薛文宇+曾艷+韋星呈

[摘要]目的 研究人類重組激活基因2（RAG2）5′近端染色質(zhì)可接近區(qū)域調(diào)控RAG2表達的分子機制。方法 采用染色質(zhì)可接近性實時聚合酶鏈反應(yīng)（CHART-PCR）分析RAG2基因5′近端區(qū)域的DNase Ⅰ超敏位點（DHS），比較RAG陽性和陰性淋巴細胞以及非淋巴細胞的染色質(zhì)開放狀態(tài)變化。采用雙熒光素酶報告基因分析DHS的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，采用膠遷徙試驗和染色質(zhì)免疫沉淀試驗證實GATA3的體外（in vitro）和在體（in vivo）結(jié)合，采用PCR定點突變和顯性負突變體技術(shù)證實GATA3對RAG2基因的調(diào)控作用。結(jié)果 人RAG2基因5′上游近端區(qū)域染色質(zhì)在T與B細胞中處于不同的開放狀態(tài)，RAG陽性T細胞的核心啟動子活性與其特異性DHS相吻合。T細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA3結(jié)合于T細胞特異性DHS的高度保守區(qū)域，特異性上調(diào)報告基因及在體RAG2 mRNA在T細胞中的表達。結(jié)論 RAG2基因5′近端區(qū)域通過染色質(zhì)開放狀態(tài)變化調(diào)控基因表達的特異性。GATA3與高度保守的DHS區(qū)域結(jié)合，上調(diào)內(nèi)源性人RAG2在T細胞中的表達。

[關(guān)鍵詞]重組激活基因；染色質(zhì)可接近性；啟動子；順式作用元件；轉(zhuǎn)錄因子；T淋巴細胞

[中圖分類號] R-33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）01（c）-0007-07

[Abstract]Objective To study molecular mechanism of the regulation of RAG2 expression regulated the human recombination activating gene 2 （RAG2） 5′proximal chromatin accessible areas.Methods To compare the open states change of chromatin of RAG positive and negative lymphocytes as well as non lymphocyte chromatin，chromatin accessibility by real-time polymerase chain reaction （CHART-PCR） was used for DNase Ⅰ analysis of RAG2 gene 5′proximal regions of hypersensitive sites （DHS）.Double luciferases reporter assay was used to examine the transcriptional regulation effects of the DHS regions.Electrophoresis mobility shift assay and chromatin immunoprecipitation assays were used to detect the binding of GATA3 in vitro or in vivo.PCR site-directed mutant assay and dominant-negative mutant assay were used to identify the regulatory effects of GATA3 on the reporter gene （in vitro），as well as on RAG2 gene （in vivo）.Results In T and B cells，the chromatin structures of 5′ proximal region of human RAG2 were in distinct open states.In RAG positive T cells，the activity of RAG2 core promoter corresponded to its specific DHS.GATA3，a T-cell specific transfactor，bound to a highly conserved sequence within the specific DHS，and increased the expression of the reporter genes as well as RAG2 mRNA of the T cells in vivo.Conclusion RAG2 gene 5′proximal area through open states change of chromatin regulate the specificity of the gene expression，GATA3 regulates the expression of endogenous RAG2 in T cells by binding to highly conserved DHS regions.

[Key words]Recombination activating gene；Chromatin accessibility；Promoter；Cis-acting element；Transcription factor；T lymphocyte

重組激活基因（recombination activating gene，RAG）編碼的重組激活酶RAG1和RAG2介導(dǎo)抗原受體基因V（D）J重排，在抗原受體多樣性細胞庫的形成以及淋巴細胞分化發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。任一RAG基因的無效突變，將阻斷T和B淋巴細胞發(fā)育，導(dǎo)致嚴重免疫缺陷病[2-3]。

在T和B細胞發(fā)育過程中，RAG1和RAG2表達具有嚴格的組織、階段特異性。以往的研究者對調(diào)控小鼠RAG1和RAG2轉(zhuǎn)錄的啟動子及增強子、其他類型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的研究結(jié)果進行了報道[1，4-6]，還報道了小鼠RAG2啟動子、淋巴細胞特異性增強子（D3）、B細胞特異性增強子（Ep）、以及轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合與調(diào)控功能研究結(jié)果[7-10]，但是目前對人RAG轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的報道十分有限，尤其是缺乏在體（in vivo）的研究證據(jù)。

本研究將通過CHART-PCR（chromatin accessibility by real-time PCR）方法對人RAG2基因5′近端區(qū)域的DNase Ⅰ 超敏位點（DNase Ⅰ hypersensitivity site，DHS）進行定量分析，比較RAG陽性（RAG+）T和B淋巴細胞、RAG陰性（RAG-）淋巴細胞以及非淋巴細胞的染色質(zhì)開放狀態(tài)變化；研究T細胞中轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor，TF）與DHS在體外（in vitro）和在體（in vivo）的特異性結(jié)合對報告基因的調(diào)控作用以及TF顯性負突變體（dominant-negative mutant，DNM）對內(nèi)源性RAG2表達的直接影響。

1材料與方法

1.1細胞

Reh（RAG+人pre-B細胞）由ATCC提供，Daudi（RAG-人B細胞）、CCRF-CEM（RAG+人pre-T細胞）、Jurkat（RAG+人胸腺T細胞）、Hut78（RAG-人T細胞）、K562（RAG-人紅細胞系）均由中科院細胞庫提供。上述細胞使用RPMI 1640（GIBCO），加入10% FCS、100 U/ml氨芐青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素以及5% CO2、37℃培養(yǎng)。

1.2 CHART-PCR鑒定DHS

1.2.1 DNase I處理 方法參考Ling等[11]的方法略作改良，1.5×107細胞核經(jīng)0～2 U/μl DNase Ⅰ（TakaRa）作用，10 mmol/L Proteinase K終止反應(yīng)后，提取基因組DNA。

1.2.2 CHART-PCR分析 引物設(shè)計使擴增產(chǎn)物為80～250 bp的連續(xù)或部分重疊的目的基因片段（表1）。使用Primer 3和Oligo 7.58進行引物評價，Primer-Blast做特異性分析?；蚪MDNA經(jīng)5倍稀釋（0、0.8、4.0、20.0、100.0、500.0 ng）做標準曲線。目的DNA模板加入量為50 ng，SYBR？誖Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa），ABI 7500（applied biosystems），每個反應(yīng)設(shè)3次重復(fù)。

1.3報告基因、TF過表達及DNM表達載體

1.3.1 pGLhR2報告基因 使用pGL4.10[Luc2]（Promega）載體，將人RAG2轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）5′上游（-1746、-789、-323、-157、-129、-108、-70、-9 bp）至+104 bp區(qū)域連接至Sac Ⅰ/Xho Ⅰ位點。

1.3.2 pGLhR2G3m（GATA3結(jié)合位點突變載體） 將pGLhR2-108/+104的GATA3位點突變（TAAATC→TAAAAG）。

1.3.3 GATA3表達載體pEF1-hGATA3 將含CDS（GeneBank Accession：NM001002295）區(qū)域的2.4 kb片段從全長GATA3 cDNA克?。℅ENECHEM）中切出（EcoR Ⅰ/Xba Ⅰ），插入pEF1載體（Invitrogen）的相同位點。

1.3.4 pEF1-hG3KRR（GATA3DNM表達載體） 按照Smith等[12]的方法，將GATA3鋅指結(jié)構(gòu)中的KRR突變?yōu)锳AA。引入KRR突變的寡核苷酸序列為5′-CTCATTAAGCCCGCGGGCAGCGCTGTCTGCAGCC-3′和5′-GGCTGCAGACAGCGCTGCCGCGGGCTTAATG ？鄄AG-3′。各克隆經(jīng)DNA測序驗證。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染和TF過表達及DNM表達

1.4.1轉(zhuǎn)染試驗 使用DEAE（diethylaminoethyl）-葡聚糖方法和雙熒光素酶（Luc2/hRLuc）報告基因系統(tǒng)（Pro？鄄mega），轉(zhuǎn)染效率內(nèi)控使用pGL 4.74[hRLuc/TK]載體[7]。

1.4.2 TF過表達 與pGLhR2報告基因共轉(zhuǎn)染，不同劑量的GATA3表達載體用pEF1載體調(diào)節(jié)為相同的DNA總量。

1.4.3 DNM表達 轉(zhuǎn)染pEF1-hKRRG3，DNA總量的調(diào)節(jié)方法同上。結(jié)果以3次試驗值的均數(shù)與標準差表示。

1.5膠遷徙試驗

細胞核蛋白提取方法如前所述[8]。凝膠遷徙試驗（electrophoresis mobility shift assay，EMSA）采用LightShift Chemiluminescent EMSA kit（PIERCE），按照kit標準流程操作。超遷徙（supershift）試驗：在加入探針之前，預(yù)先將核蛋白與1 g抗人GATA3多克隆抗體（Santa Cruz）或?qū)φ誌gG混合。細胞核蛋白結(jié)合競爭試驗：含有GATA3共有結(jié)合序列（consensus sequence）或突變的GATA3結(jié)合序列的寡核苷酸序列分別為5′-GAAGTGAAAGAGTTAAATCCTGAGGGTAAC-3′和5′-GAAGTGAAAGAGTTAAAAGCTGAGGGTAAC-3′。

1.6染色質(zhì)免疫沉淀

染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）試驗按照Hao等[13]的方法稍作調(diào)整。將5×106 細胞用1%甲醛交聯(lián)。采用超聲破碎儀（SONICS）將染色質(zhì)DNA斷裂為200～1000 bp片段，采用Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA（Beyotime）清洗、回收DNA。加入2 g鼠抗人GATA3抗體（Santa Cruz）或?qū)φ沼檬驣gG，Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA沉淀，同時設(shè)未加抗體對照組用。免疫沉淀物經(jīng)清洗、解除交聯(lián)、脫蛋白及回收DNA后，進行PCR檢測。人RAG2啟動子特異性引物序列為5′-TCAAGTTTTGCCCAGAT？鄄TTC-3′和5′-CCCTCAGGAT？鄄TTAACTCTTTCAC-3′。

1.7 qRT-PCR檢測mRNA表達

RNAiso Plus（TaKaRa）純化的總RNA，采用OrimeScript RT reagent kit（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄cDNA。qRT-PCR測定mRNA表達時，用SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa）。以人Acin為管家基因，各樣品檢測數(shù)據(jù)進行3～6次重復(fù)試驗，通過2-ΔΔCT方法計算目的mRNA的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1人RAG表達時，RAG2基因5′上游近端區(qū)域的染色質(zhì)在T與B細胞中處于不同的開放狀態(tài)

染色質(zhì)特異性開放往往與順式轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的存在相關(guān)[11，14]。將RAG+、RAG-淋巴細胞以及非淋巴細胞的RAG2 5′上游區(qū)域的DHS進行比較分析，結(jié)果如圖1和圖2A所示，在RAG+T細胞中，RAG2 TSS/-140 bp區(qū)域?qū)Nase Ⅰ高度敏感（敏感性>90%），-257 bp區(qū)域降至40%～60%，-337/-456 bp區(qū)域進一步下降至10%～20%。而-458/-695 bp區(qū)域再次升高至90%。-730 bp以上區(qū)域敏感性消失。RAG+B細胞的開放區(qū)更大（TSS/-257 bp），其他區(qū)域與RAG+T細胞相同，而上述區(qū)域在RAG-淋巴細胞及非淋巴細胞中均未檢測到DHS，提示染色質(zhì)結(jié)構(gòu)水平的調(diào)控對于RAG2表達的特異性具有重要作用，人T、B細胞RAG2啟動子范圍明顯不同，分別在TSS至-140 bp和-257 bp區(qū)域內(nèi)。

2.2 RAG+T細胞的核心啟動子活性與DHS相吻合

為了分析T細胞DHS與轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的關(guān)系，本研究進行了報告基因轉(zhuǎn)染試驗（圖2B）。pGLhR2報告基因被轉(zhuǎn)染于RAG+T淋巴細胞（CCRF-CEM或Jurkat），結(jié)果如圖2B所示，-1746/+104 bp的轉(zhuǎn)錄活性由5′端刪除至-157 bp未受影響，而逐步刪除至-129、-108、和-70 bp時，活性依次明顯下降，至-9 bp時完全消失，提示在RAG+T細胞中，人RAG2啟動子的核心區(qū)域為TSS/-129 bp，與T細胞特異性DHS所在區(qū)域相吻合，而-458/-695 bp的DHS對活性無影響，可能屬于無核小體區(qū)域。

2.3 T細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA3結(jié)合于DHS中的高度保守區(qū)域

以往發(fā)現(xiàn)的順式轉(zhuǎn)錄元件多屬于生物進化過程中高度保守的同源序列[15]，因此，本研究使用ENCODE[16]對T細胞DHS區(qū)域進行同源性分析，結(jié)果顯示DHS中的-85 bp/-77 bp在人與其他6種不同科目哺乳動物之間同源性為100%（圖3A）。使用JASPAR數(shù)據(jù)庫對該區(qū)域進行TF結(jié)合序列預(yù)測，結(jié)果顯示，該區(qū)域存在T細胞特異性TF GATA3的共結(jié)合序列（82-DGATWD-77）（圖3B）。為研究GATA3是否能夠結(jié)合于該82/77位點，采用CCRF-CEM（RAG+人pre-T）提取的核蛋白和-96/-66探針做EMSA，結(jié)果如圖3C，2個核蛋白-DNA復(fù)合體被檢測出，并且都能夠被過量（200倍）的-96/-66寡核苷酸競爭掉，即兩者均為核蛋白-DNA探針的特異性結(jié)合產(chǎn)物。其中1個復(fù)合體（C）能夠被100或200倍過量的人GATA3共結(jié)合序列特異性競爭，而GATA3結(jié)合位點突變體（mGATA3）的競爭作用消失。此外，抗人GATA3抗體（-GATA3）能夠與復(fù)合體中的GATA3特異性結(jié)合，形成超遷徙復(fù)合體，而陰性對照抗體（IgG）無超遷徙作用，提示RAG+人T細胞表達的GATA3能夠特異性結(jié)合于高度保守的-82/-77位點。

為進一步探討GATA3在染色質(zhì)水平的結(jié)合，本研究進行了Chip試驗，結(jié)果如圖3D所示，在RAG+T細胞（CCRF-CEM）中，抗人GATA3抗體（GATA3）而非對照IgG，能夠?qū)⒔Y(jié)合于-157/-69 bp區(qū)域的GATA3沉淀，提示當(dāng)人T細胞表達RAG時，GATA3特異性的結(jié)合處于開放狀態(tài)的RAG2啟動子核心區(qū)域。

2.4 GATA3特異性上調(diào)RAG2在人T淋巴細胞中的表達

為探明GATA3的調(diào)控作用，本研究使用TF結(jié)合位點突變和TF過表達方法研究GATA3對報告基因中RAG2啟動子活性的影響，并且使用TF共顯性負突變方法研究GATA3對RAG2表達的直接調(diào)控作用，結(jié)果如圖4A所示，將GATA3結(jié)合位點突變（pGLhR2 G3m）后，在CCRF-CEM細胞中的Luc相對活性下降 >40%（P<0.01），而在K562非淋巴細胞無明顯改變；將不同劑量的人GATA3（pEF1-hGATA3）與pGLhR2-108/-104共轉(zhuǎn)染于K562細胞后，Luc相對活性隨GATA3劑量的提高而逐步上升至1.8倍以上（圖4B）；將GATA3DNM轉(zhuǎn)染至CCRF-CEM T細胞后，由于對野生型GATA3的競爭作用，使RAG2 mRNA的相對表達量（與Acin管家基因比較）下調(diào)至約70%（圖4C）。上述結(jié)果提示，GTAT3的結(jié)合能夠明顯提高人RAG2啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，進而驅(qū)動內(nèi)源性RAG2的表達。

3討論

RAG1至今仍未發(fā)現(xiàn)任何特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，人們均傾向于RAG1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件缺乏特異性功能，而RAG2的調(diào)控元件不僅對RAG2自身，而且能夠調(diào)控RAG1基因的特異性轉(zhuǎn)錄[17]，本研究也是基于這一被普遍接受的推論。盡管小鼠的研究較為深入[4-10]，但目前人類RAG表達的特異性調(diào)控機制仍不清楚，因此對其開展研究十分必要。

真核細胞的基因組DNA以組蛋白為核心纏繞形成核小體，進而包裝成染色質(zhì)，并通過控制調(diào)節(jié)分子與DNA的結(jié)合，在關(guān)鍵的細胞核生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，包括基因調(diào)控、DNA修復(fù)和復(fù)制[18]。當(dāng)基因表達時，使用DNase Ⅰ酶檢測其DHS，是對順式轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件進行定位的重要手段[11，14]。本研究使用更精確的CHART-PCR技術(shù)，對人RAG2基因5′上游近端區(qū)域的DHS范圍進行定量分析。通過對不同細胞的比較分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人RAG表達時，RAG2啟動子核心區(qū)域的染色質(zhì)特異性開放，而且T與B細胞的特異性DHS區(qū)域范圍差異明顯，提示T和B細胞分別受不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件控制，這一觀察應(yīng)該能夠?qū)窈蟮难芯刻峁┯幸饬x的借鑒。此外，本研究觀察到的一個有趣現(xiàn)象是，在表達RAG的淋巴細胞中，RAG2基因上游稍遠端（-458～-695 bp）的DHS特異性出現(xiàn)，該區(qū)域在T和B細胞之間沒有區(qū)別，也未能證實其對T細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的影響。類似的現(xiàn)象也在一項關(guān)于IL-12 p40啟動子的研究中被報道[19]。至于這一RAG表達特異性的無核小體區(qū)域是否參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控以外的其他細胞核生物學(xué)過程，例如通過募集核蛋白分子影響基因表達特異性染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，尚需進一步研究。

GATA3是調(diào)控T細胞分化發(fā)育的關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子之一，從胸腺中早期祖T細胞（early T lineage progenitor，ETP）延續(xù)到外周成熟T細胞的終末階段（Th2 CD4+ T細胞）均發(fā)揮重要作用[20]。值得注意的是，GATA3對TCR、TCR和TCR啟動子或增強子的結(jié)合是驅(qū)動這些基因在胸腺T細胞中表達的最重要環(huán)節(jié)[21]，而此時也正是RAG表達的高峰階段。雖然曾經(jīng)在小鼠細胞的體外試驗中證實GATA3能夠結(jié)合于RAG2啟動子[7]，但是對于在體（in vivo）環(huán)境下GATA3的結(jié)合及調(diào)控作用仍未闡明。

本研究從基因表達特異性染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析入手，發(fā)現(xiàn)了DHS中新的GATA3結(jié)合位點，并通過同源序列分析揭示該GATA3結(jié)合序列在人類及多種不同哺乳動物之間高度同源，提示其為嚴酷的進化選擇過程中保留下來的重要序列。進一步的EMSA和Chip試驗證實了GATA3與該位點以及染色質(zhì)環(huán)境中DHS的結(jié)合，并且使用過量表達、結(jié)合位點突變體和GATA3DNM試驗證實了GATA3對人RAG2在T細胞中表達的特異性調(diào)控作用結(jié)果，因而對RAG2的T細胞特異性調(diào)控提供了初步試驗資料。進一步對其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件及TF的研究，特別是B細胞特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的研究將在后續(xù)報告中闡述。

致謝：衷心感謝Atsushi Muraguchi教授（Toyama Medical and Pharmaceutical University，Toyama，Japan）對本研究的指導(dǎo)性意見和嚴謹?shù)膶W(xué)術(shù)探討及批評。

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（收稿日期：2016-12-07 本文編輯：祁海文）