陳忠杰　胡燕

摘要：將從發(fā)酵豆制品中分離出的枯草芽孢桿菌作為生防菌株，研究了該菌的菌懸液和培養(yǎng)液濾液對(duì)板栗采后黑斑病的抑制效果。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌菌懸液可以使板栗采后黑斑病的發(fā)病率降低約75百分點(diǎn)，其濾液也可以使板栗采后黑斑病的發(fā)病率降低約45百分點(diǎn)。這說(shuō)明枯草芽孢桿菌可以顯著降低板栗采后黑斑病的發(fā)病率，并且枯草芽孢桿菌的抑菌作用是通過(guò)菌體和代謝物質(zhì)共同實(shí)現(xiàn)的，其代謝產(chǎn)物的抑菌效果比菌體強(qiáng)，起主要的抑菌作用?？莶菅挎邨U菌可以作為一種新型的保鮮劑應(yīng)用于板栗保鮮，對(duì)于減少板栗腐爛率、延長(zhǎng)貯藏期、增加經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；板栗；黑斑??；生物防治

中圖分類號(hào)： Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0256-03

收稿日期：2014-02-21

作者簡(jiǎn)介：陳忠杰（1978—），男，河南商丘人，碩士，講師，主要從事微生物資源的開發(fā)及利用研究。E-mail：chzhji@126.com。板栗原產(chǎn)我國(guó)，是我國(guó)特色堅(jiān)果之一，因其營(yíng)養(yǎng)豐富，味道甘美，且有補(bǔ)腎益氣、養(yǎng)胃健脾、活血止血、延緩人體衰老的功效而素有“干果之王”的美稱[1]。新鮮板栗含水量高，而且采后呼吸旺盛，在貯藏期間還易受到微生物的侵襲而產(chǎn)生霉變，因此板栗很不耐貯藏。中國(guó)板栗每年因貯藏不當(dāng)或栗實(shí)霉?fàn)€而造成的損失可達(dá)板栗年總產(chǎn)量的1/4左右[2]。板栗黑斑病的發(fā)生是造成板栗霉?fàn)€的重要原因之一。關(guān)于板栗的貯藏保鮮方法目前已有較多研究，主要有冷藏[3]、化學(xué)防腐劑處理[4-5]、熱處理[6]、涂膜[7-8]等。這些方法在一定程度上確實(shí)能夠延長(zhǎng)板栗的貯藏期，減少因?yàn)槊範(fàn)€而造成的經(jīng)濟(jì)損失，但是這些方法也有不足之處，如冷藏耗能高、成本高，熱處理可能對(duì)板栗的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味有一定影響，涂膜和化學(xué)防腐劑的使用有可能造成一定程度的食品安全隱患。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）在自然界中廣泛存在，對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害，不污染環(huán)境，能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力[9]?？莶菅挎邨U菌用于防治植物病害的作用已受到國(guó)內(nèi)外的廣泛認(rèn)可，國(guó)內(nèi)外均已有多個(gè)以枯草芽孢桿菌開發(fā)的生物農(nóng)藥上市銷售并推廣到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中?？莶菅挎邨U菌應(yīng)用于植物病害生物防治的研究已經(jīng)有很多年的歷史，目前在黃瓜、辣椒、水稻、小麥、玉米等農(nóng)作物病害上顯出較好的防治效果[10]。但用枯草芽孢桿菌防治板栗黑斑病的研究還較少。本試驗(yàn)以采后的新鮮板栗為原料，研究了枯草芽孢桿菌對(duì)采后板栗黑斑病的抑制效果，以期為板栗的貯藏保鮮找到一個(gè)成本低、效果好并且安全環(huán)保的新方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑

枯草芽孢桿菌菌種由筆者所在實(shí)驗(yàn)室從發(fā)酵豆制品中分離和保存；板栗，產(chǎn)地河南信陽(yáng)，購(gòu)于鄭州市陳寨農(nóng)產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)；蛋白胨，鄭州亞世生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；瓊脂，鄭州亞世生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；酵母浸膏，宜興市江山生物制劑有限公司生產(chǎn)；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2主要儀器與設(shè)備

LHS-100CH型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海一恒儀器有限公司生產(chǎn)；SHY-3 型水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)；722型分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司生產(chǎn)；YX280AS手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海三申醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；其他玻璃儀器均為河南銘駿儀器儀表有限公司生產(chǎn)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1枯草芽孢桿菌菌種活化分別稱取蛋白胨10.0 g，酵母浸膏5.0 g，NaCl 10.0 g，1 L蒸餾水，再調(diào)pH值至弱堿性，121 ℃濕熱滅菌20 min，配制好的LB液體培養(yǎng)基備用。用接種環(huán)挑取保存于固體斜面培養(yǎng)基上的枯草芽孢桿菌菌落1～2環(huán)，接種到配制好的LB液體培養(yǎng)基100 mL中，在37 ℃左右的溫度下振蕩培養(yǎng)24 h，得到活化菌懸液，備用。

1.3.2枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定[11]分別準(zhǔn)確吸取 1.0 mL 活化菌懸液（1×107 CFU/mL）于已裝50 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在轉(zhuǎn)速150 r/min、37 ℃下恒溫振蕩培養(yǎng)。每隔12 h取出2.0 mL培養(yǎng)液于試管中，以不含菌LB液體培養(yǎng)基調(diào)零管，測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間下570 nm處吸光度（D570 nm）。濃度大的發(fā)酵液用LB液體培養(yǎng)基稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使吸光度在0.10～1.00之間，將稀釋液對(duì)應(yīng)的吸光度乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，換算成原發(fā)酵液吸光度，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，570 nm處吸光度為縱坐標(biāo)，繪制枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線。

1.3.3病原菌的分離稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切成小塊，加水1 L，加瓊脂15 g，煮沸0.5 h，紗布過(guò)濾，再加10～20 g 葡萄糖，充分溶解后定容到1 L，121 ℃滅菌30 min，配制好PDA培養(yǎng)基備用。選擇已產(chǎn)生嚴(yán)重斑點(diǎn)的黑斑病板栗病果為材料，將黑斑病板栗用小刀切成碎末，稱取帶菌板栗碎末5 g于30 mL無(wú)菌水中，混合振蕩2 min，取一定稀釋度的水洗液接種于已倒好PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于28 ℃左右的溫度培養(yǎng)5 d。再通過(guò)平板劃線技術(shù)完成不同病菌種類的分離。將分離后的各種病原菌用0.01% Tween80無(wú)菌水溶液配制成濃度為5×104個(gè)/mL的孢子懸浮液，最后再等體積混合各種病原菌孢子懸浮液制成濃度為5×104個(gè)/mL的混合病原菌孢子懸浮液。

1.3.4枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液對(duì)板栗黑斑病病菌的抑制作用將枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液分別按照1 ∶1 000、1 ∶500、1 ∶250和1 ∶125的比例加入到30～40 ℃的PDA培養(yǎng)基中，搖動(dòng)后倒入直徑為12 cm的培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基冷凝后，分別接種10 μL濃度為5×104個(gè)/mL的混合病原菌孢子懸浮液。接種后的培養(yǎng)皿放入28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以不加枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液的為空白對(duì)照，各重復(fù)3次。培養(yǎng)5 d后測(cè)定菌落直徑，計(jì)算平均抑制效果。

1.3.5枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液對(duì)采后板栗黑斑病的抑制作用將分離后的各種病原菌用0.01% Tween80無(wú)菌水溶液配制成濃度為5×104個(gè)/mL的孢子懸浮液。滅過(guò)菌的打孔針在每個(gè)板栗仁上刺一個(gè)3 mm（深）×3 mm（寬）的傷口，分別接種20 μL枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液，5 h后再接種濃度為5×104個(gè)/mL的混合病原菌孢子懸浮液10 μL。待傷口晾干后，將果實(shí)放于室溫下貯藏，以不接種枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液的板栗仁為空白對(duì)照，每隔1 d測(cè)定果實(shí)的發(fā)病率。

1.3.6枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)板栗黑斑病病菌的抑制作用將枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液于4 ℃下8 000 r/min離心 10 min 后，取上清液，經(jīng)過(guò)濾后得到濾液備用。將濾液分別按照1 ∶1 000、1 ∶500、1 ∶250和1 ∶125的比例加入到30～40 ℃的PDA培養(yǎng)基中，搖動(dòng)后倒入直徑為12 cm的培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基冷凝后，分別接種10 μL濃度為5×104個(gè)/mL的混合病原菌孢子懸浮液。接種后的培養(yǎng)皿放入28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以不加枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液的為空白對(duì)照，各重復(fù)3次。培養(yǎng)5 d后測(cè)定菌落直徑，計(jì)算平均抑制效果。

1.3.7枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)采后板栗黑斑病的抑制作用將枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液于4 ℃下8 000 r/min離心 10 min 后，取上清液，經(jīng)過(guò)濾后得到濾液備用。將分離后的各種病原菌用0.01% Tween80無(wú)菌水溶液配制成濃度為5×104個(gè)/mL的孢子懸浮液。滅過(guò)菌的打孔針在每個(gè)板栗仁上刺一個(gè)3 mm（深）×3 mm（寬）的傷口，分別接種20 μL枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液濾液，5 h后再接種濃度為5×104個(gè)/mL的混合病原菌孢子懸浮液10 μL。待傷口晾干后，將果實(shí)放于室溫下貯藏，以不接種枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液的板栗仁為空白對(duì)照，每隔1 d測(cè)定果實(shí)的發(fā)病率。

2結(jié)果與分析

2.1枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的繪制

任何生物都有出生、發(fā)育、繁殖、衰老和死亡的過(guò)程。微生物也不例外。不過(guò)，微生物的生長(zhǎng)規(guī)律和大生物有些不同，大生物通常是以一個(gè)個(gè)體為對(duì)象，而微生物的生長(zhǎng)通常指細(xì)胞數(shù)目的增加。微生物的生長(zhǎng)規(guī)律可以用生長(zhǎng)曲線來(lái)呈現(xiàn)。典型的微生物生長(zhǎng)曲線一般包括延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個(gè)階段。由圖1可以看出，因測(cè)定間隔時(shí)間較長(zhǎng)，枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的延滯期不太明顯，曲線中沒有呈現(xiàn)出來(lái)，接種后很快就進(jìn)入快速生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，大概24 h后開始進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，培養(yǎng)時(shí)間大于60 h后，細(xì)胞數(shù)目開始減少，菌體開始衰老死亡。根據(jù)這個(gè)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線所呈現(xiàn)出的生長(zhǎng)規(guī)律，選擇菌種活化后24 h的菌懸液進(jìn)行抑菌研究，因?yàn)檫@個(gè)時(shí)期的枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)旺盛，活力強(qiáng)。

2.2枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液對(duì)板栗黑斑病病菌的抑制作用

試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明，當(dāng)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液的添加量為0時(shí)，病原菌菌落直徑為36.8 mm；當(dāng)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液的添加量為1 ∶1 000時(shí)，病原菌菌落直徑為25.3 mm；當(dāng)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液的添加量為1 ∶500時(shí)，病原菌菌落直徑為 8.6 mm；當(dāng)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液的添加量為1 ∶250和 1 ∶125 時(shí)，病原菌都沒有生長(zhǎng)。由此可見，枯草芽孢桿菌添加量越大，對(duì)病原菌的抑制效果越好。當(dāng)枯草芽孢桿菌的添加量大于1 ∶250時(shí)，就能夠抑制板栗黑斑病病原菌的生長(zhǎng)，并且抑菌效果能達(dá)到100%。

2.3枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液對(duì)采后板栗黑斑病的抑制作用

由圖2可見，與不加枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液的空白對(duì)照相比，添加了枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液的板栗接種病原菌后在貯藏過(guò)程中發(fā)病率明顯要低很多。不加枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液的板栗接種病原菌后發(fā)病很快，2 d之后病原菌的生長(zhǎng)就進(jìn)入快速生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，大量板栗開始發(fā)病，4 d后，發(fā)病板栗基本上占到了90%，7 d后發(fā)病率達(dá)到了95%。而添加了枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液的板栗，在貯藏過(guò)程中板栗發(fā)病的速度相比要慢得多，而且一直維持緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)，貯藏4 d后，發(fā)病率大概只有10%，貯藏7 d后發(fā)病的板栗也只有不到20%，比不加枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液的板栗發(fā)病率降低了約75百分點(diǎn)。這說(shuō)明枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液能夠顯著抑制板栗采后黑斑病的發(fā)生。

2.4枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)板栗黑斑病病菌的抑制作用

試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明，當(dāng)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液濾液的添加量為0時(shí)，病原菌菌落直徑為38.2 mm；當(dāng)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液濾液的添加量為1 ∶1 000時(shí)，病原菌菌落直徑為29.5 mm；當(dāng)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液濾液的添加量為1 ∶500時(shí)，病原菌菌落直徑為15.8 mm；當(dāng)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液濾液的添加量為1 ∶250時(shí)，病原菌菌落直徑為7.5 mm；當(dāng)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液濾液的添加量為1 ∶125時(shí)，病原菌沒有生長(zhǎng)。由此可見，枯草芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物也對(duì)病原菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物添加量越大，對(duì)病原菌的抑制效果越好。當(dāng)枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物的添加量大于1 ∶125時(shí)，就能夠抑制板栗黑斑病病原菌的生長(zhǎng)，并且抑菌效果能達(dá)到100%。對(duì)比枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液對(duì)板栗黑斑病病菌的抑制作用試驗(yàn)結(jié)果可以看出，濾液的抑菌效果不如菌懸液顯著。這可能是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌的抗生作用是由芽孢桿菌及其代謝物質(zhì)兩部分作用共同構(gòu)成的[12]。

2.5枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物對(duì)采后板栗黑斑病的抑制作用

由圖3可見，與空白對(duì)照相比，添加了枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液濾液的板栗接種病原菌后發(fā)病率明顯低于不添加枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液濾液的板栗。不加枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液濾液的板栗接種病原菌后發(fā)病很快，2 d之后病原菌的生長(zhǎng)就進(jìn)入快速生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，大量板栗開始發(fā)病，4 d后，發(fā)病板栗就達(dá)到了約90%。而添加了枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液的板栗，在貯藏過(guò)程中發(fā)病速度要慢得多，而且一直維持緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)，貯藏7 d后，發(fā)病板栗約50%，比空白對(duì)照發(fā)病率低約45百分點(diǎn)。這說(shuō)明枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)物也能夠顯著抑制板栗采后黑斑病的發(fā)生。但是對(duì)照枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液對(duì)采后板栗黑斑病的抑制作用試驗(yàn)結(jié)果可以看出，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液濾液的抗病效果沒有菌懸液的抗病效果顯著。這進(jìn)一步印證了枯草芽孢桿菌的抗生作用是由芽孢桿菌及其代謝物質(zhì)兩部分作用共同構(gòu)成的，單純的代謝產(chǎn)物雖然也有抗病作用，但是效果不如既有菌體也有代謝產(chǎn)物存在的情況下好。

3結(jié)論

應(yīng)用芽孢桿菌防治植物病害具有悠久的歷史，許多優(yōu)良菌株已應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐來(lái)防治果蔬、作物等的真菌、細(xì)菌病害[13]。其中，枯草芽孢桿菌以其安全、對(duì)人畜無(wú)害、不污染環(huán)境的特點(diǎn)，廣泛用于果蔬采后生物防治，如有文章報(bào)道，利用枯草芽孢桿菌可以防治桃褐腐病和荔枝果腐病[14]。

陳坤等對(duì)信陽(yáng)板栗7種病原真菌進(jìn)行了生物學(xué)研究，認(rèn)為微生物侵染板栗果實(shí)，形成黑斑病，對(duì)板栗黑斑病進(jìn)行病菌分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)信陽(yáng)板栗黑斑病常見7種病菌真菌，分別為炭疽菌（Collecto trium sp.）、鐮孢菌（Fusar ium sp.）、枝孢霉（Cladosporium sp.）、毛霉（Mucor）、疫霉（Phytophthora pasitica）、大莖點(diǎn)菌（Macrophoma sp.）和黃曲霉（Aspergillusflavus）[15]。試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌可以抑制板栗病原菌的生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而顯著降低板栗采后黑斑病的發(fā)病率?？莶菅挎邨U菌菌懸液可以使板栗采后黑斑病的發(fā)病率降低約75百分點(diǎn)，其濾液也可以使板栗采后黑斑病的發(fā)病率降低約45百分點(diǎn)。這說(shuō)明枯草芽孢桿菌的抑菌作用是通過(guò)菌體和代謝物質(zhì)共同實(shí)現(xiàn)的，而且其代謝產(chǎn)物的抑菌效果比菌體還要強(qiáng)，起主要的抑菌作用。由此也找到一條板栗采后保鮮的新途徑，可以為我國(guó)板栗在貯藏過(guò)程中延長(zhǎng)貯藏期、降低腐爛率、提高經(jīng)濟(jì)效益方面提供幫助。

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