尚東維 李景龍 石洪玥 孫學(xué)亮 方珍珍 季延濱 陳成勛

摘要：MITF，即小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 （microphthalmia-associated transcription factor），其在黑色素細胞的發(fā)育和分化中具有核心的調(diào)控作用。為了解色素相關(guān)基因和體色之間的關(guān)系，應(yīng)用分析血鸚鵡的表達譜，采用實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)技術(shù)，從血鸚鵡（Amphilophus）魚鰭與魚皮中提取RNA，通過Primer 5軟件設(shè)計擴增血鸚鵡Mitfa基因片段的引物并進行qPCR評估，為血鸚鵡Mitfa基因表達的qPCR分析奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：血鸚鵡魚；Mitfa；實時熒光定量PCR

鸚鵡魚（Amphilophus）中的商業(yè)品種有血鸚鵡、元寶紅、金剛鸚鵡等，其中血鸚鵡最具代表性，最為普及，是目前在我國生產(chǎn)量和消費量最多的熱帶魚之一[1]。因其色彩艷麗，嘴型酷似鸚鵡嘴型而得名。血鸚鵡魚體形近似球形或卵圓形，背圓、尾鰭發(fā)達，全身幾乎血紅色，長著三角嘴，受到魚迷們喜愛[2]。血鸚鵡（Cichlasoma citrinellum♀×C.synspilum♂），鱸形目（Perciformes）。幼年呈灰白的體色，成年呈粉紅或血紅色，魚體體態(tài)臃腫，成魚體長15～20 cm，體形寬厚，呈橢圓形。

關(guān)于魚類色素細胞的分類，目前普遍認為主要有紅色素細胞、黃色素細胞、虹彩細胞、黑色素細胞這4種類型的魚類色素細胞[3-4]。目前已知能調(diào)控黑色素合成的有三種信號通路：腺苷酸環(huán)化酶、酪氨酸激酶、蛋白激酶，可見，對于黑色素合成的這三種信號通道來說，黑色素細胞的增殖或黑色素顆粒的形成可通過激活其任意通路而被激活成功[5]。黑色素顆粒體現(xiàn)為黑色主要是由于其吸收了特定的波長光，這一過程中有多巴胺和酪氨酸參與，在一系列復(fù)雜的反應(yīng)后合成[6]。具體過程可簡化為酪氨酸-多巴-多醌-多巴色素-5，6-二羥基吲哚酸或5，6-二羥基吲哚-5，6吲哚醌-真黑素[7]。

黑色素細胞普遍存在于動物的體表皮膚中，其中內(nèi)含黑色素顆粒，色調(diào)介于褐色至黑色區(qū)間內(nèi)，可溶于細胞質(zhì)中。Mitf基因在魚類色素細胞分化和成熟過程中有著很大的作用，與黑色素細胞分化而言是其重要的轉(zhuǎn)錄因子[8]。

Mitf來源于神經(jīng)嵴細胞。Mitf基因至少有6個異構(gòu)體分別是Mitf-A、-B、-C、-D、-H和-M，這是通過蛋白氨基酸端的不同來區(qū)分的[9]。Mitf基因可以被剪切或者突變，可使其第一個外顯子出現(xiàn)差異，從而出現(xiàn)編碼不同氨基端結(jié)構(gòu)的結(jié)果[10]。研究表明，Mitf-A在視網(wǎng)膜色素上皮細胞等多種培養(yǎng)細胞中有表達，其中瞬時共轉(zhuǎn)染實驗表明了Mitf-A可激活酪氨酸激酶和相關(guān)蛋白基因[11]。另有研究表明，酪氨酸基因家族的表達也可以通過Mitf基因調(diào)控[12]。

實時熒光定量 PCR（ real-time fluorescence quantitative PCR，RT-PCR） 是一種核酸定量分析技術(shù)，以其特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具。其原理為通過探測PCR反應(yīng)中熒光信號的變化，獲得特定區(qū)段中擴增產(chǎn)物的定量結(jié)果[13-15]。

本文應(yīng)用實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)分析血鸚鵡Mitfa基因的表達，旨在為分析血鸚鵡Mitfa基因的表達機理奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1試驗魚

試驗用魚取自天津?qū)氎胬镒怨良魏烫镌答B(yǎng)殖基地，解剖取出其皮、鰭，液氮中迅速冷凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2總RNA提取

分別取血鸚鵡的鰭和皮，加入200 μL的RNA iso Plus，在組織破碎儀中4 500 r/min 6～10 min，再加入1 mL RNA iso Plus，靜置5 min，4 ℃ 12 000 r/min 離心5 min，取其上清1 mL移入新離心管中，加入200 μL氯仿混勻，靜置5 min，4 ℃ 12 000 r/min 離心15 min，取上清加入500 μL異丙醇，放置10 min，4 ℃ 12 000 r/min 離心10 min，加入75%乙醇1 mL，4 ℃ 12 000 r/min 離心5 min，棄乙醇，保留沉淀并將沉淀干燥2～5 min后，溶于DEPC中，充分溶解后，保存在-80 ℃冰箱中。溶解后用超微量紫外分光光度計于260 nm和280 nm波長下測定RNA溶液的吸光值分析純度，最后再用1%的普通瓊脂糖凝膠、5 V/cm的恒壓電泳分離提取出的RNA，凝膠成像系統(tǒng)觀察與拍照。

1.3cDNA第一條鏈的合成

依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進行試驗，在離心管中加入1 μL Oligo dT Primer，1 μL dNTP Mixture，計算好標定為1 000 mg/μL的提取得到的RNA模板溶液，再加上ddH2O配平至10 μL，放入65 ℃水浴鍋中反應(yīng)5 min，迅速冷卻，加4 μL 5×Prime ScriptⅡBuffer，0.5 μL RNase lahibitor，1 μL Prime Script Ⅱ RTase與離心管中，最后加入4.5 μL ddH2O于45 ℃水浴中反應(yīng)45 min，95 ℃水浴5 min，冷卻，最后將得到的cDNA產(chǎn)物放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物的設(shè)計、常規(guī)PCR的篩選

依據(jù)GenBank公布的橘色雙冠麗魚基因序列信息（GenBank檢索號：AY206404.1），應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計引物（引物見表2），引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

選取任意個體的皮、鰭的cDNA進行Mitfa基因片段的常規(guī)PCR擴增。擴增體系為反轉(zhuǎn)錄好的cDNA 1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，ddH2O 15.3 μL，dNTP 2 μL，測試上游引物、測試下游引物各2 μL，Taq 0.2 μL，共25 μL于離心管中，擴增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，一定退火溫度退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)35次。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠、5 V/cm的恒壓電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)觀察與拍照。

通過雙向測通的方法對得到的 Mitfa基因的單一PCR 擴增產(chǎn)物進行雙向測序（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

1.5qPCR 引物的設(shè)計與評估

依據(jù)本試驗獲得的Mitfa序列以及qPCR擴增的引物設(shè)計原則，對用于qPCR分析的引物，經(jīng)過常規(guī)PCR檢測后，進行qPCR擴增。

擴增體系如下：6 μL ddH2O、0.4 μL ROX Ⅱ、0.8 μL正向引物、0.8 μL反向引物、2 μL模板和10 μL SYBR。擴增循環(huán)：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，退火溫度30 s，72 ℃延伸25 s，共進行40個循環(huán)。

優(yōu)化退火溫度：根據(jù)引物的Tm值，設(shè)置不同梯度的退火溫度，對Mitfa的基因片段進行qPCR擴增。每個反應(yīng)進行3個技術(shù)重復(fù)，并設(shè)置陰性對照（模板cDNA由ddH2O替代 ）。

標準曲線的建立：以cDNA原液為最高濃度，采用10倍稀釋法獲得5個不同濃度的cDNA模板進行qPCR 擴增。每個反應(yīng)進行3個技術(shù)重復(fù)，并設(shè)置陰性對照（模板cDNA由ddH2O替代）。

2結(jié)果與分析

2.1總RNA的提取及檢測結(jié)果

血鸚鵡鰭、皮2種組織的總RNA經(jīng)檢測顯示28s rRNA、18s rRNA條帶亮度比值在1～2之間（圖1），OD260/OD280均在1.8～2.0之間。

2.2引物設(shè)計、常規(guī)PCR篩選及擴增子的驗證結(jié)果

依據(jù)GenBank檢索的基因序列，應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計得出的引物中，篩選出1對最適引物進行PCR 擴增，見表1。

以血鸚鵡鰭、皮2種組織的cDNA為模板，對表1顯示的引物進行常規(guī)PCR擴增篩選。圖2顯示：引物Mitfa-F、Mitfa-R的擴增產(chǎn)物僅有一個擴增條帶，測序序列包含引物為311 bp。

皮2、鰭1、鰭2的擴增產(chǎn)物電泳圖譜對普通PCR擴增后所得的單一產(chǎn)物進行測序，所得序列片段長度為311 bp。對測序所得的Mitfa序列進行 BLAST比對，結(jié)果表明：測序所得Mitfa基因與已報道的布氏鯛Mitfa的cDNA序列（序列號：AB178923.1）同源性為97%；與已報道的尼羅羅非魚 Mitfa的cDNA序列（序列號：AB178918.1）同源性為97%；與已報道的三湖慈鯛Mitfa的cDNA序列（序列號：AB178924.1）同源性為96%；與已報道的紅劍齒麗魚Mitfa的cDNA序列（序列號：AB178921.1）同源性為 96%；與已報道的黃金雀魚Mitfa的cDNA序列（序列號：AB178920.1）同源性為 96%（均見表2）。

（A）、融解曲線（B）和標準曲線（C）

3討論

在運用實時熒光定量 PCR方法檢測特異基因表達量的差異時，總RNA的質(zhì)量是關(guān)鍵。若總RNA被降解，則mRNA的完整性得不到保證，進而不能真實反映起始模板中基因表達量的差異。因此，檢查每個RNA樣品的完整性和純度十分重要，通過瓊脂糖或甲醛變性電泳分析證明，若總RNA完整則一般在電泳圖上會出現(xiàn)兩條帶28 s和18 s[16]。在反轉(zhuǎn)錄之前，總RNA的定量也是實驗的關(guān)鍵步驟，通過測定RNA的量來調(diào)平起始模板濃度，進而真實反映基因表達的實際情況[17]。

引物設(shè)計的原則：引物的長度一般為15～30 bp，最好在18～24 bp， 因為太短易形成錯配 （Falsc priming）降低特異性，而太長也會降低特異性，并且降低產(chǎn)量[18]。引物序列的GC含量最好在40%～60%，且上下游引物序列GC含量的差異不要太大，3端最后5個堿基最好不要富含GC，特別是連續(xù)3個G或C。如果以DNA為模板設(shè)計引物，產(chǎn)物長度在100～600 bp比較理想。而當模板為mRNA時，設(shè)計引物其產(chǎn)物長度則在150～300 bp為宜。

為了客觀地比較不同樣本中目的基因表達量的多少，消除由于反轉(zhuǎn)錄時總RNA濃度差異造成的誤差，要選擇合適的內(nèi)參基因，其中常用的有β-actin，18s rRNA。我們可以根據(jù)實際情況的不同，選擇不同的內(nèi)參基因作參照[19]。根據(jù)楊桂梅、鮑寶龍[20]得出的實驗結(jié)果顯示，GAPDH可能與魚體的變態(tài)有關(guān)；而β-actin基因表達量在發(fā)育各期變化幅度不大，相對較穩(wěn)定，表現(xiàn)出適宜成為管家基因的特點。

引物進行最終的評估要求有：一是PCR擴增的特異性和效率。經(jīng)過PCR條件優(yōu)化后能否獲得特異性條帶，即無目的條帶之外的多余條帶。另外，PCR產(chǎn)物的量是否足夠，即不出帶和條帶很弱的現(xiàn)象。二是以DNA為模板設(shè)計引物時，PCR擴增產(chǎn)物是否與預(yù)期PCR產(chǎn)物大小相當。如果相差太大（大于100 bp），有可能是錯配產(chǎn)物。三是是否形成引物二聚體帶[21]。

PCR反應(yīng)的特異性是由一對上下游引物所決定的。引物的好壞往往是 PCR反應(yīng)成敗的關(guān)鍵。根據(jù)目的基因的mRNA序列正確設(shè)計引物，除滿足引物設(shè)計的基本要求外，還應(yīng)考慮目的基因和內(nèi)參引物的預(yù)期退火溫度，二者應(yīng)盡量相符。

引物除了具有擴增特異性外還應(yīng)具有良好的擴增效率。qPCR的擴增效率一般通過建立標準曲線來確定。擴增標準為其擴增效率達到90%～105%，且擴增曲線間隔均勻、標準曲線的決定系數(shù)（R2）>0.980[22-23]。

本試驗中：前期RNA樣本的28 s/18 s rRNA的條帶亮度比值在1.0～2.0之間，表示了RNA完整性良好，OD260/OD280的數(shù)據(jù)結(jié)果也顯示出了RNA的純度。在反轉(zhuǎn)錄為DNA前，均先將需反轉(zhuǎn)錄的RNA的濃度均標定為1 000 mg/μL，再進行的后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄試驗。在引物設(shè)計上，設(shè)計引物的理論值為311 bp。在內(nèi)參基因方面，本實驗選取β-actin作為試驗的內(nèi)參基因，同時也選取與內(nèi)參基因退火溫度相一致的目的基因進行后續(xù)實驗。結(jié)果顯示引物Mitfa2在qPCR擴增時，融解曲線為單一尖銳峰；標準曲線分析顯示：引物的擴增效率為101.5%，R2值為0.989。上述結(jié)果說明該對引物具有良好的擴增特異性和擴增效率，滿足了qPCR擴增的要求。

參考文獻：

[1] 汪學(xué)杰，牟希東，胡隱昌，等.血鸚鵡魚的池塘養(yǎng)殖技術(shù)[J].中國水產(chǎn)，2010（3）：39-40.

[2] 洪偉.明清以來傳統(tǒng)魚類分類方法研究（1491-1947） -以福建省為中心[D].上海交通大學(xué)，2013（1）：36-37.

[3] 陳楨.金魚家化史于品種形成的因素[J].動物學(xué)報，1954，6（2）： 89-116.

[4] Fujii R.The regulation of motile activity in fish chromatophores[J].Pigment Cell & Melanoma Research，2000，13（5）：300-319.

[5] 伍革民，彭光旭.動物黑色素研究進展[J].甘肅畜牧獸醫(yī)，2005，35（1）：39-41.

[6] Oshima N，Nakamaru N，Araki S，et al.Comparative analyses of the pigment-aggregating and -dispersing actions of MCH on fish chromatophores.[J].Comparative Biochemistry & Physiology Toxicology & Pharmacology Cbp，2001，129（2）：75-84.

[7] 舒文，毛華明.黑色素的研究進展[J].國外畜牧學(xué)-豬與禽，2003，23（2）：31-34.

[8] Stephen L Johnson，AnhThu N Nguyen，James A Lister.Mitfa is required at multiple stages of melanocyte differentiation but not to establish the melanocyte stem cell.[J].Developmental Biology，2011，350（2）：405-413.

[9] Hartman M L，Czyz M.MITF in melanoma： mechanisms behind its expression and activity[J].Cellular & Molecular Life Sciences Cmls，2015，72（7）：1249-1260.

[10] Altschmied J，Delfgaauw J，Wilde B，et al.Subfunctionalization of Duplicate mitf Genes Associated With Differential Degeneration of Alternative Exons in Fish[J].Genetics，2002，161（1）：259-267.

[11] Amae S，F(xiàn)use N，Yasumoto K，et al.Identification of a novel isoform of microphthalmia-associated transcription factor that is enriched in retinal pigment epithelium.[J].Biochem Biophys Res Commun，1998，247（3）：710-715.

[12] Fang D，Setaluri V.Role of microphthalmia transcription factor in regulation of melanocyte differentiation marker TRP-1[J].Biochem Biophys Res Commun，1999，256（3）：657-663.