楊欣悅

摘 要：實(shí)驗(yàn)?zāi)康模嚎疾椴煌志鷦?duì)愈傷組織的形成有何影響，其次尋找接種方式、取材部位等因素對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織形成的最佳條件，在組織培養(yǎng)過(guò)程中，掌握外植體消毒的注意事項(xiàng)，合理選取和控制培養(yǎng)條件。實(shí)驗(yàn)材料：月季花；市售多菌靈和大蒜素。實(shí)踐方法：培養(yǎng)基配制，消毒，接種，條件設(shè)置。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：多菌靈在開(kāi)放式組培中的抑菌效果好，且兩者的成活率都達(dá)到或超過(guò)了50%。

關(guān)鍵詞：開(kāi)放式組織培養(yǎng)；抑菌劑；效果

中圖分類(lèi)號(hào)：G63 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1673-9132（2017）03-0140-02

DOI：10.16657/j.cnki.issn1673-9132.2017.03.090

科學(xué)研究表明，植物細(xì)胞處于離體狀態(tài)時(shí)，在一定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，表現(xiàn)出全能性，能發(fā)育成完整植株。高中生物中通過(guò)植物的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)來(lái)學(xué)習(xí)植物的無(wú)性繁殖，組織培養(yǎng)是把植物的器官、組織以至單個(gè)細(xì)胞，使其在人工條件下，繼續(xù)生長(zhǎng)，甚至分化發(fā)育成一完整植株的過(guò)程，為保證植株成活率，此操作通常在無(wú)菌操作環(huán)境進(jìn)行。

在實(shí)驗(yàn)的實(shí)施過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)植株體幾乎都受到污染發(fā)霉，成活率不到10%，究其原因主要有兩個(gè)方面：一是班級(jí)規(guī)模的操作流程不可避免地帶來(lái)了很多不確定的污染因素，難以達(dá)到植物組織培養(yǎng)對(duì)無(wú)菌要求極為嚴(yán)格的條件；二是在培養(yǎng)的過(guò)程中，需要保持恒溫的生長(zhǎng)環(huán)境以及嚴(yán)格的光照時(shí)間，對(duì)前者尤其有較高的要求。

開(kāi)放式組織培養(yǎng)是通過(guò)在培養(yǎng)基中加入抑菌劑來(lái)代替高壓滅菌，避免了絕對(duì)的無(wú)菌環(huán)境，使植物在相對(duì)開(kāi)放的條件下可以良好生長(zhǎng)。這種方法能夠降低植物培養(yǎng)繁殖的成本，目前在多種花卉和經(jīng)濟(jì)類(lèi)作物的工廠化育苗生產(chǎn)實(shí)踐中已得到推廣應(yīng)用。隨著開(kāi)放式組織培養(yǎng)技術(shù)研究的成熟，在高中生物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用這一方法，能顯著提高實(shí)驗(yàn)的成功率，改善實(shí)驗(yàn)條件，尤其是邊遠(yuǎn)地區(qū)學(xué)校的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

選擇合適的抑菌劑、外植體是開(kāi)放式組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵要素。參考相關(guān)文獻(xiàn)資料及中醫(yī)理論，我們選取了市售多菌靈和大蒜素作為抑菌劑。大蒜素也可采用自制的方法獲得，文獻(xiàn)[1]提供了相關(guān)制作方法及濃度參數(shù)。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮头椒?/p>

實(shí)驗(yàn)要求能閱讀植物組織培養(yǎng)的相關(guān)文獻(xiàn)資料，考查不同抑菌劑對(duì)愈傷組織的形成有何影響，其次尋找接種方式、取材部位等因素對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織形成的最佳條件，在組織培養(yǎng)過(guò)程中，掌握外植體消毒的注意事項(xiàng)，合理選取和控制培養(yǎng)條件，對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)的現(xiàn)象及時(shí)觀察記錄和分析，加強(qiáng)理論與實(shí)踐的聯(lián)系，深化對(duì)理論知識(shí)的理解。根據(jù)相關(guān)理論和文獻(xiàn)資料，我們?cè)O(shè)計(jì)了以誘導(dǎo)愈傷組織為主的開(kāi)放式組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方案。

（一）外植體材料：月季花

本實(shí)驗(yàn)材料取自盆栽的月季，植物葉片和莖段均是誘導(dǎo)愈傷組織和進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的理想材料，葉片誘導(dǎo)率稍高于莖段，能達(dá)到90%以上，莖段培養(yǎng)則最簡(jiǎn)便，成苗速度最快，且以莖段中芽為最好，接種后，中段芽第5 天左右就能萌發(fā)。為避免誤差和便于得出結(jié)果，在選擇外植體時(shí)最終確定選用帶腋芽部分的莖段做外植體材料。

（二）主要試劑

MS 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1mg /mL6-BA、0. 5mg /mL NAA、1mol /L NaOH溶液、市售大蒜素、市售多菌靈粉劑。

（三）實(shí)驗(yàn)方法

培養(yǎng)基配制：取2只2000mL規(guī)格的錐形瓶，分別標(biāo)記大蒜素、多菌靈。分別稱(chēng)量MS 干粉培養(yǎng)基50g 放于錐形瓶中，加800mL 蒸餾水在電熱爐上慢慢攪拌煮沸至溶液完全透明，然后加入蒸餾水將溶液定溶至1000mL。待溶液冷卻至40℃ ～ 50℃ 時(shí)，分別在以上2 瓶中分別加入0.15g/mL大蒜素溶液10mL，稀釋600倍的多菌靈溶液，然后加入6-BA 1mg /mL 2mL，NAA 0. 5mg /mL 0. 5mL，混勻后，調(diào)節(jié)pH 到6. 8，然后將培養(yǎng)基倒入組培瓶中擰緊，每瓶50mL，分別標(biāo)記所加物質(zhì)作為記號(hào)，水平放置至凝固。

消毒：剪取當(dāng)年抽生側(cè)芽飽滿(mǎn)的幼嫩莖段，剪去頂部和基部并去葉，剪成2cm長(zhǎng)帶有側(cè)芽的莖段，自來(lái)水沖洗10-20分鐘；75%乙醇浸泡30秒，再用0.1%Hgcl2溶液滅菌5-10分鐘，無(wú)菌水沖洗4-5次，獲得無(wú)菌苗備用。

接種：從瓶中取出月季無(wú)菌苗剪取腋芽段插入培養(yǎng)基，以培養(yǎng)基平面不沒(méi)過(guò)腋芽處為準(zhǔn)，擰上蓋子，放入光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在外植體的接種時(shí)采用了垂直接種，斜向上45度接種，采用這樣的接種方式，腋芽再生芽數(shù)多，且生長(zhǎng)健壯，這與植物的生長(zhǎng)習(xí)性有一定關(guān)系。

培養(yǎng)條件：設(shè)置為一般植物組織培養(yǎng)的條件，溫度控制在24℃左右，光照時(shí)間為12h/天，光照強(qiáng)度為1000～2000Lx，實(shí)驗(yàn)接種后先暗室培養(yǎng)一周，再在光照下培養(yǎng)。定期觀察記錄，隨時(shí)取走出現(xiàn)嚴(yán)重污染的組培瓶。

二、結(jié)果與分析

經(jīng)過(guò)20天觀察， 兩種培養(yǎng)方式均獲誘導(dǎo)獲得了愈傷組織，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下表。

通過(guò)對(duì)這兩種抗菌物質(zhì)的抗菌效果的比較，得出多菌靈在開(kāi)放式組培中的抑菌效果較好，且兩者的成活率都達(dá)到或超過(guò)了50%。這種開(kāi)放式的方法降低了技術(shù)難度，可操作性更強(qiáng)，設(shè)備投入成本較低，對(duì)于建設(shè)植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)有較大的可行性。出芽和生根的再分化實(shí)驗(yàn)過(guò)程，可參考相關(guān)資料，探究由愈傷組織誘導(dǎo)出芽及生根所需培養(yǎng)基和生長(zhǎng)素的最佳濃度配比，調(diào)節(jié)植物激素的濃度繼續(xù)實(shí)施。

在開(kāi)放式組培實(shí)驗(yàn)中，不同的外植體選擇何種抑菌劑及其濃度是非常關(guān)鍵的因素，需參考相關(guān)文獻(xiàn)及各種生產(chǎn)實(shí)踐進(jìn)一步摸索。多菌靈是一種高效廣譜內(nèi)吸性殺菌劑，其通過(guò)抑制病原菌紡錘體的形成來(lái)影響細(xì)胞分裂，對(duì)多數(shù)半知菌和子囊菌具有抑制作用。大蒜提取物中主要成分是大蒜素，具有較強(qiáng)的抗菌消炎作用，對(duì)多種球菌、桿菌、真菌、病毒等均有抑制或殺滅作用，其在低濃度時(shí)能夠抑制真菌生長(zhǎng)，在高濃度時(shí)可完全殺死真菌，且大蒜素是生物農(nóng)藥，對(duì)植物生長(zhǎng)影響較小，這兩種抑菌劑的應(yīng)用范圍相對(duì)比較廣泛。

以開(kāi)展開(kāi)放式組培條件探究實(shí)驗(yàn)為契機(jī)，培養(yǎng)學(xué)生探究實(shí)驗(yàn)，可以從無(wú)菌和抑菌等多種角度對(duì)植物組織培養(yǎng)進(jìn)行探究，在高中學(xué)生中開(kāi)展這方面的課題研究，不僅能鍛煉學(xué)生多方面思考創(chuàng)新的能力，并且緊密結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，是實(shí)驗(yàn)課程改革思路的又一探索模式。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王曉煌，黃勝琴，李玲. 4種抑菌劑在煙草開(kāi)放式組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015， 42（5）：58-62.

[2] 王艷紅，龔束芳，車(chē)代弟.豐花月季愈傷組織的誘導(dǎo)及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38（2）：161-165.