顧瑛媛+宋娜麗+萬(wàn)春平

摘要：目的研究黃芪皂苷I的免疫調(diào)節(jié)作用以及作用的分子機(jī)理。方法構(gòu)建絲裂原誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖細(xì)胞模型，測(cè)定黃芪皂苷I對(duì)ConA誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖和LPS誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，構(gòu)建anti-CD3 mAb抗體誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖，RT-PCR檢測(cè)黃芪皂苷I對(duì)IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA基因表達(dá)。結(jié)果黃芪皂苷I 在30nM顯著促進(jìn)ConA 刺激T淋巴細(xì)胞增殖，差異有顯著性意義（P<0.05）；黃芪皂苷 I 體外用藥能夠顯著上調(diào)IFN-γ，T-bet的mRNA表達(dá)，而對(duì)IL-2表達(dá)水平無(wú)明顯影響。結(jié)論黃芪皂苷I可能特異性激活轉(zhuǎn)錄因子T-bet的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

關(guān)鍵詞：黃芪皂苷I；T淋巴細(xì)胞；Th1免疫反應(yīng)；IFN-γ；T-bet

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2017）12-0072-03

【Abstract】Objective： To study the immunomodulatory effect of stragaloside I and its molecular mechanism. Methods： The splenic lymphocyte proliferation model induced by mitogen was established to determine the response of astragaloside I to T lymphocytes proliferation induced by ConA and B lymphocytes proliferation induced by LPS. T lymphocyte proliferation induced by anti-CD3 mAb antibody was established. RT-PCR was used to determine astragaloside I to the genetic expression of IL-2， IFN-γ and T-bet mRNA. Results： Astragaloside I significantly promoted the proliferation of T lymphocyte stimulated by ConA at 30 nM， and the difference was significant （P<0.05）. Astragaloside I administration in vitro significantly increased the mRNA expression of IFN-γ and T-bet， but had no significant effect on IL-2 expression. Conclusion： Astragaloside I may specifically activate the transcription of transcription factor T-bet and promote T lymphocyte proliferation and cytokine production

【Key words】Astragaloside I， T lymphocyte， Th1 immune response， IFN-γ， T-bet

扶正祛邪是中醫(yī)藥防治疾病的特色，被廣泛運(yùn)用于各種疾病的治療。中醫(yī)認(rèn)為“正氣內(nèi)存，邪不可干”“邪之所湊，其氣必虛”。虛證指正氣虛弱，現(xiàn)代研究表明虛證患者常表現(xiàn)為細(xì)胞免疫功能低下，體液免疫功能紊亂。可見(jiàn)，“正氣”是機(jī)體免疫能力的一種中醫(yī)表達(dá)方式。黃芪是我國(guó)經(jīng)典傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥，具有健脾補(bǔ)中、升陽(yáng)舉陷、益衛(wèi)固表、利尿、托毒生肌之功效，《本草綱目》記載“可治一切氣衰血虛之癥”[1]。大量研究已證實(shí)，黃芪皂苷為黃芪主要活性成分[2-4]。黃芪甲苷能夠促進(jìn)小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖和抗體生成，顯示出對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫較強(qiáng)的促進(jìn)作用[5]。目前有關(guān)黃芪皂苷免疫調(diào)節(jié)活性研究主要集中在黃芪甲苷，其他皂苷組分研究較少，免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制尚未闡明。本論文旨在研究黃芪皂苷I的免疫調(diào)節(jié)作用，揭示其免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)理，為黃芪的臨床應(yīng)用和配伍提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源，種系，品系：BALB/c小鼠，7-8周齡，體重20-22 g，雌性，成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（川）2008-24；動(dòng)物飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物至少飼養(yǎng)一周后使用。溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%，12 h光暗循環(huán)。飼料和水均在消毒后由動(dòng)物自由攝取。所有實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)條例進(jìn)行。

1.2主要藥物與試劑黃芪皂苷I由云南中醫(yī)學(xué)院左愛(ài)學(xué)博士提供，受試藥物呈白色粉末狀，純度>99%，用DMSO作為溶劑配置成5 mg/mL儲(chǔ)存液，-20℃保存?zhèn)溆茫R用前用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成相應(yīng)濃度；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自GibcoBRL公司（life Technologies，Grandisland，NY，USA）；胎牛血清（fetal bovine serum）購(gòu)自Hyclone 公司（Logan，Utah，USA）；刀豆蛋白A（Concanavalin A，ConA）購(gòu)自Sigma公司（St.Louis.MO，USA）；Trizol裂解液購(gòu)置天根生化（北京）科技有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3主要儀器離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Thermo Scientific Heraeus；二氧化碳培養(yǎng)箱和生物安全柜均購(gòu)自美國(guó)Thermo-fisher；Epoch連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司。

2實(shí)驗(yàn)方法及評(píng)價(jià)

2.1脾淋巴細(xì)胞的制備小鼠脫脊椎處死，無(wú)菌取其脾臟。將脾臟用玻璃片磨碎，過(guò)膜，于1200 rpm離心5 min。棄去上清，沉淀加入紅細(xì)胞裂解液（每個(gè)脾臟約1 mL），混勻，靜置1分鐘，加入PBS，離心。再加入PBS，過(guò)膜，離心。將所剩細(xì)胞洗滌1～2次后，用含10%FBS的RPMI-1640將細(xì)胞調(diào)至所需濃度。

2.2MTT法測(cè)定絲裂原誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖功能小鼠脾臟淋巴細(xì)胞（4×105個(gè)/孔）接種于96孔板，加入不同濃度的受試物，同時(shí)加入ConA（終濃度1μg/ml）或LPS（終濃度10μg/ml），另設(shè)無(wú)刺激劑的本底對(duì)照。于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中作用48h，MTT法檢測(cè)絲裂原誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖功能。

2.3RT-PCR檢測(cè)IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA基因表達(dá)因表達(dá)，用序列單環(huán)己基銨ed ymmunomodulatin-脾淋巴細(xì)胞（5×106個(gè)/孔）接種于anti-CD3 mAb抗體（5μg/ml）包被的24孔板中，加入黃芪皂苷II（30nM），另設(shè)相應(yīng)溶媒對(duì)照和無(wú)刺激本底對(duì)照，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h后，收集細(xì)胞，Trizol一步抽提法提取總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA，PCR檢測(cè)檢測(cè)IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA基因表達(dá)，電泳和成像。特異基因引物序列如下：

基因PCR引物序列IL-2：（sense）5-TGAGCAGGATGGAGAATTACAGG-3；（anti-sense）5-GTCCAAGTTCATCTTCTAGGCAC-3；IFN-γ：（sense）5-ATGAACGCTACACACTGCATC-3；（anti-sense）5-CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC-3；T-bet：（sense）5-CCAGGAAGTTTCATTTGGGAAGC-3；（anti-sense）5-ACGTGTTTAGAAGCACTG-3；β-actin：（sense）5-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3；（anti-sense）5-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3；2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理。均值間差異比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為顯著水平。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1黃芪皂苷1對(duì)絲裂誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，1μg/mL Con A、10 μg/mL LPS顯著誘導(dǎo)T、B淋巴細(xì)胞發(fā)生克隆性增殖，黃芪皂苷I 在30nM顯著促進(jìn)ConA 刺激T淋巴細(xì)胞增殖，差異有顯著性意義（P<0.05）。然而對(duì)LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖無(wú)明顯的影響（P>0.05）。

3.2黃芪皂苷I對(duì)IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA基因表達(dá)的影響見(jiàn)圖2。RT-PCR方法檢測(cè)黃芪皂苷 II對(duì)IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示，anti-CD3 mAb刺激16h后能夠顯著誘導(dǎo)IL-2、IFN-γ和T-bet mRNA表達(dá)，黃芪皂苷 I體外用藥能夠顯著上調(diào)IFN-γ和T-bet的mRNA表達(dá)，而對(duì)IL-2表達(dá)水平無(wú)明顯影響，說(shuō)明黃芪皂苷I 在基因轉(zhuǎn)錄水平可能通過(guò)促進(jìn)T-bet的轉(zhuǎn)錄而誘導(dǎo)IFN-γ的表達(dá)。

4討論

在機(jī)體的細(xì)胞免疫中T細(xì)胞發(fā)揮著重要的作用，T淋巴細(xì)胞不僅是細(xì)胞免疫功能的承擔(dān)者，而且也是免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)者，其中以輔助性T淋巴細(xì)胞（Th）和抑制性T 淋巴細(xì)胞（Ts）對(duì)免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)作用至為重要，參與多種自身免疫性疾病和腫瘤免疫過(guò)程。IFN-γ是Th1型細(xì)胞釋放的重要的細(xì)胞因子，對(duì)Th1細(xì)胞的分化起著重要作用，同時(shí)其可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的產(chǎn)生，促進(jìn)NO的合成，是IFN-γ抗腫瘤作用重要的分子機(jī)制之一[6-7]。IFN-γ能活化NK細(xì)胞，提高其對(duì)靶細(xì)胞的殺傷功能。

T 細(xì)胞激活后分化發(fā)展成為Th1、Th2、Th17和Treg等T淋巴細(xì)胞亞群受到不同轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。T-bet屬于T-box家族的轉(zhuǎn)錄因子，選擇性表達(dá)于Th1細(xì)胞，作為Th1特異的轉(zhuǎn)錄因子能誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在Th1細(xì)胞的分化中起著決定作用[8]。T細(xì)胞激活后產(chǎn)生兩種重要的細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ，它們對(duì)促進(jìn)和擴(kuò)大免疫反應(yīng)有很強(qiáng)的功能。IL-2是T細(xì)胞增殖所必需的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有很強(qiáng)的免疫刺激作用和抗腫瘤活性[9]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪皂苷I顯著促進(jìn)anti-CD3 mAb誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖。在mRNA水平上，黃芪皂苷 I 也能夠顯著上調(diào) IFN-γ、T-bet 的mRNA表達(dá)水平。研究已證實(shí)，黃芪皂苷能夠顯著激活 CD45 PTPase 酶活性。在分子水平，黃芪皂苷能夠顯著促進(jìn)CD45 PTPase作用底物P56LCK（Tyr505）去磷酸化。基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)黃芪皂苷 I作為CD45 PTPase激活劑，在細(xì)胞水平可能通過(guò)激活CD45 PTPase，參與TCR介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而激活下游相關(guān)信號(hào)通路，引起Th1特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet轉(zhuǎn)錄激活，促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞增殖和IL-2、IFN-γ的產(chǎn)生。該研究豐富和發(fā)展黃芪“健脾補(bǔ)中，益衛(wèi)固表”功效的科學(xué)內(nèi)涵，為傳統(tǒng)中藥的現(xiàn)代研究提供新的研究思路和方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1986：2038.

[2]Chun-Ping Wan，Li-Xin Gao，Li-Fei Hou，et al.Astragaloside triggers T cell activation through regulating the activity of CD45 protein tyrosine phosphatase[J].Acta Pharmacologica Sinica，2013，（34）：522-530.

[3]萬(wàn)春平.黃芪皂苷類組分生物活性研究進(jìn)展[J].云南中醫(yī)中藥雜志.2011，32（8）：79-81.

[4]萬(wàn)春平.黃芪皂苷III通過(guò)IFN-γ介導(dǎo)體外免疫調(diào)節(jié)作用的研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志.2011，32（9）：69-71.

[5]Wang YP，Li XY，Song CQ，et al.Effect of astragaloside IV on T，B Lymphpcyteproliferation and peritoneal macrophage function in mice[J].Acta Pharmacol Sin.2002，（3），263-266.

[6]Susanne J.Szabo，Brandon M.Sullivan，Stanford L.PengAnnu.Rev.molecul ar mechansism regulating Th1 immune responses.Immunol.2003，21：713-58.

[7]金伯泉.細(xì)胞和分子生物學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2001：185-186.

[8]Ansel KM，Lee DU，Rao A.An epigenetic View of helper T cell differation[J].Nat Immunol.2003，（4）：616-23.

[9]Tomas Mustelin，Souad Rahmouni，Nunzio Bottini.et al.Role of protein tyro sine phosphatases in T cell activation[J].Immunological Reviews，2003，（191）：13 9-147.

（收稿日期：2017-11-10）