金銀萍+王博+劉興醫(yī)+逄世峰+薛禹臣+王英平

摘要： 以五味子果實(shí)為原料，研究五味子木脂素的最佳提取工藝條件。以木脂素提取率為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間對五味子木脂素提取率的影響。結(jié)果表明，冷凝回流法提取五味子木脂素的最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、提取溫度83 ℃、提取時(shí)間232 min，五味子木脂素的提取率為0.54%；采用Box-Behnken響應(yīng)曲面法建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性好、穩(wěn)定可行，可作為五味子木脂素提取的生產(chǎn)工藝。

關(guān)鍵詞： 五味子；木脂素；單因素試驗(yàn)；冷凝回流；響應(yīng)曲面分析；冷凝回流法；提取工藝

中圖分類號(hào)： R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）22-0210-03

五味子[Schisandra chinensis （Turcz.） Baill.]為木蘭科五味子屬多年生落葉藤本植物，為著名的滋補(bǔ)和安神鎮(zhèn)靜中藥，已有2 000多年的臨床應(yīng)用歷史。五味子的主要成分為木脂素、三萜、揮發(fā)油、多糖等[1]，其中主要的藥效成分為木脂素，具有保肝、抑制中樞神經(jīng)、抗衰老、抗腫瘤等多種藥理活性[2]。近年來，有關(guān)五味子木脂素提取工藝的文獻(xiàn)有很多，以正交試驗(yàn)方法較為常見，但篩選得到的結(jié)果差異性大、重復(fù)性差[3-4]。

響應(yīng)曲面法（response surface method，簡稱RSM）是一種通過對響應(yīng)曲面及等高線進(jìn)行分析并尋求最優(yōu)工藝參數(shù)的方法，采用多元二次回歸方程擬合響應(yīng)值與因素之間函數(shù)關(guān)系的一種優(yōu)化統(tǒng)計(jì)方法[5-6]。該方法在木脂素提取工藝方面的研究報(bào)道較少，而且主要針對的是超聲波輔助提取，且是在沒有單因素的考察基礎(chǔ)上進(jìn)行的，缺乏整體系統(tǒng)性及科學(xué)性[7-10]。本研究首次采用冷凝回流的提取方法，以五味子中含量高的4種木脂素含量為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選五味子木脂素的提取工藝，為五味子木脂素類成分的工業(yè)化提取提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；CPA225D電子天平（德國Sartorius公司）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；SF-TDL-4A離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司）。

五味子果實(shí)采自吉林左家特產(chǎn)研究所資源圃，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所艾軍研究員鑒定為木蘭科五味子屬植物的果實(shí)。五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素（中國食品藥品檢定研究所，批號(hào)分別為110857、110764、110765）；五味子醇乙（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)為YY90208）。乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 五味子中木脂素含量的測定

1.2.1.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫程序?yàn)?～1.0 min，48%～50%A；1.0～3.0 min，50%～70%A；3.0～4.5 min，70%～95%A；4.5～6.5 min，95%A；65～7.0 min，95%～48%A；7.0～9.0 min，48%A；柱溫 35 ℃，樣品溫度15 ℃，檢測波長254 nm，流速 0.35 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。

1.2.1.2 供試品溶液的制備 五味子果實(shí)低溫干燥，粉碎過80～100目篩，精確稱取5.000 g原料粉末，按照表1試驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件進(jìn)行乙醇回流提取，過濾，合并濾液，4 500 r/min離心10 min，取上清液，用乙醇溶液定容至100 mL容量瓶內(nèi)，經(jīng)022 μm微孔濾膜過濾，高效液相檢測分析。

1.2.1.3 對照品溶液的制備 精確稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素對照品適量，置于10 mL容量瓶內(nèi)，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得到質(zhì)量濃度分別為113.6、62.0、36.8、62.0 μg/mL的混合對照品溶液。

1.2.1.4 線性關(guān)系考察 將混合對照品溶液用甲醇溶液稀釋成系列濃度梯度，依次進(jìn)入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各木脂素的回歸方程，具體結(jié)果見表2。

1.2.1.5 精密度 取供試品溶液按“1.2.1.1”節(jié)色譜條件連續(xù)測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面積的RSD分別為0.49%、039%、0.63%、0.48%（n=6），表明儀器精密度良好。

1.2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試樣品溶液，分別放置0、

2、4、8、12、24 h后進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算木脂素含量。結(jié)果顯示，供試樣品液中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素含量的RSD分別為0.89%、0.76%、1.02%、1.23%（n=6）。結(jié)果表明，供試樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試樣品溶液6份，按“1.2.1.1”色譜條件測定，測得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素峰面積的RSD分別為0.72%、0.49%、1.13%、0.97%，表明本方法的重復(fù)性良好。

1.2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取混合對照品適量，加入已知含量的同一批五味子粉末5.000 g中，按照“1.2.1.1”色譜條件和“1.2.1.2”供試品制備方法進(jìn)行檢測分析。結(jié)果顯示，五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素的平均加樣回收率分別為101.9%、98.6%、101.3%、97.9%，RSD值分別為2.8%、3.1%、1.7%、2.5%（n=6）。endprint

1.2.2 五味子木脂素提取單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 準(zhǔn)確稱取粉碎后的五味子粉末5000 g（5份），按1 g ∶ 10 mL的料液比加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，提取溫度為90 ℃，提取時(shí)間為3 h，提取2次，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%時(shí)對五味子木脂素提取率的影響。

1.2.2.2 提取時(shí)間 準(zhǔn)確稱取粉碎后的五味子粉末5.000 g（5份），按1 g ∶ 10 mL的料液比加入90%乙醇溶液，提取溫度為90 ℃，提取2次，考察提取時(shí)間分別為30、90、150、210、270 min 時(shí)對木脂素提取率的影響。

1.2.2.3提取溫度 準(zhǔn)確稱取粉碎后的五味子粉末5.000 g（5份），按1 g ∶ 10 mL的料液比加入90%乙醇溶液，提取時(shí)間為 3 h，提取2次，考察提取溫度分別為55、65、75、85、95 ℃時(shí)對五味子木脂素提取率的影響。

1.2.3 Box-Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗(yàn)的設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，精確稱取5.000 g五味子粉末，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）3個(gè)因素為自變量，以五味子木脂素提取率為響應(yīng)值，按Design-Expert 8.0.5中 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，共設(shè)計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)、12個(gè)分析點(diǎn)、5個(gè)0點(diǎn)以估計(jì)誤差，進(jìn)行相應(yīng)曲面的分析試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 五味子木脂素提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對五味子木脂素提取率的影響 由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，木脂素的提取率逐漸增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過70%時(shí)，五味子木脂素提取率增加的幅度逐漸降低。這主要是由于木脂素為脂溶性成分，根據(jù)相似相溶原理，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，溶解度增加。

2.1.2 提取時(shí)間對五味子木脂素提取率的影響 由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長，木脂素的提取率也在逐漸增加，時(shí)間超過210 min后，木脂素的提取率趨于平穩(wěn)。這主要是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的延長，部分木脂素成分發(fā)生降解。

2.1.3 提取溫度對五味子木脂素提取率的影響 由圖3可知，隨著提取溫度的升高，五味子木脂素的提取率逐漸增加，當(dāng)提取溫度超過85 ℃時(shí)，木脂素的提取率趨于平穩(wěn)。這主要是因?yàn)殡S著提取溫度的提高，部分木脂素成分發(fā)生降解。

2.2 Box-Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗(yàn)的設(shè)計(jì)

2.2.1 木脂素提取試驗(yàn)方案及方差分析 利用Design-Expert 8.0.5軟件對表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元擬合，得到木脂素提取率（Y）對乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）的二次多項(xiàng)模型方程Y=0.440+0.080A+0.110B+ 0051C+0.034AB+0.021AC+0.034BC-0.045A2-0011B2- 0.120C2。對該模型進(jìn)行方差分析，具體結(jié)果見表3。

從表3可以看出，模型的F=227.31、P<0.000 1，表明模型對提取工藝影響極顯著。R2=0.996 6，變異系數(shù)（CV）=3.92%，R2adj=0.992 2，表明模擬程度良好，試驗(yàn)誤差較小，模型相關(guān)度良好。模擬一次項(xiàng)A、B、C對五味子木脂素提取率均有顯著影響，交互項(xiàng)中AB、AC、BC對五味子木脂素提取率均有顯著影響，二次項(xiàng)中A2、B2、C2對五味子木脂素提取率也有顯著影響。根據(jù)回歸方程中的各項(xiàng)系數(shù)及表3回歸方程中的方差結(jié)果可知，在所選因素范圍內(nèi)，各個(gè)因素對五味子木脂素提取率的影響順序?yàn)樘崛r(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取溫度。

根據(jù)擬合的二項(xiàng)式方程，采用Design-Expert 8.0.5軟件分別繪制三維效應(yīng)圖，考察各自變量對五味子木脂素提取工藝的影響，具體見圖4。由圖4可知，響應(yīng)曲面的坡度均較陡峭，呈現(xiàn)鐘罩狀，表明所考察的3個(gè)因素（乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取[CM（25]時(shí)間、提起溫度）兩兩交互作用對五味子木脂素提取得率

均有明顯影響。以上對響應(yīng)面圖的分析結(jié)果與表3的方差分析結(jié)果一致。

2.3 五味子木脂素提取驗(yàn)證試驗(yàn)

通過Design Expert 8.0.5軟件分析，得到最佳的提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，提取溫度83.02 ℃，提取時(shí)間23222 min，五味子木脂素的最高得率為0.539 6%?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)需要，將工藝參數(shù)調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，提取溫度83 ℃，提取時(shí)間232 min。按照修正后的條件進(jìn)行提取，平均提取率為0.536 1%，與預(yù)測值無明顯差異。

3 結(jié)論與討論

木脂素類化合物是五味子中主要的藥效成分，從20世紀(jì)40年代起至今的70多年中，國內(nèi)外學(xué)者對五味子的研究最為活躍。尤其是中國學(xué)者以五味子中的聯(lián)苯環(huán)辛二烯類木脂素為先導(dǎo)化合物，創(chuàng)制了擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗肝炎新藥-聯(lián)苯雙酯、雙環(huán)醇的研發(fā)工作最為出色，取得了顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。因此，對木脂素的提取工藝研究具有重要意義。

常壓乙醇提取雖是屬于比較傳統(tǒng)的提取方法，但在實(shí)際生產(chǎn)過程中，卻是很多企業(yè)和研究學(xué)者常用的提取方法，具有簡單易行、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。響應(yīng)曲面優(yōu)化法從三維空間出發(fā)，通過因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)表達(dá)，找出整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合方式及響應(yīng)面的最優(yōu)值。本研究以五味子中4種含量高的木脂素為測定指標(biāo)，利用Box-Behnken響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化五味子中木脂素的提取工藝參數(shù)。通過本研究篩選得到的工藝參數(shù)為五味子木脂素的工業(yè)化提取和臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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