趙蘊(yùn)偉，鄒曉婷，李 爽，梁珊珊，王春玲

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

支氣管哮喘下調(diào)表達(dá)蛋白Annexin-1單克隆抗體的制備及其鑒定①

趙蘊(yùn)偉，鄒曉婷，李 爽，梁珊珊，王春玲

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)制備抗膜聯(lián)蛋白-1(Annexin-1)的特異性單克隆抗體，并對其進(jìn)行鑒定。方法：采用重組免疫蛋白Annexin-1為免疫抗原，對Bal B/c小鼠進(jìn)行免疫，通過常規(guī)雜交瘤技術(shù)將免疫后的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞經(jīng)PEG融合，并間接用ELISA法篩選分泌抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株，對陽性細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆并培養(yǎng)，然后接種于小鼠腹腔，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生腹水，制備Annexin-1單克隆抗體。最后利用ELISA、Western Blot等技術(shù)鑒定所制備的單克隆抗體。結(jié)果：通過雜交瘤技術(shù)獲得5株分泌抗膜聯(lián)蛋白-1的雜交瘤細(xì)胞,分別命名為IA8、ID2、IE2、4E7和5G3,所產(chǎn)抗體,均為IgGI亞型,輕鏈均為k鏈。分泌的5株單克隆抗體均能特異性結(jié)合Annexin-1蛋白。結(jié)論：本研究成功制備并獲得了可穩(wěn)定分泌Annexin-1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株和Annexin-1特異性單克隆抗體，為其制備和臨床檢測奠定了醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)。

Annexin-1；單克隆抗體 ；制備 ；鑒定

膜聯(lián)蛋白(Annexis)是一種磷脂結(jié)合蛋白超家族，而Annexin-1是其中最先被發(fā)現(xiàn)的蛋白，它對細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)的多種生物學(xué)活動(dòng)都起到了一定的調(diào)節(jié)作用。近年來，有關(guān)Annexin-1的研究正在逐漸開展，其中研究最多、最活躍的是炎癥和腫瘤。Annexin-1具有獨(dú)特功能的N端結(jié)構(gòu)域，其相對分子質(zhì)量(Mr)為37×103[1]。相關(guān)研究表明，Annexin-1具有很強(qiáng)的抗炎作用[2]，其抗炎活性的發(fā)揮主要是通過干擾粒細(xì)胞，尤其是防止中性粒細(xì)胞的聚集、遷移及其在炎癥部位活性的發(fā)揮。Annexin-1不僅抑制了炎癥的起始步驟，還可以阻斷許多炎性反應(yīng)復(fù)合物的形成,如PLA2。而PLA2是炎性介質(zhì)合成和釋放過程的關(guān)鍵酶,對炎性反應(yīng)的中心的調(diào)節(jié)起到必不可少的作用。PLA2一旦激活,就能作用于膜磷脂促進(jìn)花生四烯酸的生成,進(jìn)而刺激前列腺素E2和腫瘤壞死因子α的合成,釋放大量炎性介質(zhì)和因子，作用于疾病部位引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生。除此之外，Annexin-1對炎癥的消散作用也很強(qiáng)大，主要是能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡并增加巨噬細(xì)胞的吞噬。Annexin-1還可以削弱中性粒細(xì)胞對內(nèi)皮的黏附作用，使中性粒細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移的功能也相對減退[3]。當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，Annexin-1能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌具有抗炎作用的細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10[4]，讓磷脂酶A2的活性受到抑制，從而使炎性因子的合成減少[5]。在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展過程中，會不同程度地出現(xiàn)Annexin-1表達(dá)水平的改變，因此，可以運(yùn)用Annexin-1抗體對其進(jìn)行早期的診斷，并有助于哮喘的治療。

1 材料和方法

1.1 材料

Bal B/c小鼠，雌性，8周齡，由本校動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供，小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞購置于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，RPMI1640培養(yǎng)液干粉和胎牛血清FBS為Gibco公司產(chǎn)品。羊抗小鼠IgG1和IgG2a-HRP抗體購自Biosource公司。膜聯(lián)蛋白-1抗原由本校實(shí)驗(yàn)室保存。胎牛血清、HAT和HT培養(yǎng)液添加劑、聚乙二醇4000PEG、完全福氏佐劑和不完全福氏佐劑均為Sigma公司產(chǎn)品。硝酸纖維膜和細(xì)胞培養(yǎng)板分別購于美國BIO-RAD公司及Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 Annexin-1蛋白的表達(dá)純化及抗原性鑒定

Annexin-1蛋白的表達(dá)純化按文獻(xiàn)[6]的方法進(jìn)行。采用Western蛋白印跡分析方法對Annexin-1蛋白抗原性進(jìn)行鑒定，用SDS-PAGE分離常規(guī)方法將純化抗原轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，誘導(dǎo)Annexin-1蛋白表達(dá),利用Nl-NTA親和層析柱將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化,最后運(yùn)用SDS-PAGE電泳鑒定蛋白的表達(dá)及蛋白的純度。

1.2.2 動(dòng)物免疫

取適量Annexin-1蛋白抗原于試管中，加入等體積弗氏佐劑，使用5mL注射器將上述試管中的油水混合物反復(fù)抽吸進(jìn)行乳化，使其呈現(xiàn)有油包水的狀態(tài)，再進(jìn)行免疫。選取兩只健康雌性Balb/C小鼠，進(jìn)行多點(diǎn)免疫，共免疫三次，每間隔3周加強(qiáng)免疫1次，每次將乳化好的Annexin-1注射到小鼠背部皮下與腹腔，免疫劑量和部位均不變，每次加強(qiáng)免疫時(shí)改用福氏不完全佐劑，抗原量減到原來的一半。進(jìn)行細(xì)胞融合前3d，將抗原與PBS在不添加任何佐劑的條件下直接混合，并直接注射到小鼠腹腔進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫。第3次免疫后的第10天，抽取小鼠的尾靜脈血100μL/只，離心后取上清液置于干凈的EP管中，在用間接ELISA法檢測小鼠的抗血清效價(jià)，均已達(dá)融合標(biāo)準(zhǔn)。再過10d，注射與初次免疫等劑量的乳化好的抗原 Annexin-1溶液于小鼠脾臟內(nèi)。

1.2.3 細(xì)胞融合及陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選

收集生長狀態(tài)較好且處于對數(shù)生長期的SP2/0細(xì)胞至離心管中離心，將抗血清滴度較高的小鼠窒息致死，抽取全血，無菌條件下取出小鼠脾臟，研磨成細(xì)胞懸液，置于離心管離心，將離心后的SP2/0細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混勻，沿離心管的內(nèi)壁加入1.2mLPEG融合劑，待其充分與細(xì)胞接觸后，再加入45mLMD6無血清培養(yǎng)基，離心后2～3次后棄除上清液，用預(yù)熱的HAT選擇性培養(yǎng)液將融合的細(xì)胞重懸，將融合細(xì)胞懸液平均加到56孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。10d后觀察雜交瘤細(xì)胞的生長狀態(tài)，可以觀察到明顯的單個(gè)細(xì)胞集落，此時(shí)便可開始檢測抗 Annexin-1抗體，采用間接酶聯(lián)免疫吸附法ELISA篩選能分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)過兩次篩選后，最終挑選出陽性細(xì)胞孔，并對其進(jìn)行單克隆化。

1.2.4 亞克隆陽性雜交瘤細(xì)胞株及建株

應(yīng)用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，具體操作為：吸取少許融合后篩選的陽性孔內(nèi)細(xì)胞，用臺盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，將孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)分別調(diào)成5個(gè)/mL、10個(gè)/mL、20個(gè)/mL。用MD6培養(yǎng)基在培養(yǎng)板中加入細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)箱中10d左右，吸取上清液100μL，檢測效價(jià)，計(jì)算其陽性孔率。將檢測的上清液為陽性的細(xì)胞換到18孔細(xì)胞培養(yǎng)板擴(kuò)大培養(yǎng)2～4d，重復(fù)克隆擴(kuò)大培養(yǎng)的陽性細(xì)胞2～3次，當(dāng)陽性孔率達(dá)到100%時(shí)，將克隆化雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存，以此獲得分泌針對單一表位的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。建株，凍存5支以上的細(xì)胞株。

1.2.5 腹水的制備及效價(jià)檢測

選取健壯成年小鼠2只，在注射雜交瘤細(xì)胞前5～7d，預(yù)先向每只小鼠的腹腔注射液體石蠟0.4mL。收集好雜交瘤細(xì)胞后，再用生理鹽水懸浮，然后每1mL鹽水懸浮1～5×106個(gè)細(xì)胞。每只小鼠腹腔注射0.5mL細(xì)胞懸液。當(dāng)小鼠產(chǎn)生大量腹水時(shí)，剖開腹腔，用吸管吸取所有小鼠的腹水。收集完的腹水12000r/min 離心15min，間接ELISA方法測定腹水效價(jià)，加入適量P300(0.5%)于4℃保存。

1.2.6 抗體亞型分析

將待測單克隆抗體用PBS稀釋，并進(jìn)行陰性對照，包被ELISA板，37℃孵育1h；PBS-T洗3次；亞型抗體(Ig A、M、G1、2a、2b和G3)用PBS1:10稀釋，每孔100μL；在室溫條件下反應(yīng)30min；PBS-T洗3次；用0.02%TWEEN-20-PBS1:500稀釋HRP標(biāo)記的二抗，每孔100μL；室溫反應(yīng)15min；用PBS-T洗3次；加入顯色底物緩沖液每孔100μL；室溫避光放置10min；加終止液50μL；用酶標(biāo)儀490nm測定結(jié)果。

1.2.7 Western-Blot法鑒定抗Annexin-1單克隆抗體特異性

將Annexin-1融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，取出電泳凝膠，將一張PVDF膜剪成與凝膠一樣大小，將PVDF膜放在濾紙上，凝膠放在PVDF膜上，進(jìn)行通電，1h后將PVDF膜取出，PBS-T洗3次，加入制備的單克隆抗體，2h后加入山羊抗兔IgG，滴加ECL工作液，放置2min，顯影定影，掃描記錄結(jié)果。

1.2.8 單克隆抗體細(xì)胞株的鑒定

包被抗原，用pH9.6的hr PCT-trx 2μg/mL包板，4℃條件下包被過夜，全自動(dòng)酶標(biāo)板洗滌3次。加入待檢測的腹水上清液，每株細(xì)胞加7個(gè)孔，第一個(gè)孔1：1000稀釋，往下以1：3的梯度進(jìn)行倍比稀釋，在37℃的恒溫中孵育30min，進(jìn)行4次洗板，最后拍干。加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中，加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液，每孔100μL。酶標(biāo)儀OD450讀數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 亞克隆及建株

對第一次融合后篩選得到的陽性細(xì)胞孔，應(yīng)用有限稀釋法進(jìn)行亞克?。唤?jīng)過3次亞克隆陽性率達(dá)100%，最終成功建株5株細(xì)胞，分別命名為IA8、ID2、IE2、4E7和5G3。獲得5株能穩(wěn)定分泌針對Annexin-1的抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

2.2 腹水制備及效價(jià)檢測結(jié)果

10d后收集腹水，2只小鼠共收集6mL，進(jìn)行純化；腹水效價(jià)檢測(包被抗原：Annexin-1，2μg/mL包被，包被量100μL檢測波長：OD450nm)見表1。

表1 ELISA法測定腹水效價(jià)結(jié)果

2.3 抗體亞型鑒定結(jié)果

包被抗原為Annexin-1蛋白100μL，濃度為2μg/mL，檢測波長為450nm。所獲得的5株雜交瘤細(xì)胞IA8、ID2、IE2、4E7和5G3，其亞型鑒定結(jié)果均為IgGI型，輕鏈均為k鏈。

2.4 Western-Blot 鑒定抗Annexin-1單克隆抗體特異性結(jié)果

篩選得到的5株Annexin-1單克隆抗體與自制純化的Annexin-1融合蛋白進(jìn)行Western Blot鑒定，見圖1，五株單抗都與Annexin-1融合蛋白特異性結(jié)合，可確定Annexin-1的特異性抗體。

圖1 Western-Blot鑒定單克隆抗體特異性

3 討論

單克隆抗體的雜交瘤制備技術(shù)是由Milstein和Kohler兩人共同發(fā)明的[7]，他們應(yīng)用目的抗原將小鼠免疫后，取其脾臟細(xì)胞，在體外與培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞相融合，形成B淋巴細(xì)胞雜交瘤，融合的雜交瘤細(xì)胞既能合成和分泌特異性的抗體，又可以在體外培養(yǎng)中“無限增殖和永生”，具備兩種細(xì)胞的所有特性。通過克隆化得到的單克隆細(xì)胞系，可以產(chǎn)生針對特定抗原的高度同質(zhì)抗體，即單克隆抗體，此抗體具有較高的特異性、親合力及效價(jià)，在多個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域，如抗原的鑒定、分離、清除、活化和檢測等得到廣泛應(yīng)用。目前單克隆抗體的研究與發(fā)展已進(jìn)入臨床實(shí)用階段，單克隆抗體與藥物連接后，形成藥物-載體-抗體復(fù)合物，能載帶更多的藥物分子，可將藥物靶向輸送給病灶部位[8～10]，已有不少單克隆抗體產(chǎn)品上市并得到應(yīng)用。 Annexin-1具有很強(qiáng)的抗炎作用，其抗炎活性的發(fā)揮主要是能夠干擾粒細(xì)胞，尤其是中性粒細(xì)胞的聚集、遷移及其在炎癥部位的活性。Annexin-1抑制了炎癥的起始步驟，還可以抑制許多炎性反應(yīng)復(fù)合物的形成,如PLA2。PLA2是炎性介質(zhì)合成和釋放的關(guān)鍵酶,是調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的中心，在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展過程中，會不同程度地出現(xiàn)Annexin-1表達(dá)水平的改變，因此，Annexin-1參與了支氣管哮喘的發(fā)病過程。本研究運(yùn)用細(xì)胞融合技術(shù)，成功制備并獲得了可穩(wěn)定分泌Annexin-1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株和Annexin-1特異性單克隆抗體，為后面繼續(xù)研究提供了有價(jià)值的產(chǎn)品。Annexin-1單克隆抗體不但能作為特異性抗體與抗原結(jié)合，還能在Annexin-1抗原的檢測中起到一定作用。未來，Annexin-1單克隆抗體可成為靶向標(biāo)志聯(lián)合平喘藥物，用于支氣管哮喘靶向治療，為實(shí)現(xiàn)靶向治療哮喘奠定了醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)。

[1]張立勇,趙曉航,吳星.膜聯(lián)蛋白I的結(jié)構(gòu)和功能[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2002，29(4):515-517

[2]Hayhoe R P，Kamal A M，Solito E，et al． Annexin 1 and its bioactive peptide inhibit neutrophil-endothelium interactions under flow: indication of distinct receptor involvement[J]．Blood，2006，107( 5) ：2120-2123

[3]D' Acquisto F，Merghani A，Lecona E，et al.Annexin-1 modulates T -cell activation and differentiation[J]．Blood，2007，109(3)：1088-1095

[4]Da C E，Oliani S M，Damazo A S.Effect of annexin-A1 pep-tide treatment during lung inflammation induced by lipopo-lysaccharide[J]．Pulm Pharmacol Ther，2012，25(4)：297-303

[5]Kwon J H，Lee J H，Kim KS，et al．Regulation of cytosolic phospholipase A2 phosphorylation by proteolytic cleavage of annexin A1 in activated mast cells[J]．Immunol，2012，188(11)：5661-5665

[6]J.薩姆布魯克.D.W.拉賽爾著;黃培堂,等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].第3版.北京:科學(xué)出版社,2002:1228-1260

[7]Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity[J].Nature，1975,256(5517):495-497

[8]張利紅，劉祥磊，谷銀芳，等．中和性VEGF單抗的制備及其對肺癌的抑制作用[J]．中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2015，37(4): 477-485

[9]孔君，劉箐，韓躍武，等．單克隆抗體制備技術(shù)的最新進(jìn)展及應(yīng)用前景[J]．免疫學(xué)雜志，2011，27(2):170-173

[10]Clynes RA，Towers TL，Presta LG，et al．Inhibitory fcreceptors modulate in vivo cytotoxicity against tumortargets[J].Med，2000，6(4):443-446

PreparationandidentificationofmonoclonalantibodyagainstAnnexin-1thatisdown-regulatedinbronchialasthma

ZHAOYun-wei，ZOUXiao-ting,LIShuang,LIANGShan-shan,WANGChun-ling

( The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003, China)

ObjectiveTo prepare and identify specific monoclonal antibodies against Annexin-1 by cell fusion technology.MethodRecombinant immune protein Annexin-1 was used as antigen to immunize Bal B/c mice. Mouse spleen cells after immunization fused with mouse myeloma SP2/0 cells through PEG by conventional hybridoma technique. The positive hybridoma cell lines secreting antibodies were screened by ELISA method indirectly, and the positive cells were subcloned, cultured，and inoculated into the abdominal cavity of mice to induce ascites, and then the monoclonal antibody of Annexin-1 was prepared. Finally, the monoclonal antibodies were identified by ELISA, Western Blot and other techniques.Result5 hybridoma cell lines secreting anti annexin-1 were obtained by hybridoma technique, named IA8, ID2, IE2, 4E7 and 5G3 respectively. All the antibodies were IgGI subtype, and the light chain was K chain. The secreted 5 monoclonal antibodies could bind specifically to Annexin-1 protein.ConclusionIn this study, we successfully prepared and obtained a hybridoma cell line secreting monoclonal antibody against Annexin-1 and a specific monoclonal antibody against Annexin-1 thus lays the foundation for its preparation and identification. In this study, hybridoma cell lines and Annexin-1 specific monoclonal antibodies that can stably secrete monoclonal antibodies against Annexin-1 were successfully prepared, which laid a medical foundation for the preparation and clinical detection of hybridoma cell lines.

Annexin-1; monoclonal antibody; preparation; identification

1.黑龍江省科學(xué)技術(shù)研究面上項(xiàng)目，編號：JMSUJCMS2016-041；2.黑龍江省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題，編號：2016-299。

趙蘊(yùn)偉(1967～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。

李爽(1981～)女，山東家祥人，碩士，主治醫(yī)師 。E-mail：1293422657@qq.com。

R562.2+5

A

1008-0104(2017)06-0031-03

2017-04-02)