劉燕，馮利興

（1.復旦大學生命科學學院，上海 200433；2.華東師范大學化學與分子工程學院，上海 200241）

肌肉鈣黏蛋白突變體構建和細胞內定位分析

劉燕1，馮利興2＊

（1.復旦大學生命科學學院，上海 200433；2.華東師范大學化學與分子工程學院，上海 200241）

為研究肌肉鈣黏蛋白（M-cadherin）三個鈣離子結合位點對肌肉鈣黏蛋白在細胞內定位的影響，以鼠肌肉鈣黏蛋白基因及其鈣離子結合位點突變序列為模板，利用PCR技術將其擴增后插入pEGFP-N1載體，使其與綠色熒光蛋白（GFP）融合表達。轉染HEK293細胞后，Western Blot檢測蛋白的表達，激光共聚焦顯微鏡觀察肌肉鈣黏蛋白及不同鈣離子結合位點突變體在HEK293細胞中的定位。結果顯示，肌肉鈣黏蛋白三個鈣離子結合位點分別突變之后，第二個鈣離子結合位點突變會導致肌肉鈣黏蛋白細胞內定位發(fā)生改變，使蛋白在細胞內的分布發(fā)生改變。該研究為深入研究肌肉鈣黏蛋白的結構和功能提供了基礎 。

肌肉鈣黏蛋白；鈣離子結合位點；細胞內定位

鈣黏蛋白是一類鈣離子依賴的介導細胞間黏附的跨膜糖蛋白，介導鈣離子依賴的細胞間黏附。肌肉鈣黏蛋白（M-cadherin）主要表達于骨骼肌細胞中[1]，故而命名為肌肉鈣黏蛋白。它表達于發(fā)育中的骨骼肌、二次肌生成等[2-3]，此外，也發(fā)現(xiàn)在肌肉神經接點、肌肉神經和中樞神經系統(tǒng)的兩個區(qū)域，即脊髓和小腦中也有表達[4-5]。從結構上看，肌肉鈣黏蛋白與其他鈣黏蛋白一樣，主要由胞外、跨膜及胞內肽段三部分組成。氮端的胞外結構域介導親同性結合，胞內肽段即胞質內的尾巴部分與連環(huán)蛋白結合，繼而與肌動蛋白連接于細胞骨架上，因此與胞外結構域耦聯(lián)介導動態(tài)的細胞內張力[6]。

細胞黏附蛋白影響細胞的形狀、極性、細胞骨架形成、細胞運動、增殖、細胞存活、細胞分化、細胞結構的完整性及功能[7-8]。肌肉鈣黏蛋白作為一種黏附蛋白，可以與胞內的連環(huán)蛋白形成兩種類型的復合物[9]：一種是鈣黏蛋白-連環(huán)蛋白復合物與細胞骨架相連，特別是肌動纖維系統(tǒng)[10]；另一種是肌肉鈣黏蛋白-連環(huán)蛋白復合物與微管相互作用，這是一種成肌細胞特異性行為[11]。

因為鈣黏蛋白是依賴鈣離子發(fā)揮功能，所以研究者們普遍認為在鈣黏蛋白的胞外段是存在鈣離子結合位點的。研究發(fā)現(xiàn)，鈣黏素家族的蛋白都至少有一個或多個鈣黏素重復序列 。一個鈣黏素重復序列是一個獨立的折疊序列，這個序列約有110個氨基酸，在這110個氨基酸中具有保守序列的模序，這些保守序列分別是天冬氨酸-精氨酸-谷氨酸（DRE）、天冬氨酸-X-天冬酰胺-天冬氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-脯氨酸-X-苯丙氨酸（DXNDNAPXF，X代表任意氨基酸）和天冬氨酸-X-天冬氨酸（DXD）[12]，鈣黏蛋白通過這些模序來結合鈣離子。在肌肉鈣黏蛋白中也存在這樣的鈣離子結合模序，從其氨基酸序列推測，肌肉鈣黏蛋白的胞外結構域含有三個鈣離子結合位點。

目前，人們對肌肉鈣黏蛋白的結構和功能的了解并不深入。比對發(fā)現(xiàn)人和鼠的肌肉鈣黏蛋白的保守性達到86%，其中鈣離子結合模序完全保守。鑒于鈣離子結合位點的重要性及保守性，在本文中，筆者構建了鼠肌肉鈣黏蛋白及三個鈣離子結合位點與綠色熒光蛋白融合表達的突變質粒，通過觀察肌肉鈣黏蛋白在HEK293細胞內的定位試圖找到對肌肉鈣黏蛋白細胞內定位影響最大的鈣離子結合位點，為深入研究肌肉鈣黏蛋白的功能和結構提供基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑

HEK293由本實驗室提供；pEGFP-N1載體由本實驗室保存；KOD plus DNA聚合酶購自TOYOBO公司；限制性內切酶包括NheI、KpnI，T4 DNA Ligase均購自NEB公司；鼠抗M-cadherin 單抗購自美國Millipore公司；兔抗GFP單抗購自美國CST公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（二抗）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、DNA產物純化試劑盒、質粒小量快速提取試劑盒、1kb plus DNA ladder均購自天根生化科技有限公司；DH5α感受態(tài)細胞由實驗室制備，DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovineserum,FBS）均購自美國Gibco公司；細胞裂解液（20mM HEPES，pH7.6，0.5mM EDTA，pH8.0，20%甘油，100mM KCl，0.5% Tween20）；免疫印跡顯色試劑盒購自美國的Thermo fisher scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCR擴增反應

以本實驗室保存的質粒為模板，第一個鈣離子結合位點為55、56、110、112、143、145、146位氨基酸，第二個鈣離子結合位點為第162、163、218、220、251、253、254位氨基酸，第三個鈣離子結合位點為第270、328、330、367、369、370位氨基酸，突變鈣離子結合位點的兩到三處氨基酸序列。設計1對引物擴增目的基因。上游F：5'-CGGCTAGCCTAGC GAATTCCCTCTATGGGTTC-3'，下 游 R：5'-GGGGT ACCGACTGATGTCCATACATGTCCGCC-3'；反 應 條件：94℃ 30s，58℃ 30s，68℃ 3min，擴增30個循環(huán)；68℃延伸10 min。使用DNA產物純化回收試劑盒回收PCR產物。

1.2.2 質粒的構建及鑒定

將回收的PCR產物與pEGFP-N1載體用Nhe I和Kpn I進行雙酶切。回收載體和插入片段后進行連接反應，連接產物轉化入DH5α感受態(tài)細胞中，挑選單克隆，擴大培養(yǎng)，提取質粒，酶切鑒定，將測序正確的擴大培養(yǎng)，提取DNA質粒待用。

1.2.3 HEK293細胞轉染

將預先培養(yǎng)的HEK293細胞接種于六孔板，待長至密度為70%左右，進行轉染。每個孔取4μg質粒，加入96μL水；取 100μL 2×CaCl2混勻，200μL 2× HBS逐滴加入到混合液體中，總體積為400μL。室溫靜置30min后，加入含1.5mL 10%血清的新鮮DMEM培養(yǎng)液的六孔板中，在5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，同時設置陰性對照。

1.2.4 Western Blot

收集轉染了pEGFP-N1 空載體和pEGFPN1-M-cadherin、pEGFP-N1-M-cadherin-mut1、pEGFP-N1-M-cadherin-mut2、pEGFP-N1-M-cadherin-mut3重組質粒以及未轉染的細胞，裂解細胞提取蛋白，加入5×SDS上樣緩沖液沸水煮10min。配制10%聚丙烯酰胺凝膠，每孔20μL蛋白裂解液，120V恒壓電泳2h，90V恒壓轉膜2h，用TBST配制的5%脫脂牛奶封閉膜1h，分別加入M-cadherin抗體（1∶1 000）、GFP抗體（1∶2 000），4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次10min。加入1∶10 000稀釋二抗，室溫孵育1h，TBST洗3次，每次10min。LAS4000冷光/生物發(fā)光影像分析儀顯色。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察

接種HEK293細胞至六孔板，細胞爬片生長24h后，細胞密度約為60%，將pEGFP-N1空載體和 pEGFP-N1-M-cadherin、pEGFP-N1-M-cadherinmut1、pEGFP-N1-M-cadherin-mut2、pEGFP-N1-M-cadherin-mut3重組質粒分別進行轉染，每孔轉染質?？偭繛?μg。48h后，4%多聚甲醛固定，4℃過夜。PBS洗3次，每次5min。DAPI用PBS按1∶1 000稀釋，對細胞核進行染色5 min，PBS洗3次，每次5 min。封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP5）下觀察。

2 結果

2.1 肌肉鈣黏蛋白結構域劃分以及質粒構建策略

肌肉鈣黏蛋白（M-cadherin）是一個跨膜糖蛋白，分為4個部分：信號肽、胞外段（EC）、跨膜區(qū)域（TM）以及胞內段（CP）。其中，胞外段又可分為 5個區(qū)域，即EC1、EC2、EC3、EC4、EC5（見圖1a）。將M-cadherin及其鈣離子結合位點突變體克隆到載體pEGFP-N1中，構建策略見圖1b。M-cadherin有三個鈣離子結合模序，分別把三個鈣離子結合模序天冬氨酸-精氨酸-谷氨酸（DRE）模序、天冬氨酸-X-天冬酰胺-天冬氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-脯氨酸-X-苯丙氨酸（DXNDNAPXF，X代表任意氨基酸）模序和天冬氨酸-X-天冬氨酸（DXD，X代表任意氨基酸）模序突變?yōu)榻z氨酸-丙氨酸-蘇氨酸（SAT）模序，突變序列以及突變位置見圖1c。

圖1 重組質粒構建策略

2.2 pEGFP-N1-M-cadherin及其鈣離子結合位點突變體質粒的構建

構建pEGFP-N1-M-cadherin及其鈣離子結合位點突變質粒pEGFP-N1-M-cadherin-mut1、pEGFP-N1-M-cadherin-mut2、pEGFP-N1-M-cadherin-mut3，經雙酶切，1%瓊脂糖電泳初步鑒定，證明肌肉鈣黏蛋白（M-cadherin）及其鈣離子結合位點突變序列成功裝入載體，見圖2。重組質粒經測序分析，證實肌肉鈣黏蛋白序列及3個鈣離子結合位點序列均正確，插入方向和堿基序列均正確。

圖2 酶切鑒定重組質粒結果

2.3 肌肉鈣黏蛋白及其鈣離子結合位點突變質粒的過表達

肌肉鈣黏蛋白的表達具有組織特異性，HEK293細胞本身不表達肌肉鈣黏蛋白。將構建的重組質粒轉入HEK293細胞中，使肌肉鈣黏蛋白與綠色熒光蛋白融合表達，通過綠色熒光蛋白的表達可檢測肌肉鈣黏蛋白的表達。收集細胞，抽提蛋白，Western Blot檢測肌肉鈣黏蛋白過表達情況，同時以空載體pEGFP-N1為陰性對照。結果顯示，肌肉鈣黏蛋白抗體檢測到的蛋白大小與綠色熒光蛋白抗體檢測到的大小一致，均為150kD（如圖3），表明構建的質粒在HEK293中成功融合表達了肌肉鈣黏蛋白與綠色熒光蛋白及鈣離子結合位點突變蛋白與綠色熒光蛋白。

圖3 Western Blot檢測肌肉鈣黏蛋白及鈣離子結合位點突變蛋白在HEK293中的表達

2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察肌肉鈣黏蛋白及鈣離子結合位點突變體蛋白的表達與定位

將制作好的樣本在顯微鏡下觀察，可以明顯觀察到肌肉鈣黏蛋白主要集中于細胞膜，在細胞質內也有表達，但主要集中于靠近細胞膜的一點，呈現(xiàn)極性。第一個和第三個鈣離子結合位點突變的蛋白與未突變的肌肉鈣黏細胞內定位極為相似；第二個鈣離子結合位點突變的蛋白也定位于細胞膜上，但胞質內的定位呈散在分布，失去極性，而pEGFP-N1是全細胞表達，見圖4。

圖4 肌肉鈣黏蛋白（M-cadherin）及其鈣離子結合位點突變蛋白細胞內定位

3 結論

本文成功構建了肌肉鈣黏蛋白及其鈣離子結合位點突變重組質粒，利用其與綠色熒光（GFP）融合表達，在本身不表達該蛋白的HEK293細胞中過表達該蛋白及其突變體蛋白，直觀地觀察到肌肉鈣黏蛋白在細胞內的分布和定位情況。發(fā)現(xiàn)它們均能定位在細胞膜上，但除了在細胞膜上定位之外，有一部分蛋白在細胞質內呈簇聚集，這可能與該蛋白在不同發(fā)育時期，不同細胞內定位相關。并發(fā)現(xiàn)肌肉鈣黏蛋白（M-cadherin）的第二個鈣離子結合位點的突變對其定位產生了影響，主要表現(xiàn)在蛋白不呈簇聚集。第一個和第三個鈣離子結合位點的突變對肌肉鈣黏蛋白的定位均無影響。這證明了第二個鈣離子結合位點可能是維持肌肉鈣黏蛋白剛性的一個極其重要的位點。，為深入研究肌肉鈣黏蛋白的結構和功能奠定了基礎和提供了可能。

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Construction of M-cadherin and its Calcium Binding Sites Mutations and Analysis of Their Intracellular Localization

Liu Yan1,Feng Li-xing2*
(1.School of Life Sciences,Fudan University,Shanghai 200433;2.School of Chemistry and Molecular Engineering,ECNU,Shanghai 200241)

In order to study effect of the three calcium binding sites of M-cadherin on intracellular localization,M-cadherin and its mutations was used as template,the M-cadherin and its mutations coding sequence were amplified by PCR and respectively inserted into the vector pEGFP-N1,they fusion expressed with EGFP.The expression in HEK293 was detected by western blot and localization of EGFP fusion expression was observed by laser scanning confocal microscopy.The results showed that three different calcium binding sites were mutated separately,the second one can cause M-cadherin intracellular localization changed,then changed the intracellular pattern of the protein.This study provides the foundation for further study the function and structure of M-cadherin.

M-cadherin;Calcium binding sites;Intracellular localization

Q78 文獻標志碼：A

2096-0387（2017）06-0024-05

國家自然科學基金（81373964）；上海市科委科技創(chuàng)新行動計劃（15140904800）。

劉燕（1987—），女，四川廣元人，碩士在讀，研究方向：成體肌肉干細胞的命運決定。

馮利興（1983—），男，河北邯鄲人，碩士，助理研究員，研究方向：藥理學和蛋白質組學。