黃 超 任向陽 馬聰敏 滕軍放

1)鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院神經內科，河南 洛陽 471000 2) 鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經內科，河南 鄭州 450052

·論著科研之窗·

miR-708與JAK1在大鼠腦缺血再灌注損傷中的表達及調控關系

黃 超1)任向陽1)馬聰敏1)滕軍放2)△

1)鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院神經內科，河南 洛陽 471000 2) 鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經內科，河南 鄭州 450052

目的初步探討miR-708在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用及機制。方法選取25只雄性SD大鼠，隨機抽取10只作為假手術組,其余大鼠采用線栓法構建大鼠腦缺血再灌注模型(MACO)，將術后存活的10只SD大鼠設為缺血再灌注1 d組，采用實時定量熒光PCR法(real time，PCR)比較各組大鼠外周血和腦組織的miR-708表達及腦組織中JAK1 mRNA的表達；蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測各組大鼠腦組織中JAK1蛋白的表達水平。結果與假手術組相比，實驗組外周血及腦組織中miR-708 mRNA表達顯著降低(P<0.01)，而腦組織中JAK1 mRNA表達水平明顯上調(P<0.01)。相關性分析發(fā)現(xiàn)miR-708與JAK1表達呈負相關。結論miR-708可能通過抑制其靶基因JAK1的表達在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護作用。

腦缺血；再灌注損傷；miR-708；JAK1；大鼠

腦缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)指在某些情況下腦組織缺血后血流再通，可導致進一步的組織損傷和功能障礙，是多種因素參與的復雜病理生理過程[1]。腦IRI可引起廣泛的微血管功能障礙和組織屏障功能改變。目前針對IRI無特效治療，需要通過探討腦IRI的機制，尋找新的預防和治療腦IRI的方法。microRNAs(miRNAs)是重要的轉錄后調節(jié)分子，可與多個靶信使RNA(mRNA)結合進而調節(jié)靶基因的表達，近來有研究顯示miRNAs在腦缺血再灌注誘導的神經元凋亡中起著重要的調控作用，表明miRNAs參與了腦缺血再灌注損傷過程[2]。microRNA-708(miR-708)是最近發(fā)現(xiàn)的miRNA，其功能尚未明確，最近在大鼠MCAO模型中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，miR-708在IRI后24 h和72 h表達降低，為對照的50%左右[3]。本文初步探討miR-708在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用及機制。

1 材料與方法

1．1實驗動物成年雄性SD大鼠25只，體質量(300±20)g,由鄭州大學實驗動物中心提供,飼養(yǎng)于陰暗安靜的環(huán)境中，溫度18～22 ℃，相對濕度40%～60%，許可證號：SCXK(Henan) 2005-0001。

1．2實驗儀器及試劑MCAO 模型栓線(2838-A4)購自北京沙東生物技術有限公司，Trizol 試劑購自 TAKARA公司產品，逆轉錄試劑盒及RT-PCR試劑均購自DBI 公司產品，蛋白裂解液為碧云天公司產品，Anti-JAK1 購自antibodyAbcam (ab47435)，蛋白免疫印跡(Western blot)蛋白顯色液購自北京全式金生物公司，Stratagene Mx3000P Real time PCR儀為美國Agilent公司產品，掃描儀為MICROTEK (Bio-5000)。

1．3方法

1．3．1 動物分組及MCAO模型的構建：選取25只雄性SD 大鼠，隨機抽取 10 只作為假手術組，其余大鼠參照改良 Zea-Longa 法建立 MCAO 模型，即用 10% 水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉，仰臥位固定于手術臺，常規(guī)消毒頸部皮膚，在頸正中切口，鈍性分離下頜下腺，暴露分離右側頸總動脈、右側頸外動脈及右側頸內動脈，結扎頸總動脈和頸外動脈，于頸總動脈分叉下方做一“V”形切口，將前端包被多聚賴氨酸的尼龍線栓插入頸總動脈并向頸內動脈延伸1.8～2.0 cm，稍有阻力感即停止。缺血 90 min 后將線栓拔出，縫合傷口。假手術組大鼠手術操作除不插入線栓外余與造模相同。將術后存活的10只SD大鼠設為實驗組(再灌注24 h)。每組大鼠隨機選2只做TTC染色，其余各8只腦組織分2份，均于-80 ℃保存，用于后續(xù)的qPCR及Western blot檢測。

1．3．2 大鼠腦組織TTC染色：大鼠麻醉后，開胸充分暴露心臟；將右心耳剪一小口，在心尖處插入注射針頭，注入約100 mL PBS，在肺部變白后，停止PBS的灌注；小心將大鼠腦組織剝離；將腦組織在-20 ℃度冰箱中速凍20 min左右；采用專用的腦槽切片，每2 mm一張；將切片放入2%的TTC染液中，37 ℃染色15～30 min；取出后拍照。

1．3．3 靶基因的預測：采用TargetScan、miRBase和PicTar三種生物信息學計算機軟件分別預測miR-708的可能靶基因。其原則是：三種軟件同時預測到存在miRNA-708結合位點，同時配對分值高且已報道與細胞炎癥及增殖相關的基因。

1．3．4 實時定量熒光PCR檢測外周血miR-708及腦組織中miR-708和JAK1 mRNA表達變化：依據(jù)試劑說明書采用TRIzol法提取實驗組大鼠大腦皮質缺血區(qū)和假手術組相應區(qū)域的總RNA。用RNA反轉試劑盒將總RNA反轉錄得到總cDNA。采用real time PCR方法檢測cDNA中目的基因的表達量情況。PCR反應條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40循環(huán)。融解曲線分析：溫度 62 ～95 ℃ 。每樣重復 3次。用Agilent Stratagene熒光定量PCR儀Mx3000P進行熒光定量PCR實驗，采用最大二階導數(shù)法(2-△△Ct)分析基因的相對表達量。RT-PCR引物序列見表1。

1．3．5 Western blot法檢測JAK1蛋白水平的表達：取腦組織加入蛋白裂解液(300～500 μL)后于液氮中研磨；研磨結束后，將裂解液移至1.5 mL EP管中，冰上充分裂解30 min。 4 ℃，14 000 r/min離心10 min，取上清。依次配制 5%的濃縮膠，10% 的分離膠，制備 SDS-聚丙烯酰胺凝膠。 每泳道分別加入 40 μg總蛋白量，在濃縮膠中80 V 濃縮10 min，然后改為100 V 在分離膠中分離90 min。 然后通過濕轉的方法轉膜到PCDF膜上，用含5%脫脂奶粉的 TBST 封閉 1 h，用TBST清洗PVDF膜3次，每次10 min，隨后加入JAK1抗體(1：1 000 稀釋)和 GAPDH單克隆抗體(1：10 000稀釋)，4 ℃置于搖床上過夜。第 2 天，用TBST 將PVDF 膜洗 3 次，每次10 min，用抗體稀釋液稀釋二抗，置于搖床上室溫孵育40 min(二抗：HRP Goat anti-Rabbit IgG，稀釋比例：1：20 000)，然后按試劑盒說明書配置反應底物溶液，將溶液加到PVDF膜上，放置5 min后，去除多余液體，將PVDF膜放入X-光片夾內；在暗室中，將2～3張X-光片放入夾片盒內，5 min后取出，依次放入洗片機中，待膠片取出后結束化學發(fā)光過程。掃描膠片，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶灰度值。

1．4統(tǒng)計學分析應用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)± 標準差表示，2組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P<0．05為差異有統(tǒng)計學意義。兩變量之間的相關程度分析采用 Pearson相關性分析。

表1 引物序列

2 結果

2．1 TTC染色再灌注24 h后，對大鼠腦組織行TTC染色。對照組大鼠腦組織染色呈現(xiàn)紅色，而手術組大鼠腦組織的TTC染色則呈現(xiàn)灰白色，表明皮層下梗死(圖1)，說明造模成功。

2．2 JAK1的3’非翻譯區(qū)與miR-708結合位點預測見圖2。

圖1 TTC染色 A：假手術組；B：缺血再灌注組

圖2 JAK1的3’非翻譯區(qū)與miR-708結合位點預測

2．3 miR-708、JAK1 mRNA的表達為檢測miR-708在IRI中的表達情況，我們提取了對照組及造模組小鼠外周血RNA，real-time PCR檢測miR-708的表達后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，造模組miR-708的mRNA表達顯著降低(圖3A)。同樣，在腦組織中也發(fā)現(xiàn)miR-708的mRNA表達明顯低于對照組(圖3B)，說明miR-708的表達在IRI中降低。JAK1作為miR-708的靶基因，我們也檢測了腦組織中JAK1的mRNA表達，與對照相比，JAK1的mRNA表達水平顯著增加(圖3C)，說明JAK1作為miR-708的靶基因，在IRI中表達增加

2．4 JAK1蛋白的表達提取對照組和造模組大鼠的腦組織蛋白質，利用Western blotting檢測JAK1的蛋白表達水平，與mRNA表達相似，JAK1在造模組中表達增加。檢測凋亡信號通路蛋白剪切型Caspase3的表達后，發(fā)現(xiàn)在IRI的大鼠腦組織中cleaved-Caspase3的表達明顯高于對照組(圖3E)。

2．5 miR-708抑制JAK1蛋白的表達相關性分析發(fā)現(xiàn)，miR-708與JAK1表達呈負相關(r=-0.756，P=0.0114)(圖3D)，miR-708表達越高，JAK1表達越低，說明miR-708通過其靶基因JAK1在IRI中發(fā)揮保護作用。

3 討論

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfu-sion injury，IRI)是導致包括腦卒中、心肌梗死、創(chuàng)傷、外周血管疾病和創(chuàng)傷性腦損傷等各種并發(fā)癥和死亡的常見原因[1，4]。近來有研究顯示，miRNAs在腦IRI誘導的神經元凋亡中發(fā)揮調控作用，表明miRNAs參與了IRI過程。Min等[2]應用基因芯片分析發(fā)現(xiàn),在局灶性腦缺血后再灌注期，大鼠皮質內miRNAs表達譜有明顯的變化，在大鼠缺血性皮質同側，有15種miRNAs表達增加，44種miRNAs表達下降。Huang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-29c可以作用于靶基因Birc2和Bak1，加重大鼠模型的IRI。miR-22過表達可導致抗凋亡基因Bcl-2表達升高和凋亡基因Bax表達下降，從而抑制IRI后的炎癥反應和細胞凋亡[6]。

miR-708是最近發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的miRNAs之一。已在多種腫瘤組織中，包括肝細胞癌[7]、腎細胞癌[8]等中表達下調，說明其可能作為抑癌基因發(fā)揮作用。最近在大鼠MCAO模型中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，miR-708在IRI后24 h和72 h表達降低，為對照組的50%左右[3]。我們的結果發(fā)現(xiàn)，在IRI大鼠模型中，外周血和腦組織中miR-708的表達顯著降低，這與上述在大鼠MCAO模型中的結果一致，說明miR-708在大鼠腦缺血再灌注模型中表達降低。

圖3 A：提取2組大鼠的外周血RNA，利用real-time PCR檢測miR-708的mRNA表達， **P<0.01；B：提取2組大鼠的腦組織RNA，利用real-time PCR檢測miR-708的mRNA表達，**P<0.01；C：提取造模組和對照組2組大鼠的腦組織RNA，利用real-time PCR檢測JAK1的mRNA表達，**P<0.01；D：根據(jù)造模組和對照組小鼠腦組織miR-708和JAK1的mRNA表達水平，統(tǒng)計miR-708和JAK1表達的相關性；E：提取4對對照組及造模組腦組織蛋白質，利用Western blotting檢測JAK1和cleaved Caspase3的蛋白表達

腫瘤組織中miR-708分別靶向不同的靶基因發(fā)揮作用，如在腎細胞癌中，miR-708靶向抗凋亡蛋白survivin促進細胞凋亡，發(fā)揮抑癌基因的作用[8]。在結直腸癌中，miR-708表達顯著增加，并通過與CDKN2B的3’非翻譯區(qū)結合抑制CDKN2B的蛋白表達，進而促進腫瘤細胞的增殖和侵襲[9]。但miR-708在IRI中的作用靶點尚未見報道。我們通過生物學信息學的方法查找miR-708的靶基因，在JAK1的3’非翻譯區(qū)(UTR)我們發(fā)現(xiàn)具有miR-708的結合位點(594-600)。Jaunus kinases(JAK)是細胞質酪氨酸激酶，可介導多個細胞因子信號通路進而主要在造血和免疫應答中影響細胞生長、分化和生存[10]。JAK1是JAK家族成員之一，在與大量的生長因子和細胞因子膜受體結合后被激活，皮層V層大椎體神經元中是大腦皮質神經元中JAK1表達最高的區(qū)域。早在2000年就有研究發(fā)現(xiàn)JAK/STAT信號通路參與IRI。在對大鼠造成腦缺血后出現(xiàn)包括JAK1和STAT3蛋白的JAK/STAT信號通路激活，JAK1介導星型膠質細胞中STAT3的核轉位，進而參與局灶性腦缺血后星型膠質細胞的反應[11]。此外，在C57BL/6小鼠的腦IRI模型中發(fā)現(xiàn)，在IRI的24 h后磷酸化JAK1和磷酸化STAT1的表達顯著升高[12]。

我們在大鼠腦IRI模型中發(fā)現(xiàn)JAK1的mRNA表達水平顯著增加，間接證明JAK1為miR-708的靶基因，在腦IRI中表達增加。此外，我們還提取了對照組和造模組大鼠的腦組織蛋白質，利用Western blotting檢測了JAK1的蛋白表達水平，與mRNA表達相似，JAK1在造模組中表達增加。我們還檢測了凋亡信號通路蛋白剪切型Caspase3的表達，在IRI的大鼠腦組織中Caspase3的表達明顯高于對照組。最后，我們檢測了miR-708與JAK1表達的相關性，相關性分析發(fā)現(xiàn)miR-708與JAK1表達呈負相關，miR-708表達越高，JAK1表達越低，說明miR-708可能通過其靶基因JAK1在IRI中發(fā)揮保護作用。

本研究初步探討了miR-708在大鼠腦缺血再灌注損傷中的作用及機制，提示其可能通過抑制靶基因JAK1的表達在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護作用，并可能成為缺血再灌注損傷一種新的有前途的治療靶點，但研究存在一定的局限性。首先，靶基因的預測僅通過生物信息學方法，應采用其他實驗，如雙熒光素酶實驗進行驗證；其次，僅在動物模型中證實，應構建體外模型進行驗證，深入探討miR-708在IRI中的作用機制。接下來，我們將針對這兩方面缺陷開展后續(xù)的實驗工作。

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ExpressionandinteractionofmiR-708andJAK1inratswithcerebralischemia-reperfusioninjury

HUANGChao*，RENXiangyang，MACongmin，TENGJunfang

*DepartmentofNeurology，LuoyangCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity，Luoyang471000，China

ObjectiveTo investigate the function and mechanism of expression changes of microRNA-708(miR-708) in rats with cerebral ischemia reperfusion injury．MethodsFive male SD rats were randomly assigned to sham operation group (n=10) and tMCAO group (middle cerebral artery infarct and reperfusion model，10 rats survived after operation，n=10)． The miR-708 expression in brain tissues and blood and JAK1 mRNA expression in brain tissues of each group were detected by using real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) method．The JAK1 protein level was detected by using Western blot method．ResultsCompared with those in sham operation group，miR-185 expressions were significantly lower (P<0.01) in brain tissues and blood and the expressions of JAK1 mRNA were significantly increased in brain tissues in the tMCAO group (P<0.01)；Correlation analysis found that the expression of miR-708 and JAK1 mRNA had negative correlation in the tMCAO rats．ConclusionMiR-708 may play a protective role in brain ischemia reperfusion injury by inhibiting the expression of the target gene JAK1．

Brain ischemia；Reperfusion injury；microRNA-708；JAK1；Rat

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.21.002

洛陽市科技計劃(醫(yī)療衛(wèi)生)項目(編號1503006A-1)

△通信作者：滕軍放(1960-)，男，博士，主任醫(yī)師，博士生導師。研究方向：腦血管病、神經系統(tǒng)感染與免疫、神經系統(tǒng)變性疾病。Email:tengjf_md@126.com

R-332

A

1673-5110(2017)21-0007-05

(收稿2017-06-12)

關慧