祁燕+董駿+易靜婷

摘要：目的觀察調(diào)胃消痞方對(duì)功能性消化不良（Functional Dyspesia，F(xiàn)D）大鼠胃腸動(dòng)力及血清胃動(dòng)素（MTL）、胃泌素（GAS）和血管活性腸肽（VIP）含量及胃竇組織Ghrelin表達(dá)的影響，明確其藥效及其可能的作用機(jī)制。方法運(yùn)用夾尾刺激加不規(guī)律飲食制備FD肝郁脾虛動(dòng)物模型，測定各組大鼠體重、胃殘留率及腸推進(jìn)率，酶聯(lián)免疫法（Elisa）檢測FD大鼠血清中MTL、GAS、VIP表達(dá)的改變，HE染色觀察胃竇黏膜病理變化；免疫組化染色觀察胃竇組織中Ghrelin的表達(dá)。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠體重、小腸推進(jìn)率明顯降低，胃殘留率明顯增多，血清MTL、GAS含量顯著降低，VIP含量顯著增加，胃竇組織中Ghrelin的表達(dá)明顯減少（P<0.05，P<0.01）；與模型組相比，調(diào)胃消痞方各組大鼠體重均不同程度增加，以高劑量組作用顯著（P<0.05）；胃內(nèi)殘留率明顯減少，小腸推進(jìn)率明顯增加，以高、中劑量組作用顯著（P<0.05）；調(diào)胃消痞高、中劑量組MTL含量、中劑量組血GAS含量明顯增加；高劑量組血清VIP含量顯著降低；調(diào)胃消痞方各組胃竇組織Ghrelin的表達(dá)明顯增加（P<0.05）。各組大鼠胃黏膜未見明顯異常。結(jié)論調(diào)胃消痞方可明顯改善功能性消化不良大鼠的胃腸功能，這可能與其促進(jìn)胃腸排空，增加血清MTL、GAS降低VIP含量，上調(diào)胃竇組織Ghrelin表達(dá)相關(guān)。

關(guān)鍵詞：調(diào)胃消痞方；功能性消化不良；胃腸動(dòng)力；胃腸激素

中圖分類號(hào)：R-33文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2017）12-0063-04

功能性消化不良（Functional Dyspesia，F(xiàn)D）為臨床常見消化系統(tǒng)疾病之一，具有慢性、復(fù)發(fā)性和難以緩解的特點(diǎn)，總患病率為11.5%～14.5%[1]。隨著生活節(jié)奏的加快，F(xiàn)D患病率逐年升高，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。目前西醫(yī)治療主要以促胃動(dòng)力藥為主，但不適用于所有的FD患者。FD是消化病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。中醫(yī)藥在治療胃腸運(yùn)動(dòng)障礙方面療效肯定。調(diào)胃消痞方是云南省名中醫(yī)龍祖宏教授基于50多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出的治療FD的有效方，臨床療效明確[2]，組方為黨參，茯苓，延胡索，川楝子，薏苡仁，炒枳殼，甘草等，全方具健脾疏肝，清熱消痞之功效。本方在疏肝、健脾同時(shí)兼顧其標(biāo)輔以除濕熱，但尚未從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)角度闡釋其有效性及作用機(jī)制。本研究擬復(fù)制肝郁脾虛FD動(dòng)物模型，從胃腸動(dòng)力功能障礙及胃腸激素改變水平探討調(diào)胃消痞方有效性及初步作用機(jī)制，為其臨床運(yùn)用提供科學(xué)依據(jù)，揭示中醫(yī)疏肝、理氣、健脾、除濕熱之治法治療FD的有效性現(xiàn)代生物學(xué)科學(xué)內(nèi)涵。

1材料

1.1動(dòng)物8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（200±15）g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2015-030。大鼠飼養(yǎng)于IVC動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，溫度20～25℃（日溫差≤3℃）；濕度40%～70%；照明12h：12h明暗交替，照度150～300lx；噪音≤60dB。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（滇）K2013-0002，發(fā)證單位：昆明市科學(xué)技術(shù)局。

1.2藥物與試劑實(shí)驗(yàn)用調(diào)胃消痞方采用黨參，茯苓，延胡索，川楝子，薏苡仁，炒枳殼，甘草等顆粒劑（由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）；枸椽酸莫沙必利片劑，由成都康弘藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)（國藥準(zhǔn)字：H20031110），批號(hào)：150519，5mg/片；MTL、VIP、GAS酶聯(lián)檢測試劑盒購自江蘇卡爾文生物有限公司，批號(hào)：20150802B；Rabbit anti-Ghrelin由北京博奧森生物技術(shù)有限公司（CatNo：bs-0791R）提供；DAB染色液（增強(qiáng)聚合物法）試劑盒由福州邁新生物公司提供，（CatNo：1603080015），批號(hào)：1603080015。

1.3儀器高速離心機(jī)，德國 Thermo Scientific Heraeus；Epoch 連續(xù)波長酶標(biāo)儀，美國 Bio-Tek公司；ASP300S 全自動(dòng)脫水機(jī)、RM2235輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、EG1150H+EG1130C 組織包埋機(jī)、DM2500正置顯微鏡+圖文系統(tǒng)（德國Leica）

2方法

2.1FD大鼠模型復(fù)制及分組給藥SD大鼠按體重隨機(jī)分為：正常對(duì)照組、模型組、莫沙必利組、調(diào)胃消痞方高、中、低劑量組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余各組老鼠按照采用“夾尾激怒加不規(guī)律飲食法”制造FD模型[3]：各組老鼠均給予正常喂水，單日喂食，雙日禁食同時(shí)用長海綿鉗夾大鼠尾巴遠(yuǎn)端1/3處，以不破皮為度，令其暴怒，尋釁與其他大鼠撕打，以激怒全籠大鼠。每次刺激30 min，30 min內(nèi)連續(xù)不斷地刺激，隨著打斗的加劇，大鼠可能被抓傷，為避免炎癥干擾，可用0.5%的碘伏涂擦受傷部位，以控制感染，每隔3h刺激1次，每日2次。造模同時(shí)，各組大鼠灌胃給藥，調(diào)胃消痞方高、中、低劑量組根據(jù)原方比例配置，分別按生藥劑量為36.6、18.3、9.15 g/kg；莫沙必利組予莫沙必利5 mg/kg；空白對(duì)照組及模型組以等體積生理鹽水灌胃，每天給藥1次，持續(xù)給藥21d。

2.2營養(yǎng)性半固體糊的制備[4]取羧甲基纖維素納 5 g，溶于 100 mL蒸餾水中，分別加入奶粉 8 g，糖4 g，淀粉 4 g，碳素墨水 2 mL，攪拌均勻，配制成約 150 mL的黑色半固體糊狀物，冰箱冷藏，用時(shí)恢復(fù)至室溫。

2.3標(biāo)本采集及檢測方法

2.3.1一般狀態(tài)觀察每日觀察大鼠日常的精神狀態(tài)、毛色、活動(dòng)度、對(duì)束縛的反應(yīng)程度、體重、食量、糞便變化等全身情況。

2.3.2胃排空率及小腸推進(jìn)率檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食不禁水24 h，每只大鼠按灌服營養(yǎng)性半固體糊2 mL，30 min 后予以 10% 水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，常規(guī)消毒后用手術(shù)剪刀沿腹正中線剪開腹腔，于腹主動(dòng)脈采血后，結(jié)扎賁門及幽門處，截取胃囊。濾紙擦拭干后稱重，然后沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內(nèi)容物后拭干，再次稱重。以前后兩次稱重得出的差值記為胃內(nèi)殘留物重，計(jì)算胃內(nèi)殘留物質(zhì)占所給營養(yǎng)糊的重量百分比即為胃殘留率。胃內(nèi)殘留率（%）=胃內(nèi)殘留物重（g）/灌胃的營養(yǎng)糊重（g）×100%[5]，小腸總長度為幽門到回盲部的距離，小腸推進(jìn)長度為幽門至黑色營養(yǎng)性半固體糊前沿的距離。小腸推進(jìn)率（%）=（小腸推進(jìn)長度/小腸總長度）×100%

2.3.3MTL、VIP、GAS的測定采用腹主動(dòng)脈采血，靜置、3000 rpm/min離心15 min后取上清液，按照elisa檢測試劑盒說明書方法檢測各組大鼠血清中MTL、VIP、GAS的含量。

2.3.4胃竇黏膜組織病理情況的觀察取出胃體并清洗稱量后，每組分別選取5只大鼠取胃竇部一段組織，10%中性甲醛固定，按照HE染色法常規(guī)步驟脫水、包埋、切片、染色后觀察胃竇組織病理情況改變。

2.3.5免疫組化測定胃竇組織Ghrelin的表達(dá)采用增強(qiáng)聚合物法按試劑盒操作說明書進(jìn)行，在實(shí)驗(yàn)過程中加空白對(duì)照（以PBS代替各種一抗）。經(jīng)去除內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復(fù)后，一抗孵育過夜，一抗稀釋比例為（1：200），二抗孵育，DAB顯色封片后顯微鏡下觀察，以胞漿內(nèi)Ghrelin陽性產(chǎn)物呈深黃色或棕黃色者為強(qiáng)陽性，黃色為陽性，淺黃色為弱陽性，與背景同色者為陰性。由醫(yī)學(xué)圖文分析軟件設(shè)置相等的檢測窗口面積為平均陽性細(xì)胞面積。隨機(jī)選相互不重疊的 5個(gè)視野于200倍下計(jì)算Ghrelin陽性細(xì)胞數(shù)。

2.4數(shù)據(jù)處理計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，方差齊時(shí)組間比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)組間比較采用Dunnetts T3檢驗(yàn)；偏態(tài)分布用秩和檢驗(yàn)。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3結(jié)果

3.1造模大鼠一般情況觀察造模過程中，所有大鼠出現(xiàn)進(jìn)食、飲水量減少；煩躁、易怒、且造模時(shí)大鼠廝打爭斗加??；皮毛逐現(xiàn)暗淡，枯黃，大便稀溏、穢臭。與FD模型相符。莫沙必利及調(diào)胃消痞方各劑量組以上狀態(tài)較模型組有所好轉(zhuǎn)，體重增加。

3.2各組大鼠體重比較造模前，各組大鼠無顯著性差異。造模開始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，模型組大鼠體重較正常對(duì)照組大鼠明顯減輕，經(jīng)藥物干預(yù)后，莫沙必利及調(diào)胃消痞方高劑量組體重明顯高于模型組，調(diào)胃消痞方中、低劑量組體重較模型組有所增加，但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1。

3.3調(diào)胃消痞方對(duì)FD大鼠胃腸運(yùn)動(dòng)功能的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠胃內(nèi)殘留率顯著升高，腸推進(jìn)率顯著降低；與模型組比較，莫沙必利組及調(diào)胃消痞方高劑量組可顯著促進(jìn)大鼠胃排空、腸推進(jìn)，大鼠胃內(nèi)殘留率明顯降低，腸推進(jìn)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；消痞方中劑量組僅對(duì)腸推進(jìn)具有明顯增加作用；消痞方低劑量組對(duì)胃內(nèi)殘留率、腸推進(jìn)率影響無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2。

3.4調(diào)胃消痞方對(duì)FD大鼠血清MTL、VIP、GAS含量的影響Elisa檢測結(jié)果顯示，模型組大鼠血清MTL、GAS含量顯著降低，VIP含量顯著增加，與正常對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)藥物干預(yù)后，莫沙必利組、調(diào)胃消痞高、中劑量組MTL含量較模型組顯著增加，調(diào)胃消痞方中劑量組血GAS含量較模型組明顯增加；同時(shí)，莫沙必利組及調(diào)胃消痞方高劑量組血清VIP含量較模型組顯著降低。調(diào)胃消痞方低劑量組對(duì)MTL、VIP、GAS含量均無明顯影響。見表3。

3.5調(diào)胃消痞方對(duì)FD大鼠胃竇黏膜組織病理改變的影響經(jīng)HE染色、顯微鏡下觀察胃竇黏膜形態(tài)改變。結(jié)果顯示：各組大鼠胃竇黏膜均未出現(xiàn)明顯病理變化，無萎縮、糜爛、增生、炎癥細(xì)胞明顯滲出等病理變化。見圖1。

3.6調(diào)胃消痞方對(duì)FD大鼠胃竇黏膜組織Ghrelin的表達(dá)的影響模型組大鼠胃竇組織Ghrelin陽性細(xì)胞數(shù)較正常組明顯減少，經(jīng)藥物干預(yù)后，莫沙必利及調(diào)胃消痞方各劑量組Ghrelin表達(dá)均顯著增加，以高劑量組作用顯著。見表4。圖2。

4討論

FD為多發(fā)性、無任何器質(zhì)性病變的常見消化系統(tǒng)疾病，以餐后飽脹、上腹痛、噯氣等一種或多種持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的癥狀為其主要臨床特征。研究顯示，F(xiàn)D可能為胃腸動(dòng)力障礙、心理因素、胃腸激素分泌異常多因素綜合作用的結(jié)果，而胃腸動(dòng)力不足與FD發(fā)病最為密切[6]，胃腸排空延遲則是FD發(fā)病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)[7]。心理因素與FD發(fā)病亦密切相關(guān)，現(xiàn)代研究表明：有23.6%的FD患者有焦慮抑郁癥狀[1]。在焦慮、抑郁狀態(tài)下腦腸軸可使胃腸運(yùn)動(dòng)功能減弱或抑制，胃腸分泌功能紊亂，胃腸激素（或腦腸肽）分泌減少。其臨床主要表現(xiàn)為胃排空障礙。

胃腸激素MTL廣泛分布于消化系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可刺激胃蛋白酶分泌，提高胃腸道張力、收縮力，促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)，加速胃排空。由胃竇及十二指腸黏膜G細(xì)胞分泌的GAS可促進(jìn)胃體及幽門收縮進(jìn)而加速胃排空，還可刺激胃酸、胃蛋白酶分泌，提高消化功能。VIP為一種抑制胃腸運(yùn)動(dòng)的神經(jīng)遞質(zhì)和腦腸肽激素，通過食物對(duì)胃腸道刺激、體液因素等多種途徑釋放，可舒張胃腸平滑肌及括約肌[8]。Ghrelin為一種內(nèi)源性腦腸肽及重要神經(jīng)遞質(zhì)[7]，參與調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)功能及胃酸分泌。而胃動(dòng)素（MTL）、胃泌素（GAS）、血管活性肽（VIP）等胃腸激素的異常參與FD發(fā)病過程。

中醫(yī)學(xué)眾多醫(yī)家對(duì)FD病機(jī)研究認(rèn)為，F(xiàn)D的基本病機(jī)為“脾虛氣滯”，誘因?yàn)轱嬍?、情志、濕熱、感寒等。無論何種病因、病理過程，均可致脾胃虛弱、濕濁內(nèi)生，濕濁郁久化熱，濕熱阻滯中焦，該病多見本虛標(biāo)實(shí)之證，脾虛為本，濕熱為標(biāo)，臨床多見為寒熱錯(cuò)雜證[9]，治療時(shí)當(dāng)以疏肝健脾為主，同時(shí)兼顧癥候輔以平調(diào)寒熱等治法。中醫(yī)通過運(yùn)用疏肝理氣法可促進(jìn)胃排空及小腸推進(jìn)[10]。

調(diào)胃消痞方云南省名中醫(yī)龍祖宏教授50多年多年以來治療功能性消化不良的經(jīng)驗(yàn)方，全方由四君子湯、金鈴子散加味化裁而來，全方共奏補(bǔ)脾、舒肝、調(diào)氣機(jī)、除濕熱之功。方中黨參、茯苓、白術(shù)、甘草共湊益氣健脾之功，延胡索、川楝子具疏肝泄熱、活血止痛之功，清熱除濕組合之竹茹清熱化痰、除煩止嘔，蒲公英清熱解毒，薏苡仁健脾利濕，清熱排膿；炒枳殼、蘇梗理氣行氣滯寬中，氣行、濕化則熱孤；炒神曲健脾和胃，消食調(diào)中。補(bǔ)虛而不忘祛邪，達(dá)標(biāo)本兼顧之效。本研究復(fù)制肝郁脾虛FD模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)D大鼠經(jīng)調(diào)胃消痞方干預(yù)后，胃排空及腸推進(jìn)明顯增加，提示調(diào)胃消痞方具促進(jìn)FD大鼠胃腸動(dòng)力，改善胃腸功能障礙的作用，為進(jìn)一步明確對(duì)FD大鼠胃腸激素的影響，經(jīng)檢測FD大鼠血清MTL、GAS、VIP含量，結(jié)果表明模型組大鼠血清MTL、GAS含量顯著降低，VIP含量顯著增加。調(diào)胃消痞高、中劑量組MTL含量較模型組顯著增加，調(diào)胃消痞方中劑量組血GAS含量較模型組明顯增加；調(diào)胃消痞方高劑量組血清VIP含量較模型組顯著降低。調(diào)胃消痞方低劑量組對(duì)MTL、VIP、GAS含量均無明顯影響。同時(shí)免疫組化檢測結(jié)果顯示調(diào)胃消痞方可上調(diào)胃竇黏膜Ghrelin表達(dá)，提示，調(diào)胃消痞方在一定劑量范圍可通過增加MTL、GAS含量，降低VIP含量，上調(diào)Ghrelin表達(dá)而改善胃腸道排空障礙，改善FD癥狀。調(diào)胃消痞方臨床有效性可能與其調(diào)節(jié)以上胃腸激素水平，改善胃腸動(dòng)力密切相關(guān)。同時(shí)本研究也進(jìn)一步證實(shí)中醫(yī)疏肝、健脾、理氣、除濕熱之治法治療FD的有效性。本方的具體作用機(jī)制等尚待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-09-22）