有吲哚乙酸。

通過(guò)紫外分光光度法測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)吲哚乙酸的吸光度，得出吲哚乙酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.019 8x+0.026 2，r2=0.997 6。經(jīng)檢測(cè)計(jì)算，不同發(fā)酵時(shí)間下菌株L3發(fā)酵液D280 nm及對(duì)應(yīng)的吲哚乙酸含量見(jiàn)表2。

根據(jù)表2可知，培養(yǎng)36 h的發(fā)酵液中吲哚乙酸含量最高，而48 h時(shí)含量有所下降，推測(cè)可能是菌株所分泌的吲哚乙酸參與后期菌株代謝而被利用消耗了。

2.3 菌株L3產(chǎn)小分子有機(jī)酸能力研究

為明確發(fā)酵液中是否含有小分子有機(jī)酸及其類(lèi)型，采用硅膠薄層色譜法進(jìn)行進(jìn)一步的定性檢測(cè)，用酸堿指示劑溴甲酚綠為顯色劑。經(jīng)多次比較試驗(yàn)，考慮菌株在發(fā)酵過(guò)程中可能產(chǎn)生的一種或幾種小分子有機(jī)酸較微量，不便于分別檢出，故將各標(biāo)準(zhǔn)酸液混勻使用，并對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行充分濃縮，所得薄層色譜結(jié)果見(jiàn)圖5。如圖5所示，小分子有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品混合液在薄層板上形成綠色區(qū)域，菌株L3發(fā)酵液在相應(yīng)水平面上同樣出現(xiàn)該變色區(qū)域，而對(duì)照組中只出現(xiàn)略微斑跡，可能是受到展開(kāi)劑影響。此結(jié)果雖未能確定所產(chǎn)有機(jī)酸的種類(lèi)，但可說(shuō)明菌株L3發(fā)酵液中的確有小分子有機(jī)酸產(chǎn)生。

3 結(jié)論與討論

已報(bào)道的菌株嗜鐵素產(chǎn)量各不相同，較高的如韓松等篩選的芽孢桿菌，樣品D680 nm的D/Dr值約為0.2[27]；梁建根等篩選出的杭州地區(qū)黃瓜猝倒病菌產(chǎn)嗜鐵素拮抗菌HZX-25與HZD-8，其D/Dr值分別為0.62、0.61[28]；余賢美分離獲得的枯草芽孢桿菌CAS15，其D510 nm/D600 nm值為0.10～039。本試驗(yàn)中枯草芽孢桿菌L3所產(chǎn)嗜鐵素其D/Dr值為0.61，產(chǎn)量比較理想[19]。endprint

前人所獲菌株的吲哚乙酸產(chǎn)量從0.152～148.800 mg/L大小不等[29-31]。菌株L3培養(yǎng)至36 h時(shí)發(fā)酵液中吲哚乙酸濃度可達(dá)75.6 mg/L。據(jù)報(bào)道，吲哚乙酸對(duì)植物正常生長(zhǎng)的作用通常是低濃度可促進(jìn)生長(zhǎng)，濃度稍高時(shí)即起抑制生長(zhǎng)的作用，更高濃度即對(duì)植物有傷害作用[32]。不過(guò)不同作物對(duì)吲哚乙酸濃度的敏感性不同[33]。

有機(jī)酸不僅是植物碳代謝的中間體，而且在應(yīng)對(duì)養(yǎng)分缺乏、金屬脅迫以及根-土界面植物-微生物間交互作用方面都發(fā)揮著關(guān)鍵作用[34]。且低濃度有機(jī)酸對(duì)作物的生長(zhǎng)有明顯的調(diào)節(jié)，可提高作物的抗逆性[35]。新的活性有機(jī)酸和有機(jī)酸鹽的發(fā)現(xiàn)會(huì)成為調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)過(guò)程的重要研究課題。在本研究中，并沒(méi)有確切檢驗(yàn)出菌株L3產(chǎn)生小分子有機(jī)酸的類(lèi)型，由于小分子有機(jī)酸在產(chǎn)生之后便迅速進(jìn)入菌株的物質(zhì)代謝循環(huán)，被微生物再利用，故須要采用其他更靈敏準(zhǔn)確的定性定量檢測(cè)方法如高效液相色譜法、氣相色譜法和離子交換色譜法等。

本試驗(yàn)僅對(duì)菌株檢測(cè)了少量促生物質(zhì)，但具有促生長(zhǎng)作用的物質(zhì)還有很多，如植物細(xì)胞分裂素（簡(jiǎn)稱(chēng)CTK）[36]、氨基環(huán)丙烷羧酸（簡(jiǎn)稱(chēng)ACC）脫氨酶[29]、其他有機(jī)酸（包括腐殖酸、低分子酸）[37]和某些抗生素等。菌株L3也可能潛在地分泌其他類(lèi)型的促生物質(zhì)，有待試驗(yàn)的進(jìn)一步加強(qiáng)和驗(yàn)證。

試驗(yàn)最終探明菌株L3可產(chǎn)生一定量的嗜鐵素、吲哚乙酸、小分子有機(jī)酸，基本明確了菌株L3的促生作用。菌株L3所產(chǎn)嗜鐵素其D/Dr值為0.610，全部為羧酸型；36 h時(shí)菌株L3發(fā)酵液中吲哚乙酸的濃度為75.6 mg/L；經(jīng)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)可知，菌株L3有較強(qiáng)的促生能力。

本試驗(yàn)證實(shí)菌株L3除可降解除草劑乙草胺外，兼有促進(jìn)植物生長(zhǎng)能力，且L3屬枯草芽孢桿菌，由于芽孢桿菌具有利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)、倉(cāng)儲(chǔ)期長(zhǎng)、活性不易衰退，且施用于土壤中更易適應(yīng)環(huán)境、生存定值與功能發(fā)揮等特點(diǎn)，使其具有更廣泛的應(yīng)用前景和更大的應(yīng)用價(jià)值。本研究為單一菌劑在受損土壤的多方修復(fù)應(yīng)用方面提供了理論指導(dǎo)。

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