劉玉華，陳光明

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

鴨巴氏桿菌病油佐劑滅活苗的研制

劉玉華，陳光明

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

為研究利用當(dāng)?shù)胤蛛x菌株制備鴨巴氏桿菌病疫苗的方法，本試驗(yàn)從泰州地區(qū)疑似巴氏桿菌病的病死鴨中分離出巴氏桿菌，經(jīng)鑒定合格后作為菌種。用馬丁肉湯培養(yǎng)后獲得菌液，甲醛滅活，加油佐劑制成鴨巴氏桿菌油佐劑滅活苗。無菌檢驗(yàn)，安全檢驗(yàn)合格；效力檢驗(yàn)中，免疫接種劑量為1 mL時(shí)，免疫保護(hù)率為100%，表明本次所制備疫苗安全有效。

鴨； 巴氏桿菌； 油佐劑； 滅活苗

鴨巴氏桿菌病又名鴨霍亂、鴨出血性敗血癥，是一種由多殺性巴氏桿菌引起的鴨的急性敗血性傳染病，也是危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要細(xì)菌性傳染病之一[1]。該病原多殺性巴氏桿菌易產(chǎn)生耐藥性，給抗生素治療帶來困難；另一方面，多殺性巴氏桿菌血清型眾多，各地流行菌株的血清型有較大差異，而且不同血清型的菌株之間交叉保護(hù)效果差[2]。因此購買的疫苗經(jīng)常對當(dāng)?shù)亓餍芯甑拿庖咝Ч焕硐?，?dǎo)致各地鴨巴氏桿菌病時(shí)有發(fā)生，給養(yǎng)殖戶帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。本研究旨在探討江蘇泰州鴨巴氏桿菌分離株滅活苗的制備方法及對鴨的免疫效果，為臨床預(yù)防本病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

病料來自江蘇省泰州地區(qū)某養(yǎng)鴨場送檢的疑似巴氏桿菌病死鴨。

60日齡未接種巴氏桿菌疫苗的健康易感鴨和74日齡未接種巴氏桿菌疫苗的健康易感鴨均由泰州某養(yǎng)鴨場提供。

主要試劑：麥康凱瓊脂粉、營養(yǎng)瓊脂、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管等，均由杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)；改良馬丁培養(yǎng)基由青島海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；白油由上海哈斯太潤滑有限公司生產(chǎn)；甲醛由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

主要儀器：全自動微機(jī)型立式壓力蒸汽滅菌器、恒溫振蕩培養(yǎng)箱均購自河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；數(shù)顯隔水式不銹鋼電熱恒溫培養(yǎng)箱購自德州市富凱化工有限公司；醫(yī)用型潔凈工作臺購自上海嘉鵬科技有限公司。

1.2 菌株分離鑒定

剖檢疑似巴氏桿菌病死鴨，無菌采集肝、脾等病料，接種于鮮血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板，37 ℃溫箱中培養(yǎng)18～24 h，挑取典型單菌落進(jìn)行瑞氏染色、革蘭氏染色，分別鏡檢。對分離菌進(jìn)行純培養(yǎng)，將純培養(yǎng)物接種于微量生化反應(yīng)管，進(jìn)行生化試驗(yàn)。

1.3 菌種毒力測定

將分離鑒定好的巴氏桿菌菌株接種于馬丁肉湯(含0.1%血紅素，1.0%血清)中，37 ℃培養(yǎng)24 h，菌液用馬丁肉湯稀釋成20、200、2 000、20 000 mL-14個(gè)不同濃度。15只74日齡健康鴨隨機(jī)分成5組，每組3只。1～4組鴨分別肌肉接種上述4 個(gè)濃度的菌液，每只肌肉接種0.5 mL。第5組鴨為對照組，每只肌肉接種0.5 mL生理鹽水，觀察7～10 d，記錄各組發(fā)病死亡情況。

1.4 疫苗制備

1.4.1 細(xì)菌懸液的制備

將巴氏桿菌菌種劃線接種于血瓊脂平板上，37 ℃孵育18 h后，挑取灰白色、圓形、濕潤、露珠狀菌落接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基中[4]，37 ℃培養(yǎng)18 h，按照《獸藥典》的方法進(jìn)行純粹性檢驗(yàn)[5]，合格后作為種子液。將上述種子液按培養(yǎng)基總量的2%接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，收集菌液。對菌液進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，將菌液濃度調(diào)整為3×1010mL-1。

1.4.2 菌液滅活

按菌液體積加入終濃度為0.3%的甲醛溶液，于37 ℃溫箱中滅活48 h，滅活期間振蕩數(shù)次。滅活結(jié)束，取少量菌液接種于血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，進(jìn)行滅活檢驗(yàn)。

1.4.3 乳化配苗

每96份滅活菌液中加入4份吐溫-80，充分振蕩，使吐溫-80完全溶解，為水相。按10號白油94 mL，硬脂酸鋁2 g，Span-80 6 mL的比例混合均勻，高壓滅菌，冷至室溫，為油相。將油相與水相按體積比1∶1的比例混合，經(jīng)組織搗碎機(jī)充分乳化即成油佐劑滅活苗[6]。

1.5 疫苗質(zhì)量檢驗(yàn)

1.5.1 物理性狀檢驗(yàn)

取一清潔吸管吸取少量疫苗滴于冷水中，觀察疫苗分散情況，檢驗(yàn)疫苗劑型。吸取疫苗放于試管內(nèi)，3 000 r·min-1離心15 min，觀察液體分層情況，檢驗(yàn)穩(wěn)定性。用1 mL吸管吸取25 ℃疫苗1 mL，讓其垂直自然流出，記錄流出0.4 mL所需的時(shí)間，檢驗(yàn)黏度。

1.5.2 無菌檢驗(yàn)

按照《獸藥典》中無菌檢驗(yàn)或純粹檢驗(yàn)法進(jìn)行[5]。

1.5.3 安全檢驗(yàn)

取60日齡健康鴨3只，各皮下注射疫苗1 mL，觀察14 d，應(yīng)全部健活。

1.5.4 效力檢驗(yàn)

將15只60日齡健康鴨隨機(jī)分成3組。第1組6只，各皮下接種1 mL疫苗；第2組6只，各皮下接種0.5 mL疫苗;第3組3只，作為對照組，不接種。14 d后，每只鴨各肌肉注射致死量強(qiáng)毒菌液。觀察14 d，記錄各鴨發(fā)病、死亡情況，剖檢病死鴨，觀察病理變化病況。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離鑒定

分離菌株在鮮血瓊脂平板上形成灰白色、圓形、濕潤、露珠狀菌落，有熒光性，不溶血；在麥康凱瓊脂平板上沒有菌落出現(xiàn)。瑞氏染色鏡檢，可見兩極著色、兩端鈍圓的小球桿菌，單個(gè)存在，有時(shí)成雙排列。革蘭氏染色鏡檢結(jié)果為陰性菌。生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，本菌可分解葡萄糖、甘露糖、蔗糖、甘露醇、果糖、山梨醇、半乳糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不發(fā)酵乳糖、肌醇；MR試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)為陰性，能利用硝酸鹽，產(chǎn)生硫化氫。分離菌株的形態(tài)染色特性、培養(yǎng)特性、生化特性符合多殺性巴氏桿菌的特征[7]，判定本試驗(yàn)所分離菌株為鴨多殺性巴氏桿菌。

2.2 菌種毒力

74日齡鴨攻毒后死亡率為100.0%時(shí)，巴氏桿菌最小攻毒菌量是每只鴨肌肉接種菌液0.5 mL，菌液濃度200 mL-1，因此確定巴氏桿菌攻毒劑量為0.5 mL，菌液濃度是200 mL-1。

2.3 疫苗制備

制備的鴨巴氏桿菌油佐劑滅活苗外觀為乳白色制劑，靜置后分層，上層液體微淡黃色，下層有灰白色的沉淀。

2.4 疫苗質(zhì)量

2.4.1 物理性狀

將疫苗滴于冷水中，疫苗不擴(kuò)散，為油包水劑型。疫苗3 000 r·min-1離心15 min后沒有分層，表明穩(wěn)定性良好。用吸管吸取疫苗自然流出0.4 mL所需時(shí)間約5 s，符合油佐劑疫苗的黏度要求(4～6 s)[5]。

2.4.2 無菌檢驗(yàn)

滅活苗接種于TG小管、GA斜面、GP小管中培養(yǎng)，觀察7 d，各培養(yǎng)基中中均無細(xì)菌生長，表明無菌檢驗(yàn)合格。

2.4.3 安全檢驗(yàn)

3只健康鴨接種疫苗后觀察14 d，全部健活，注射部位無腫脹、化膿等不良反應(yīng)，精神、食欲未出現(xiàn)異常，表明研制的疫苗安全性較好。

2.4.4 效力檢驗(yàn)

效力檢驗(yàn)結(jié)果如表1所示。第3組鴨未接種疫苗，攻毒后發(fā)病率、死亡率均為100.0%，剖檢該組病死鴨，表現(xiàn)巴氏桿菌的病變特征，表明對照組結(jié)果可靠。表1顯示，第1組鴨接種疫苗1 mL后，攻毒后發(fā)病率、死亡率均為0，第2組鴨接種疫苗0.5 mL，攻毒后發(fā)病率、死亡率分別為33.3%和16.7%，表明本疫苗免疫劑量為1 mL時(shí)，免疫效果最好。因此確定本疫苗的免疫劑量為1 mL。

表1 滅活苗效力檢驗(yàn)的結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本研究從泰州某鴨場分離鑒定一株巴氏桿菌，用該菌株作為菌種制備的巴氏桿菌油乳劑滅活苗無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)合格，效力檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)疫苗免疫劑量為1.0 mL時(shí)，免疫保護(hù)率為100%。結(jié)果表明本次研制的疫苗在泰州局部地區(qū)使用效果較好，更大范圍的田間試驗(yàn)效果還有待進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

由于鴨巴氏桿菌的血清型眾多，有條件的鴨場應(yīng)進(jìn)行病原的分離，有利于滅活苗的研制，進(jìn)而更有效的預(yù)防鴨巴氏桿菌病[8]。也要對分離的巴氏桿菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，以便篩選高敏藥物治療巴氏桿菌感染，減緩抗生素的耐藥性，減少死亡的發(fā)生。

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[6] 王明俊. 獸醫(yī)生物制品學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 1997.

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2017-09-29

劉玉華(1979—)，女，安徽淮北人，講師，碩士，從事動物疫病的預(yù)防與控制等方面的研究工作，E-mail: 53884696@qq.com。

文獻(xiàn)著錄格式：劉玉華，陳光明. 鴨巴氏桿菌病油佐劑滅活苗的研制[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(12)：2256-2258.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171254

S852.61

A

0528-9017(2017)12-02256-03

萬 晶)