張玉霞，袁小遠(yuǎn)，孟 凱，王友令

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 家禽研究所，山東 濟(jì)南 250100)

新城疫病毒在雞胚成纖維細(xì)胞中的培養(yǎng)及純化

張玉霞，袁小遠(yuǎn)，孟 凱，王友令

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 家禽研究所，山東 濟(jì)南 250100)

利用雞胚成纖維細(xì)胞對(duì)新城疫毒株GM0511株進(jìn)行增殖培養(yǎng)和蝕斑法純化，通過(guò)對(duì)最適細(xì)胞密度、病毒最佳接種濃度、覆蓋瓊脂糖濃度、蝕斑形成時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化摸索，最終獲得產(chǎn)斑時(shí)間一致，蝕斑大小一致、出斑整齊的純化新城疫毒株，并使原病毒血凝效價(jià)提高2個(gè)滴度，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

新城疫病毒； 雞胚成纖維細(xì)胞； 蝕斑純化

近年來(lái)，科研工作者在新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)遺傳變異、進(jìn)化流行趨勢(shì)及疫苗開(kāi)發(fā)利用等方面做了大量的工作，而獲取大量純化的NDV的流行株是開(kāi)展這些工作的基礎(chǔ)與前提。研究發(fā)現(xiàn)，由于疫苗的普遍使用和野毒株的廣泛存在，從臨床發(fā)病雞體內(nèi)分離到的NDV毒株混合現(xiàn)象非常普遍[1]。因此，對(duì)多種新城疫毒株進(jìn)行簡(jiǎn)單有效的分離和純化是當(dāng)前必須面對(duì)的問(wèn)題，用雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)進(jìn)行蝕斑純化是一種有效的手段被廣泛使用。本試驗(yàn)為進(jìn)一步提高毒株的純化效果，以本實(shí)驗(yàn)室分離到的新城疫GM0 811株為母毒株，從CEF密度、病毒接種濃度、瓊脂糖使用濃度等幾個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化摸索，為獲得理想的純化ND毒株和后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

9～10日齡SPF雞胚，來(lái)自山東省家禽研究所SPF雞場(chǎng)。新城疫病毒GM0 811株為本科室自行分離，經(jīng)HA及HI實(shí)驗(yàn)鑒定為新城疫病毒。一次性6孔細(xì)胞培養(yǎng)板來(lái)自美國(guó)康寧公司；0.22 μm針孔濾器來(lái)自Millipore公司。DMEM高糖培養(yǎng)液、0.25%胰酶及小牛血清均為Hyclone產(chǎn)品；瓊脂糖為Oxoid 100 g原裝產(chǎn)品；0.1%中性紅溶液、2×MEM溶液液等其他所需溶液均為自行配制。

1.2 方法

1.2.1 雞胚成纖維細(xì)胞制備

根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)[2-3]，取發(fā)育良好的9～10日齡SPF雞胚，無(wú)菌去殼取胚體，并依此剪掉頭、四肢及內(nèi)臟，用無(wú)菌PBS溶液漂洗3次，去除紅細(xì)胞。用無(wú)菌眼科剪將洗凈的胚體剪碎，倒入適量的0.25%胰酶37 ℃水浴消化約30 min，期間搖晃震蕩數(shù)次，觀察消化液呈白色粘稠狀有拉絲現(xiàn)象時(shí)，可置入含5%血清的DMEM培養(yǎng)液中終止消化，充分吹打分散細(xì)胞團(tuán)塊，用200目細(xì)胞篩過(guò)濾，可得到雞胚成纖維細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)后稀釋成5×105個(gè)·mL-1后，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔接種5 mL混勻的細(xì)胞懸液。置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)。

1.2.2 接毒濃度摸索

將鑒定合格的新城疫尿囊液凍融3次，用一次性0.22 μm針孔濾器過(guò)濾，用DMEM高糖培養(yǎng)液將病毒液10倍倍比稀釋成10-1～10-10靜置待用[4-5]。將長(zhǎng)成良好細(xì)胞單層的雞胚成纖維細(xì)胞棄去原培養(yǎng)液，用無(wú)菌PBS洗滌2次以去除殘留的血清，將稀釋好的病毒液10-1～10-10分別加入2個(gè)6孔培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度1孔，每孔0.9 mL，最后一孔加等量的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液做對(duì)照。置入37 ℃ CO2培養(yǎng)箱吸附1 h，期間每隔15 min搖晃1次，使之均勻接觸細(xì)胞。1 h后，吸棄病毒液，PBS洗去未吸附的病毒粒子。

1.2.3 瓊脂糖覆蓋液的準(zhǔn)備

預(yù)先準(zhǔn)備好A液和B液。配方如下。A液(100 mL)：pH值7.2的2×MEM溶液95 mL，小牛血清 5.0 mL，混勻過(guò)濾，置37 ℃預(yù)熱。B液(100 mL)：根據(jù)參考文獻(xiàn)共準(zhǔn)備4個(gè)濃度，1.6 g、1.8 g、2.0 g、2.2 g瓊脂糖，分別溶于100 mL的PBS液中，121.3 ℃高壓滅菌15 min后，在液體狀態(tài)下置56 ℃水浴待用。將預(yù)熱的A液分別與B液分別取等量混合，制成4種不同濃度的瓊脂糖最終覆蓋液，每種濃度加入一塊上述處理好的6孔培養(yǎng)板中，2 mL每孔，操作過(guò)程中盡量避免氣泡產(chǎn)生。待覆蓋液冷卻凝固后置37 ℃的CO2培養(yǎng)箱，并逐日觀察細(xì)胞病變(cytopathic effect，CPE)。

1.2.4 蝕斑染色

待出現(xiàn)CPE時(shí)，向各培養(yǎng)板中加第2層含0.01%中性紅的瓊脂糖，每孔1 mL，操作同上。凝固后，將培養(yǎng)板倒置，放入37 ℃ CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，4 h或過(guò)夜后觀察細(xì)胞蝕斑情況。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)特性觀察并挑斑

待培養(yǎng)板中出現(xiàn)清晰的蝕斑時(shí)，將200 μL槍頭剪去頭部高壓滅菌，選擇蝕斑數(shù)較少，斑與斑間距較大的平板進(jìn)行底部標(biāo)記，連同瓊脂糖一起吸取并置入1 mL PBS溶液中，搖晃分散，凍融3次，3 000 r·min-1離心10 min，取上清，記為Clone1，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。將Clone1毒株稀釋后再次按上述方法接種雞胚成纖維細(xì)胞，蝕斑純化3次。并分別將純化后的病毒接種SPF雞胚，對(duì)其收獲的尿囊液進(jìn)行常規(guī)HA效價(jià)檢測(cè)。

2 結(jié)果

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，制備的分散細(xì)胞懸液過(guò)夜后可長(zhǎng)成形態(tài)均勻的細(xì)長(zhǎng)型雞胚成纖維細(xì)胞，并基本鋪滿培養(yǎng)板底部。接種病毒的時(shí)間依據(jù)細(xì)胞具體情況而定，太早細(xì)胞層太薄容易脫落，太遲則可能影響蝕斑形成。本試驗(yàn)在細(xì)胞培養(yǎng)24 h左右接種病毒，覆蓋中性紅瓊脂糖過(guò)夜后則形成了可見(jiàn)的蝕斑(圖1)。不同濃度的病毒液接種細(xì)胞后蝕斑形成情況差異較大，和病毒滴度成正相關(guān)，濃度越高，蝕斑越多，甚至連成片，滴度越低，蝕斑越少。瓊脂糖的濃度對(duì)本實(shí)驗(yàn)的操作也至觀重要，太稀則不宜凝固，太濃則凝固過(guò)快不能形成均勻薄層。本實(shí)驗(yàn)接種的新城疫毒株GM0811第一次接種后形成大小不等的蝕斑，出斑時(shí)間不一。第三次克隆后10-5病毒液接種均能出現(xiàn)清晰的紅色蝕斑，出斑時(shí)間一致，大小整齊，各斑間距1 cm左右。純化后病毒接種雞胚復(fù)壯后后，血凝HA效價(jià)從原來(lái)的7log2左右提高到9log2，雞胚死亡時(shí)間集中，血凝效價(jià)穩(wěn)定。

圖1 GM0 811株在CEF細(xì)胞上的增殖

3 討論

3.1 最佳細(xì)胞濃度

雞胚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快，以長(zhǎng)成密度稍高的單層為佳，太空了在洗滌時(shí)細(xì)胞層容易從培養(yǎng)板上脫落，或者因無(wú)細(xì)胞形成的空洞與病毒形成的蝕斑較易混淆。密度太高了則容易多層細(xì)胞積聚在一起，導(dǎo)致有蝕斑形成的地方可能會(huì)因底層細(xì)胞沒(méi)有感染而無(wú)法形成可見(jiàn)蝕斑。

3.2 病毒最佳接種稀釋倍數(shù)

最佳稀釋倍數(shù)需要根據(jù)病毒毒力進(jìn)行摸索調(diào)整，一般蝕斑形成能力與毒力成正相關(guān)，毒力越強(qiáng)的病毒蝕斑形成能力越強(qiáng)，如果接種稀釋倍數(shù)過(guò)低，則蝕斑形成太大，容易連成片，不好進(jìn)行挑斑，如果毒力較弱，而接種稀釋倍數(shù)過(guò)高，則不宜形成蝕斑，無(wú)法進(jìn)行病毒純化。先摸索感染稀釋度，毒價(jià)較低的時(shí)候，適當(dāng)降低稀釋倍數(shù)，這與文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]相一致。低毒力的新城疫毒株在復(fù)制時(shí)，前體糖蛋白F0敏感性較低，裂解為F1和F2的能力較弱，加入適量的胰酶可增強(qiáng)病毒粒子的感染性，因此，可以在覆蓋瓊脂中加入適量的胰酶或鎂離子增強(qiáng)細(xì)胞的蝕斑形成能力。

3.3 瓊脂糖最佳濃度

瓊脂糖是從瓊脂中去除了對(duì)細(xì)胞有害的物質(zhì)后提煉而來(lái)，能將病毒粒子固定于某個(gè)位置形成局限性病灶。瓊脂糖的濃度配比對(duì)蝕斑純化實(shí)驗(yàn)操作較大影響，濃度過(guò)高則在操作過(guò)程中凝固過(guò)快，過(guò)低則凝固過(guò)慢，均影響實(shí)驗(yàn)操作。不同廠家生產(chǎn)的瓊脂糖硬度也不同，本實(shí)驗(yàn)所用以1.8%最佳。

蝕斑技術(shù)主要用于病毒的純化，其原理是由于病毒的遺傳變異，一般的病毒株都是由許多特性不一的病毒粒子組成的混雜群體，通過(guò)蝕斑技術(shù)，選育出性狀相同、產(chǎn)斑條件和產(chǎn)斑時(shí)間相同的克隆株，來(lái)保證所需毒株的免疫原性及毒力特性穩(wěn)定。該技術(shù)適用于多種病毒的純化。在具體的毒株純化操作中，要根據(jù)毒株毒力不同，混合情況不同，所用試劑供應(yīng)廠家不同等對(duì)實(shí)驗(yàn)條件逐步進(jìn)行優(yōu)化摸索。

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2017-09-29

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院青年科研基金(2014QNM15；2015YQN61；2016YQN56)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2015CM009)。

張玉霞(1981—)，女，山東聊城人，助理研究員，碩士，主要從事禽病防治研究工作，Email: zyx1981_2007@163.com。

文獻(xiàn)著錄格式：張玉霞，袁小遠(yuǎn)，孟凱，等. 新城疫病毒在雞胚成纖維細(xì)胞中的培養(yǎng)及純化[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(12)：2265-2267.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171257

S858.32

A

0528-9017(2017)12-2265-03

萬(wàn) 晶)