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        Box—Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)化五味子木脂素的提取工藝

        2018-01-06 16:20:40金銀萍王博劉興醫(yī)逄世峰薛禹臣王英平
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年22期
        關(guān)鍵詞:單因素試驗(yàn)木脂素提取工藝

        金銀萍+王博+劉興醫(yī)+逄世峰+薛禹臣+王英平

        摘要: 以五味子果實(shí)為原料,研究五味子木脂素的最佳提取工藝條件。以木脂素提取率為響應(yīng)值,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間對五味子木脂素提取率的影響。結(jié)果表明,冷凝回流法提取五味子木脂素的最佳提取工藝為:乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、提取溫度83 ℃、提取時(shí)間232 min,五味子木脂素的提取率為0.54%;采用Box-Behnken響應(yīng)曲面法建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性好、穩(wěn)定可行,可作為五味子木脂素提取的生產(chǎn)工藝。

        關(guān)鍵詞: 五味子;木脂素;單因素試驗(yàn);冷凝回流;響應(yīng)曲面分析;冷凝回流法;提取工藝

        中圖分類號(hào): R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

        文章編號(hào):1002-1302(2017)22-0210-03

        五味子[Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.]為木蘭科五味子屬多年生落葉藤本植物,為著名的滋補(bǔ)和安神鎮(zhèn)靜中藥,已有2 000多年的臨床應(yīng)用歷史。五味子的主要成分為木脂素、三萜、揮發(fā)油、多糖等[1],其中主要的藥效成分為木脂素,具有保肝、抑制中樞神經(jīng)、抗衰老、抗腫瘤等多種藥理活性[2]。近年來,有關(guān)五味子木脂素提取工藝的文獻(xiàn)有很多,以正交試驗(yàn)方法較為常見,但篩選得到的結(jié)果差異性大、重復(fù)性差[3-4]。

        響應(yīng)曲面法(response surface method,簡稱RSM)是一種通過對響應(yīng)曲面及等高線進(jìn)行分析并尋求最優(yōu)工藝參數(shù)的方法,采用多元二次回歸方程擬合響應(yīng)值與因素之間函數(shù)關(guān)系的一種優(yōu)化統(tǒng)計(jì)方法[5-6]。該方法在木脂素提取工藝方面的研究報(bào)道較少,而且主要針對的是超聲波輔助提取,且是在沒有單因素的考察基礎(chǔ)上進(jìn)行的,缺乏整體系統(tǒng)性及科學(xué)性[7-10]。本研究首次采用冷凝回流的提取方法,以五味子中含量高的4種木脂素含量為考察指標(biāo),在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選五味子木脂素的提取工藝,為五味子木脂素類成分的工業(yè)化提取提供參考依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀(美國Waters公司);CPA225D電子天平(德國Sartorius公司);HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司);SF-TDL-4A離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司)。

        五味子果實(shí)采自吉林左家特產(chǎn)研究所資源圃,經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所艾軍研究員鑒定為木蘭科五味子屬植物的果實(shí)。五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素(中國食品藥品檢定研究所,批號(hào)分別為110857、110764、110765);五味子醇乙(上海源葉生物科技有限公司,批號(hào)為YY90208)。乙腈為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 五味子中木脂素含量的測定

        1.2.1.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);流動(dòng)相乙腈(A)-水(B),梯度洗脫程序?yàn)?~1.0 min,48%~50%A;1.0~3.0 min,50%~70%A;3.0~4.5 min,70%~95%A;4.5~6.5 min,95%A;65~7.0 min,95%~48%A;7.0~9.0 min,48%A;柱溫 35 ℃,樣品溫度15 ℃,檢測波長254 nm,流速 0.35 mL/min,進(jìn)樣量1 μL。

        1.2.1.2 供試品溶液的制備 五味子果實(shí)低溫干燥,粉碎過80~100目篩,精確稱取5.000 g原料粉末,按照表1試驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件進(jìn)行乙醇回流提取,過濾,合并濾液,4 500 r/min離心10 min,取上清液,用乙醇溶液定容至100 mL容量瓶內(nèi),經(jīng)022 μm微孔濾膜過濾,高效液相檢測分析。

        1.2.1.3 對照品溶液的制備 精確稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素對照品適量,置于10 mL容量瓶內(nèi),用甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,即得到質(zhì)量濃度分別為113.6、62.0、36.8、62.0 μg/mL的混合對照品溶液。

        1.2.1.4 線性關(guān)系考察 將混合對照品溶液用甲醇溶液稀釋成系列濃度梯度,依次進(jìn)入高效液相色譜儀,按上述色譜條件測定,以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算各木脂素的回歸方程,具體結(jié)果見表2。

        1.2.1.5 精密度 取供試品溶液按“1.2.1.1”節(jié)色譜條件連續(xù)測定6次,記錄峰面積。結(jié)果顯示,五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面積的RSD分別為0.49%、039%、0.63%、0.48%(n=6),表明儀器精密度良好。

        1.2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試樣品溶液,分別放置0、

        2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣分析,記錄峰面積,計(jì)算木脂素含量。結(jié)果顯示,供試樣品液中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素含量的RSD分別為0.89%、0.76%、1.02%、1.23%(n=6)。結(jié)果表明,供試樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        1.2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試樣品溶液6份,按“1.2.1.1”色譜條件測定,測得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面積的RSD分別為0.72%、0.49%、1.13%、0.97%,表明本方法的重復(fù)性良好。

        1.2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取混合對照品適量,加入已知含量的同一批五味子粉末5.000 g中,按照“1.2.1.1”色譜條件和“1.2.1.2”供試品制備方法進(jìn)行檢測分析。結(jié)果顯示,五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的平均加樣回收率分別為101.9%、98.6%、101.3%、97.9%,RSD值分別為2.8%、3.1%、1.7%、2.5%(n=6)。endprint

        1.2.2 五味子木脂素提取單因素試驗(yàn)

        1.2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 準(zhǔn)確稱取粉碎后的五味子粉末5000 g(5份),按1 g ∶ 10 mL的料液比加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液,提取溫度為90 ℃,提取時(shí)間為3 h,提取2次,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%時(shí)對五味子木脂素提取率的影響。

        1.2.2.2 提取時(shí)間 準(zhǔn)確稱取粉碎后的五味子粉末5.000 g(5份),按1 g ∶ 10 mL的料液比加入90%乙醇溶液,提取溫度為90 ℃,提取2次,考察提取時(shí)間分別為30、90、150、210、270 min 時(shí)對木脂素提取率的影響。

        1.2.2.3提取溫度 準(zhǔn)確稱取粉碎后的五味子粉末5.000 g(5份),按1 g ∶ 10 mL的料液比加入90%乙醇溶液,提取時(shí)間為 3 h,提取2次,考察提取溫度分別為55、65、75、85、95 ℃時(shí)對五味子木脂素提取率的影響。

        1.2.3 Box-Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗(yàn)的設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,精確稱取5.000 g五味子粉末,以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)3個(gè)因素為自變量,以五味子木脂素提取率為響應(yīng)值,按Design-Expert 8.0.5中 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,共設(shè)計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)、12個(gè)分析點(diǎn)、5個(gè)0點(diǎn)以估計(jì)誤差,進(jìn)行相應(yīng)曲面的分析試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析見表1。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 五味子木脂素提取單因素試驗(yàn)

        2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對五味子木脂素提取率的影響 由圖1可知,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,木脂素的提取率逐漸增加,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過70%時(shí),五味子木脂素提取率增加的幅度逐漸降低。這主要是由于木脂素為脂溶性成分,根據(jù)相似相溶原理,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,溶解度增加。

        2.1.2 提取時(shí)間對五味子木脂素提取率的影響 由圖2可知,隨著提取時(shí)間的延長,木脂素的提取率也在逐漸增加,時(shí)間超過210 min后,木脂素的提取率趨于平穩(wěn)。這主要是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的延長,部分木脂素成分發(fā)生降解。

        2.1.3 提取溫度對五味子木脂素提取率的影響 由圖3可知,隨著提取溫度的升高,五味子木脂素的提取率逐漸增加,當(dāng)提取溫度超過85 ℃時(shí),木脂素的提取率趨于平穩(wěn)。這主要是因?yàn)殡S著提取溫度的提高,部分木脂素成分發(fā)生降解。

        2.2 Box-Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗(yàn)的設(shè)計(jì)

        2.2.1 木脂素提取試驗(yàn)方案及方差分析 利用Design-Expert 8.0.5軟件對表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元擬合,得到木脂素提取率(Y)對乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)的二次多項(xiàng)模型方程Y=0.440+0.080A+0.110B+ 0051C+0.034AB+0.021AC+0.034BC-0.045A2-0011B2- 0.120C2。對該模型進(jìn)行方差分析,具體結(jié)果見表3。

        從表3可以看出,模型的F=227.31、P<0.000 1,表明模型對提取工藝影響極顯著。R2=0.996 6,變異系數(shù)(CV)=3.92%,R2adj=0.992 2,表明模擬程度良好,試驗(yàn)誤差較小,模型相關(guān)度良好。模擬一次項(xiàng)A、B、C對五味子木脂素提取率均有顯著影響,交互項(xiàng)中AB、AC、BC對五味子木脂素提取率均有顯著影響,二次項(xiàng)中A2、B2、C2對五味子木脂素提取率也有顯著影響。根據(jù)回歸方程中的各項(xiàng)系數(shù)及表3回歸方程中的方差結(jié)果可知,在所選因素范圍內(nèi),各個(gè)因素對五味子木脂素提取率的影響順序?yàn)樘崛r(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取溫度。

        根據(jù)擬合的二項(xiàng)式方程,采用Design-Expert 8.0.5軟件分別繪制三維效應(yīng)圖,考察各自變量對五味子木脂素提取工藝的影響,具體見圖4。由圖4可知,響應(yīng)曲面的坡度均較陡峭,呈現(xiàn)鐘罩狀,表明所考察的3個(gè)因素(乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取[CM(25]時(shí)間、提起溫度)兩兩交互作用對五味子木脂素提取得率

        均有明顯影響。以上對響應(yīng)面圖的分析結(jié)果與表3的方差分析結(jié)果一致。

        2.3 五味子木脂素提取驗(yàn)證試驗(yàn)

        通過Design Expert 8.0.5軟件分析,得到最佳的提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)90%,提取溫度83.02 ℃,提取時(shí)間23222 min,五味子木脂素的最高得率為0.539 6%??紤]到實(shí)際生產(chǎn)需要,將工藝參數(shù)調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)90%,提取溫度83 ℃,提取時(shí)間232 min。按照修正后的條件進(jìn)行提取,平均提取率為0.536 1%,與預(yù)測值無明顯差異。

        3 結(jié)論與討論

        木脂素類化合物是五味子中主要的藥效成分,從20世紀(jì)40年代起至今的70多年中,國內(nèi)外學(xué)者對五味子的研究最為活躍。尤其是中國學(xué)者以五味子中的聯(lián)苯環(huán)辛二烯類木脂素為先導(dǎo)化合物,創(chuàng)制了擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗肝炎新藥-聯(lián)苯雙酯、雙環(huán)醇的研發(fā)工作最為出色,取得了顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。因此,對木脂素的提取工藝研究具有重要意義。

        常壓乙醇提取雖是屬于比較傳統(tǒng)的提取方法,但在實(shí)際生產(chǎn)過程中,卻是很多企業(yè)和研究學(xué)者常用的提取方法,具有簡單易行、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。響應(yīng)曲面優(yōu)化法從三維空間出發(fā),通過因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)表達(dá),找出整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合方式及響應(yīng)面的最優(yōu)值。本研究以五味子中4種含量高的木脂素為測定指標(biāo),利用Box-Behnken響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化五味子中木脂素的提取工藝參數(shù)。通過本研究篩選得到的工藝參數(shù)為五味子木脂素的工業(yè)化提取和臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

        參考文獻(xiàn):

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