耿麗麗 劉義慶 王澤筠 沈亞娟 亓琳 趙萬輝 張炳昌

·儀器評價·

應(yīng)用Sysmex XT-4000i體液模式進(jìn)行腦脊液細(xì)胞計數(shù)的性能評價*

耿麗麗 劉義慶 王澤筠 沈亞娟 亓琳 趙萬輝 張炳昌

目的 評估血細(xì)胞分析儀Sysmex XT-4000i體液（body fluid，BF）模式進(jìn)行腦脊液細(xì)胞計數(shù)的性能。 方法收集2015年6～12月山東省立醫(yī)院住院患者腦脊液標(biāo)本142份，用XT-4000i進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和分類，并與人工顯微鏡（人工灌板和細(xì)胞離心染色）計數(shù)進(jìn)行方法學(xué)比較。結(jié)果 XT-4000i和人工顯微鏡計數(shù)之間白細(xì)胞計數(shù)（y=1.17x+3.21，n=118，r2=0.98）、單個核細(xì)胞計數(shù)（y=0.81x+13.61，n=101，r2=0.88）、多個核細(xì)胞計數(shù)（y=0.82x+5.15，n=101，r2=0.88）、紅細(xì)胞計數(shù)（y=1.01x+146.40，n=62，r2=0.99）均呈高度相關(guān)。XT-4000i檢測的研究參數(shù)高熒光強(qiáng)度細(xì)胞（HF-BF）水平與顯微鏡下查到大細(xì)胞（吞噬細(xì)胞或惡性細(xì)胞等）具有相關(guān)性（y=0.54x+3.31，n=101，r2=0.27，P＜0.001），真陽性率是13.9%，真陰性率是96.9%。XT-4000i檢測的另一研究參數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞（EO-BF）水平與人工顯微鏡方法的相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），真陽性率是9.8%，真陰性率是80.0%。XT-4000i的白細(xì)胞、單個核細(xì)胞、多個核細(xì)胞和紅細(xì)胞計數(shù)均表現(xiàn)出良好的精密度（CV≤30%）。白細(xì)胞計數(shù)和紅細(xì)胞計數(shù)具有良好的攜帶污染率（carry-over≤0.3%）和線性分析（r2=0.99）。結(jié)論 XT-4000i體液模式的準(zhǔn)確度和精密度良好，可用于日常腦脊液細(xì)胞計數(shù)。高熒光強(qiáng)度細(xì)胞水平對腦脊液中的大細(xì)胞具有一定的提示預(yù)測作用。

腦脊髓液 血細(xì)胞計數(shù) 血細(xì)胞分析儀 Sysmex XT-4000i

正常成年人的腦脊液約100～150 ml，具有一定的化學(xué)成分和壓力，對維持顱壓的相對穩(wěn)定有重要作用。當(dāng)患腦外傷、腦膜炎、腦出血和中樞神經(jīng)梅毒等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病時，常常要作腰椎穿刺吸取腦脊液檢查，以協(xié)助診斷[1，2]。

腦脊液細(xì)胞計數(shù)和分類是臨床基礎(chǔ)檢驗中的一項常規(guī)試驗，對于診斷和鑒別診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要作用。人工灌板顯微鏡計數(shù)是檢測腦脊液細(xì)胞數(shù)量的傳統(tǒng)方法[3]。但該法存在操作繁瑣費時、重復(fù)性差、操作者個體間差異等缺點，難以進(jìn)行質(zhì)量控制。因此，需要克服耗時長、精密度和準(zhǔn)確度差的自動化儀器替代人工計數(shù)方法。血細(xì)胞分析儀Sysmex XT-4000i（日本）具有專門的體液（body fluid，BF）分析模式，采用鞘流原理、熒光染色和半導(dǎo)體激光流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)[4，5]，可進(jìn)行腦脊液、胸腹水、心包積液、關(guān)節(jié)腔積液等體液標(biāo)本的常規(guī)檢測，報告白細(xì)胞（WBC-BF）、單個核細(xì)胞（MN）和多個核細(xì)胞（PMN）、紅細(xì)胞 （RBC-BF）參數(shù)。此外，還檢測2個研究參數(shù)：高熒光強(qiáng)度細(xì)胞（HF-BF）和嗜酸性粒細(xì)胞（EO-BF）。國內(nèi)已有研究報道自動化儀器體液分析模式的應(yīng)用[4-6]，但鮮有研究利用腦脊液大樣本且采用細(xì)胞甩片離心染色方法，作為白細(xì)胞分類的參考方法對自動化體液分析各項參數(shù)進(jìn)行全面的性能評價。本研究同時采用儀器檢測、灌板計數(shù)和細(xì)胞離心染色方法，評價XT-4000i體液分析模式檢測腦脊液中WBC-BF、MN、PMN、RBC-BF的精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍、攜帶污染率等性能指標(biāo)，分析2個研究參數(shù)HF-BF和EO-BF對于腦脊液中大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞是否具有提示預(yù)測作用，探討 XT-4000i體液模式能否替代人工顯微鏡計數(shù)方法用于日常腦脊液標(biāo)本檢測。

材料與方法

1 材料 收集山東省立醫(yī)院2015年6～12月住院患者腦脊液標(biāo)本142 份，用普通試管收集，收到標(biāo)本2 h內(nèi)同時采用人工顯微鏡方法和Sysmex XT-4000i 體液分析模式進(jìn)行檢測，人工顯微鏡檢測由經(jīng)驗豐富的技師完成。標(biāo)本采集和細(xì)胞成分分析遵循CLSI H56-A指南。

2 方法

2.1 人工顯微鏡方法

2.1.1 人工灌板顯微鏡計數(shù)：白細(xì)胞（WBC）和紅細(xì)胞（RBC）計數(shù)采用改良牛鮑氏計數(shù)板。灌板前輕輕混勻標(biāo)本，用微量移液器吸取10μl腦脊液灌板，在顯微鏡高倍鏡（×400）下計數(shù)。對于WBC＜50×106/L的標(biāo)本，要求計數(shù)兩側(cè)10個大方格；對于WBC≥50×106/L的標(biāo)本，要求計數(shù)5個大方格，結(jié)果乘以2。由2位經(jīng)驗豐富的技師計數(shù)，結(jié)果取均值。

2.1.2 細(xì)胞離心染色計數(shù)：將腦脊液用專門的細(xì)胞涂片離心機(jī)（Dettolx DB-CC2，美國）800 r /min離心6 min，然后將得到的細(xì)胞涂片作Wright-Giemsa染色，在顯微鏡油鏡（×1 000）下計數(shù)分類100個白細(xì)胞，將淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及漿細(xì)胞歸為單個核細(xì)胞，將中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞歸為多個核細(xì)胞。室管膜細(xì)胞和蛛網(wǎng)膜細(xì)胞不計入白細(xì)胞。若存在大細(xì)胞，如吞噬細(xì)胞、白血病細(xì)胞和癌細(xì)胞，則另外記錄。惡性細(xì)胞的報告由2名副主任技師以上進(jìn)行確認(rèn)。

2.2 Sysmex XT-4000i 體液分析模式檢測

2.2.1 計數(shù)和分類：計數(shù)腦脊液中WBC-BF、MN、PMN、RBC-BF及2個研究參數(shù)HF-BF和EOBF。HF-BF理論上指間皮細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、惡性細(xì)胞等，不計入白細(xì)胞（WBC-BF），但計入總的有核細(xì)胞（TC-BF ）。HF-BF% 指高熒光強(qiáng)度細(xì)胞數(shù)量/100個白細(xì)胞，EO-BF% 指嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量/100個白細(xì)胞。

2.2.2 批內(nèi)精密度：分別對WBC-BF、MN#、PMN#、RBC-BF做批內(nèi)精密度的評估。選取低、中、高值腦脊液標(biāo)本各連續(xù)檢測11次，去掉第1次，取10次的均值，求標(biāo)準(zhǔn)差（s）和變異系數(shù)（CV）。根據(jù)儀器說明，WBC-BF和RBC-BF的CV應(yīng) ≤ 30%.

2.2.3 線性分析：WBC-BF高值和低值線性范圍的驗證，分別選取WBC-BF接近預(yù)期上限和低值的腦脊液標(biāo)本，用Sysmex XT-4000i配套鞘液依次稀釋100%、80%、60%、40%、20%、5%…，每個梯度連續(xù)檢測3次，求均值。對實測值和理論值做相關(guān)性分析，求直線回歸方程y=a+bx。RBCBF線性范圍的驗證方案同上。當(dāng)0.95≤b≤1.05、r≥0.975時，符合要求。

2.2.4 攜帶污染率：分別對WBC-BF、RBC-BF進(jìn)行攜帶污染率的評估。先取一份高值腦脊液標(biāo)本連續(xù)檢測3次（H1、H2、H3），然后將配套鞘液作為低值標(biāo)本連續(xù)檢測3次（L1、L2、L3）。根據(jù)以下公式計算：攜帶污染率=×100%，根據(jù)儀器說明，WBC-BF和RBC-BF攜帶污染率應(yīng)≤0.3%。

2.2.5 準(zhǔn)確度：將儀器自動計數(shù)和人工顯微鏡計數(shù)腦脊液WBC-BF、MN%、PMN%、RBC-BF的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)回歸分析，求直線回歸方程y=a+bx，以確定二者之間的符合程度。對高熒光強(qiáng)度細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞這2個研究參數(shù)，除進(jìn)行相關(guān)回歸分析外，還進(jìn)行敏感度和特異度分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用Microsoft Excel 2007 和GraphPad Prism 5 Software（美國）分析數(shù)據(jù)。線性范圍的驗證和方法間的比較采用Passing-Bablok回歸分析，求直線回歸方程y=a+bx。

結(jié) 果

1 精密度 WBC-BF、MN #、PMN#、RBC-BF的低值、中值、高值腦脊液標(biāo)本的批內(nèi)精密度CV依次降低，均≤30%，符合儀器說明書要求，見表1。

2 線性分析 WBC高值線性、低值線性及RBC線性驗證見圖1，其決定系數(shù)r2均為0.99。

3 攜帶污染率 WBC-BF、RBC-BF的低值、高值腦脊液標(biāo)本攜帶污染率均≤0.3%，符合儀器說明書要求，見表2。

4 準(zhǔn)確度 共有142份腦脊液標(biāo)本用于比較儀器自動計數(shù)和人工顯微鏡計數(shù)。根據(jù)文獻(xiàn)報道，自動化體液分析白細(xì)胞的最低檢出限約在5×106/L[7，8]，故統(tǒng)計2種方法間WBC-BF的相關(guān)性時，儀器計數(shù)WBC-BF ＜ 5×106/L的標(biāo)本被舍棄，有118份標(biāo)本納入統(tǒng)計；統(tǒng)計2種方法間MN （%）、PMN（%）、HF-BF%或EO-BF%的相關(guān)性時，細(xì)胞離心染色后鏡檢計數(shù)＜100個WBC的標(biāo)本被舍棄，有101份標(biāo)本納入統(tǒng)計；統(tǒng)計2種方法間RBC-BF的相關(guān)性時，因為儀器只能報告RBC-BF≥0.1×109/L，所以RBC-BF＜0.1×109/L的標(biāo)本被舍棄，有62份標(biāo)本納入統(tǒng)計。

2種方法間WBC-BF、MN （%）、PMN（%）、RBC-BF的決定系數(shù)r2分別為：0.98、0.88、0.88、0.99，均呈高度相關(guān)，P＜0.001。HF-BF%的決定系數(shù)r2為0.27，P＜0.0001，因此2種方法間高熒光強(qiáng)度細(xì)胞的計數(shù)相關(guān)。2種方法間嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)的相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。 見表3和圖2。

表1 批內(nèi)精密度

圖1 XT-4000i體液模式的線性分析

表2 攜帶污染率

在納入細(xì)胞分類統(tǒng)計的101份腦脊液標(biāo)本中，儀器計數(shù)HF-BF%＞0，同時細(xì)胞離心染色后鏡檢查到吞噬細(xì)胞或惡性細(xì)胞，被判定為真陽性，真陽性標(biāo)本共5例，DIFF散點圖及相應(yīng)細(xì)胞形態(tài)見圖3。 同樣，儀器計數(shù)EO-BF%＞0，同時細(xì)胞離心染色后鏡檢查到嗜酸性粒細(xì)胞，被判定為真陽性。HF-BF%和EO-BF%的真陽性率分別是：13.9%、9.8%；真陰性率分別是96.9%、80.0%。見表4。

表3 方法間比較（Passing-Bablok）.

圖2 比較XT-4000i和人工顯微鏡計數(shù)兩種方法

圖3 腦脊液中高熒光強(qiáng)度細(xì)胞的DIFF散點圖和細(xì)胞形態(tài)圖（瑞氏染色，×1 000）

表4 儀器計數(shù)HF-BF%和EO-BF%的靈敏度和特異度

討 論

近年來推出的一些自動化血細(xì)胞分析儀Sysmex XT-4000i、XE-5000、XN系列等，具有專門的體液通道分析模式可以進(jìn)行體液細(xì)胞計數(shù)和分類。由于這類儀器采用鞘流原理、半導(dǎo)體激光、熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)原理，細(xì)胞計數(shù)的準(zhǔn)確度和精密度大大提高[4-13]。

本研究對XT-4000i進(jìn)行了全面的性能評估，WBC-BF、MN#、PMN#、RBC-BF 4個參數(shù)均表現(xiàn)出良好的批內(nèi)精密度、線性范圍、攜帶污染率和準(zhǔn)確度。為保證儀器檢測和人工計數(shù)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，我們采取了一系列質(zhì)量控制措施。由于腦脊液細(xì)胞易破壞，標(biāo)本不宜放置過長時間，我們要求標(biāo)本在送檢后2 h內(nèi)完成檢測，并且破碎細(xì)胞超過5%的標(biāo)本不納入統(tǒng)計分析。在進(jìn)行精密度分析時，我們輕輕混勻標(biāo)本后，連做2次儀器檢測，然后再輕輕混勻，連續(xù)進(jìn)行2次儀器檢測，同法進(jìn)行，以減少因多次混勻造成的細(xì)胞破壞。我們發(fā)現(xiàn)，這種方法檢測的精密度CV值比每次檢測前都混勻腦脊液的精密度CV值顯著減低（未提供數(shù)據(jù)）。我們還對人工灌板計數(shù)的操作程序作了細(xì)致要求（見方法部分），以減少人員間差異。白細(xì)胞分類的傳統(tǒng)方法是用冰醋酸酸化腦脊液后，計數(shù)單個核細(xì)胞（MN）和多個核細(xì)胞（PMN）的百分比[3]。但這種方法存在著一些局限性，不宜作為金標(biāo)準(zhǔn)。首先冰醋酸的殘余量會影響腦脊液細(xì)胞計數(shù)；其次中性粒細(xì)胞的桿狀核在鏡下不易辨別和劃分為單個核細(xì)胞還是多個核細(xì)胞；第三白細(xì)胞數(shù)量較低的標(biāo)本無法準(zhǔn)確計數(shù)單個核細(xì)胞和多個核細(xì)胞的百分比。因此，我們采用專門的細(xì)胞涂片離心機(jī)（Dettolx DB-CC2）甩片，使細(xì)胞濃集，由于該離心機(jī)轉(zhuǎn)速低，對細(xì)胞破壞小，能保證細(xì)胞形態(tài)的完整性。Wright-Giemsa染色后，油鏡下分類。這種方法可以避免冰醋酸酸化法分類的弊端。國外同類研究報道多采用細(xì)胞離心染色方法作為腦脊液及其他體液標(biāo)本中白細(xì)胞分類的參考方法[9-13]。

本研究還對2個研究參數(shù)高熒光強(qiáng)度細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的準(zhǔn)確度進(jìn)行了評估。結(jié)果表明，腦脊液中HF-BF水平與人工顯微鏡下能否查到大細(xì)胞（吞噬細(xì)胞、白血病細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞）是相關(guān)的（P＜0.001）。但是，與查到吞噬細(xì)胞的腦脊液標(biāo)本相比，查到白血病細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的腦脊液并非都表現(xiàn)出更高的HF-BF水平，這一點與最近的自動化血細(xì)胞分析儀檢測腦脊液細(xì)胞研究一致[12，13]，這是因為惡性細(xì)胞有可能被儀器歸到單個核細(xì)胞中。由于我們收集的腦脊液標(biāo)本中能查到大細(xì)胞的例數(shù)較少，所以未能進(jìn)行良惡性腦脊液標(biāo)本HF-BF水平的比較。腦脊液HF-BF的假陽性率相當(dāng)高 （86.1%），假陰性率相當(dāng)?shù)停?.1%），表明HF-BF對于大細(xì)胞的陰性預(yù)測值顯著高于其陽性預(yù)測值。我們的結(jié)果還表明，腦脊液中EO-BF水平與人工顯微鏡下能否查到嗜酸性粒細(xì)胞不相關(guān)（P＞0.05），對腦脊液中是否具有嗜酸性粒細(xì)胞不具有提示價值。

綜上所述，自動血細(xì)胞分析儀XT-4000i體液分析模式是一種快速、準(zhǔn)確、靈敏地計數(shù)和分類腦脊液細(xì)胞的方法。但是，對于白細(xì)胞計數(shù)較低的標(biāo)本，建議仍采用灌板計數(shù)法，因為儀器具有檢測下限。另外，高熒光強(qiáng)度細(xì)胞對腦脊液中大細(xì)胞檢測具有一定的預(yù)測價值，當(dāng)HF-BF增高時，建議進(jìn)行細(xì)胞離心染色，以避免惡性細(xì)胞漏診。

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Performance Estimation of Sysmex XT-4000i in Body Fluid Mode for Counting Blood Cells in Cerebrospinal Fluid

GENG Li-li，LIU Yi-qing，WANG Ze-jun，et al. Department of Clinical Laboratory，Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University，Shandong Jinan250021

Objective To evaluate the performance of the body fluid （BF）mode on Sysmex XT-4000i for counting blood cells in cerebrospinal fluid （CSF）. Methods One hundred and forty -two CSF specimens were collected from the inpatients in Shandong Provincial Hospital from June to December，2015. Blood cells of all the specimens were counted for method comparison between Sysmex XT-4000i and manual microscope （counting chamber and stained cytospin slides）. Results Excellent correlations were found for counting white blood cells （y=1.17x+3.21，n=118，r2=0.98），mononuclear cells （y=0.81x+13.61，n=101，r2=0.88），polynuclear cells （y=0.82x+5.15，n=101，r2=0.88）and red blood cells （y = 1.01x+146.40，n= 62，r2= 0.99）. Good agreement was found between levels of high fluorescent（HF）cells detected by XT-4000i and large cells （macrophages or malignant cells）found under the microscope （y =0.54x+3.31，n= 101，r2= 0.27，P＜0.000 1）. The true positive rate of HF cells was 13.9% and their true negative rate was 96.9%. However，no correlation was found between eosnophils detected by XT-4000i and under the microscope （P＞0.05）. The true positive rate of eosnophils was 9.8% and their true negative rate was 80.0%. Good precision （CV≤30%）was got in white blood cells，mononuclear cells，polynuclear cells and red blood cells counted by XT-4000i. Both carryover （≤0.3%）and linearity （r2=0.99）were also excellent for white blood cells and red blood cells. Conclusion The BF mode on XT-4000i may be routinely used for CSF cells count because of its excellent accuracy and precision. HF cells may have some predictive value in large cells in CSF.

Cerebrospinal fluid Blood cell count Hematology analyzer Sysmex XT-4000i

R446.1

A

1671-2587（2017）06-0630-06

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.06.030

*本課題受山東省自然科學(xué)基金（No.ZR2016HM52）；山東省科學(xué)技術(shù)發(fā)展計劃資助項目（No.2014GGH218041）；山東省臨床重點?？祈椖浚∟o.魯衛(wèi)醫(yī)字[2013]26號）資助

250021 濟(jì)南，山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗部

耿麗麗（1989–），女，山東濟(jì)南人，檢驗師，學(xué)士，主要從事臨床檢驗工作，（ E-mail）408052812@qq.com。

劉義慶，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事臨床檢驗工作，（ E-mail）yqliu1979@163.com。

2017-08-02）

（本文編輯：王敏）