陳景鋒+趙志常+高愛平+黃建峰+羅睿雄+劉寬亮+張夢云

摘要： β-胡蘿卜素羥化酶（BCH）基因是催化玉米黃素合成的關(guān)鍵基因，玉米黃素在植物光保護過程中發(fā)揮著重要的作用。采用RACE方法從黃色的金煌芒果的果皮中克隆得到了1個BCH基因，該基因全長cDNA序列為 1 160 bp，開放閱讀框為888 bp，編碼295個氨基酸，分子質(zhì)量為32.97 ku，分子等電點為9.51。利用生物信息學在線分析軟件對其組成成分、疏水性/親水性、二級結(jié)構(gòu)、功能結(jié)構(gòu)域以及三級結(jié)構(gòu)進行預測和分析。通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白與溫州蜜柑、柚子、大豆、草莓等具有較近的親緣關(guān)系。對不同芒果品種的BCH基因的表達進行分析發(fā)現(xiàn)，紅色的貴妃品種中表達量較高，而黃色的金煌品種中表達量較低。

關(guān)鍵詞： 芒果；β-胡蘿卜素羥化酶（BCH）基因；基因克??；基因表達分析；親緣關(guān)系

中圖分類號： Q785；S667.701 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0024-03

β-胡蘿卜素羥化酶（β-carotene hydroxylase，BCH） 基因是催化玉米黃素合成的關(guān)鍵基因。目前，已經(jīng)報道了從擬南芥、甜橙、南豐蜜橘、甜椒等[1-5]植物中克隆到了該基因。由于BCH在類胡蘿卜素生物合成中的關(guān)鍵作用，已成為植物類胡蘿卜素遺傳工程改良中的主要目的基因。芒果類胡蘿卜素生物合成途徑中的 BCH基因分離和鑒定研究國內(nèi)外至今未見報道，BCH在芒果類胡蘿卜素生物合成途徑中具體作用和功能目前還不清楚。本研究中克隆并分析了芒果BCH基因，為進一步研究BCH在芒果果實著色上的調(diào)控功能奠定分子基礎，對揭示 BCH基因在芒果類胡蘿卜素合成及果色形成中的作用具有重要理論意義，為進一步創(chuàng)制高胡蘿卜素含量新種質(zhì)資源、開展芒果類胡蘿卜素品質(zhì)育種提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

分別用刀片切取桂七芒果完全成熟的綠果皮、金煌芒果完全成熟的黃色果皮、貴妃芒果完全成熟的紅色果皮，切碎放入采樣袋中液氮速凍后，立即放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 芒果果皮總RNA提取 采用植物RNA提取試劑盒提取芒果果皮總RNA，用DNase試劑盒進行基因組DNA消除，RNase-free無菌水溶解，采用SMARTerTM RACE Amplification Kit（Clontech）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.2 PCR擴增反應 擴增條件為：94 ℃ 4 min；94 ℃ 50 s，50 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。 反應體系為25 μL，其中含10×PCR buffer（含Mg2+） 2.5 μL、25 ng DNA模板、20 μmol引物、1.0 U Taq DNA聚合酶、5.0 mmol dNTPs。

1.3 BCH基因全長cDNA序列的獲得

以合成的 cDNA 為模板，根據(jù)已知的BCH基因片段設計cDNA 3′-RACE和5′-RACE引物，進行3′和5′端的擴增。將目的基因片段回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定及測序，并根據(jù)得到的cDNA 3′ 端和5′末端的序列結(jié)果拼接BCH的全長cDNA，設計特異引物，進行全長cDNA序列的擴增。

1.4 BCH基因生物信息學分析

根據(jù)BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）登錄的BCH蛋白序列進行氨基酸序列的同源性分析，用DNAMAN軟件進行序列多重比對，并繪制系統(tǒng)進化樹推斷其在進化過程中親緣關(guān)系。采用bioedit軟件對BCH蛋白中各個氨基酸的含量、親水/疏水性進行了分析。WoLFPSORT（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）軟件進行定位預測，采用Swissmodel（http：//swissmodel.expasy.org/）蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測。

1.5 表達分析

分別提取桂七、金煌、貴妃芒果果皮的RNA，反轉(zhuǎn)為cDNA 并采用Primer 5.0設計引物進行RT-PCR的擴增。RT-PCR分析采用的內(nèi)參引物序列為：actin-F，5′-AATGG AACTGGAATGGTCAAGGC-3′；actin-R，5′-TGCCAGATCT TCTCCATGTCATCCCA-3′。目的基因擴增采用的引物為：BCH-F，5′ -CAGCATAGCCCATATAGCACTC-3′；BCH-R，5′-CAATGGAGCCGATATAAAACTAT-3′。PCR 產(chǎn)物在10%瓊脂糖凝膠上進行電泳，并采用Quantity One 軟件進行數(shù)據(jù)分析，作出相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 BCH基因的獲得

根據(jù)得到金煌芒果BCH基因的3′端和5′端序列信息進行拼接，最后得到BCH基因的全長cDNA序列。設計特異引物，進行全長cDNA序列擴增，將電泳條帶回收測序后得到BCH基因的cDNA全長序列，為1160 bp，分析發(fā)現(xiàn)開放閱讀框為 888 bp，編碼295個氨基酸序列。通過NCBI上已經(jīng)登錄的擬南芥、柚子、大豆、葡萄的BCH蛋白序列進行了比對（圖1），發(fā)現(xiàn)克隆的基因為BCH基因。

2.2 部分生物信息學分析

采用bioedit軟件對芒果BCH蛋白中各個氨基酸的含量進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白丙氨酸（Ala）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）和纈氨酸（Val）的含量較高（圖2），用NCBI 上的CDD（conserved domain database，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）數(shù)據(jù)庫分析其氨基酸序列中可能有的蛋白功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明該蛋白有1個典型的FA-hydroxylase superfamily（脂肪酸羥化酶超家族） 保守結(jié)構(gòu)域（圖3）。對其蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預測，發(fā)現(xiàn)芒果BCH蛋白的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和β-折疊為主，也具有少量的α-螺旋結(jié)構(gòu)（圖4）。采用bioedit軟件的Kyte 和Doolittle 算法對BCH蛋白的親水性/疏水性（正值表示疏水性，負值表示親水性）進行分析，BCH蛋白所含的氨基酸主要介于2.4～-2.3之間（圖5），采用WoLFPSORT（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）軟件對BCH蛋白進行定位預測，發(fā)現(xiàn)該基因定位在葉綠體中，采用Swissmodel（http：//swissmodel.expasy.org/）在線軟件對蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預測，推導出該蛋白可能的三級結(jié)構(gòu)構(gòu)型（圖6）。采用DNAMAN軟件進行親緣關(guān)系聚類分析發(fā)現(xiàn)，芒果BCH蛋白與溫州蜜柑、柚子、大豆等植物的蛋白序列聚為一類（圖7）。endprint

2.3 BCH基因的RT-PCR分析

分別提取桂七、金煌、貴妃這3種不同著色品種芒果果皮的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過上述RT-PCR分析的引物進行擴增，對擴增結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)，該基因在紅色品種貴妃的果實中表達較多，綠色品種的桂七果皮中次之，而黃色品種的金煌果皮中相對表達較少（圖8），初步推斷BCH基因可能與紅色品種的貴妃果實中的類胡蘿卜素合成有密切的關(guān)系。

3 討論

BCH是玉米黃素生物合成的重要基因，基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征決定其基因的功能和性質(zhì)。通過對幾個物種的BCH蛋白的比對發(fā)現(xiàn)芒果BCH蛋白含有BCH蛋白家族相同的保守序列，即含有一個脂肪酸羥化酶超家族保守結(jié)構(gòu)域，前人通過對擬南芥、玉米、水仙等研究發(fā)現(xiàn)，也含有相同的保守結(jié)構(gòu)域，亞細胞定位發(fā)現(xiàn)該基因定位于葉綠體中[6]，這與本研究結(jié)果相一致。通過聚類分析表明，芒果BCH基因與柑橘類具有較近的親緣關(guān)系。對其表達分析發(fā)現(xiàn)，紅色的貴妃品種中表達量較高， 而黃色的金煌品種中表達量較低。孫化雨等對毛竹的根、幼莖、葉片、葉鞘、節(jié)等部分的表達分析發(fā)現(xiàn)，BCH基因主要在葉片中表達，而根中表達量較少[7]；對轉(zhuǎn)基因擬南芥分析發(fā)現(xiàn)，葉片中葉綠素、葉黃素、類胡蘿卜素等含量升高，表明在毛竹中BCH基因的過量表達促進了類胡蘿卜素向玉米黃素轉(zhuǎn)化，使其含量增加，抗脅迫能力增加[8-9]。本研究從金煌芒果果皮中克隆得到了1個BCH基因，對該基因在芒果中的功能研究還須要進一步通過轉(zhuǎn)基因驗證其功能及在對芒果果實色澤形成的作用機理，為深入理解芒果果實色澤形成多樣性的原因提供理論依據(jù)，并為生產(chǎn)中著色不良成因提供改善的技術(shù)支持。

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