汪波 范利平 史德寶 程筱雯 李潔 徐元宏
安徽地區(qū)漢族孕婦人群MTHFR基因多態(tài)性研究*
汪波 范利平 史德寶 程筱雯 李潔 徐元宏
目的 探討安徽地區(qū)孕婦編碼葉酸代謝通路中關(guān)鍵酶的基因亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T位點(diǎn)的基因型及等位基因的頻率分布,以指導(dǎo)孕婦孕期合理補(bǔ)充葉酸。方法 采用PCR-芯片雜交法,對2016 ~2017年采集的484例安徽地區(qū)孕婦外周血樣本進(jìn)行基因型測定,并與其他地區(qū)人群的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。結(jié)果 安徽地區(qū)漢族孕婦 MTHFR C677T 的3種基因型 CC、TC 和 TT 頻率分別為 25.2 % 、49.2 % 和 25.6 % ,與山東、四川、云南、廣東以及海南地區(qū)女性人群等位基因頻率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 MTHFR 基因 C677T 多態(tài)性分布具有地區(qū)差異,安徽地區(qū)50%以上的育齡女性攜帶高風(fēng)險基因,基于C677T多態(tài)性檢測的孕期葉酸個體化用藥指導(dǎo)將是進(jìn)一步降低出生缺陷的重要方法。
安徽地區(qū) 漢族女性人群 MTHFR 基因多態(tài)性
亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是一種催化5,10-亞甲基四氫葉酸向5-甲基四氫葉酸不可逆轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵酶,與體內(nèi)葉酸/同型半胱氨酸(HCY)的代謝、蛋氨酸的合成以及DNA和RNA合成有關(guān)[1]。因此,MTHFR基因的缺陷導(dǎo)致機(jī)體多個基礎(chǔ)生化過程的紊亂,并進(jìn)而引起神經(jīng)管缺陷、癌癥、心腦血管疾病等多種病癥[2-4]。
迄今為止,MTHFR基因多態(tài)性已被發(fā)現(xiàn),其中,C677T 和 A1298C 最常見,導(dǎo)致其酶活性下降,血漿葉酸濃度下降以及同型半胱氨酸在體內(nèi)蓄積[5]。多項(xiàng)研究證實(shí)C677T基因多態(tài)性在孕早期干擾神經(jīng)管閉合,導(dǎo)致神經(jīng)管畸形、唇腭裂等多種疾病甚至流產(chǎn)[6-8]。本研究開展安徽地區(qū)484名孕婦外周血的MTHFR基因多態(tài)性研究,并與其他論文中已發(fā)表的9個省份中的女性人群比較[9],進(jìn)而了解C677T基因多態(tài)性的分布情況及分子遺傳學(xué)特征,以期為安徽地區(qū)孕婦個體化補(bǔ)充葉酸提供證據(jù)。
1 研究對象 收集2016年9月~2017年8月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院正常產(chǎn)檢的安徽漢族孕婦外周血樣本,共484例(孕婦人群地理分布見圖1),年齡18~38歲(27.7±3.46)。
2 試劑與儀器
2.1 試劑:全血基因組提取試劑盒(上海百傲科技有限公司,批號20160919);MTHFR(C677T)基因檢測試劑盒(PCR-芯片雜交法,上海百傲科技有限公司,批號20160927);免疫顯色試劑(上海百傲科技有限公司,批號20160926)。
2.2 儀器:低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);高速離心機(jī)(德國eppendorf公司);羅氏熒光定量擴(kuò)增儀COBAS Z480(德國羅氏公司);BR-526-24全自動雜交儀(上海百傲科技有限公司);BaiO?BE-2.0生物芯片識讀儀(上海百傲科技有限公司)。
3 實(shí)驗(yàn)方法
3.1 樣本DNA制備:采用細(xì)胞裂解法從外周血細(xì)胞中將基因組DNA提取純化出來,具體操作按照產(chǎn)品說明書嚴(yán)格執(zhí)行,DNA濃度應(yīng)在10~60 ng/μl,A260/A280比值在1.5~2.0,樣本DNA在2℃~8℃可以貯存1周或-20℃貯存1個月,反復(fù)凍存不超過3次。
3.2 PCR擴(kuò)增:將2 μl樣本DNA與1 μl反應(yīng)液A以及22 μl MTR擴(kuò)增液加入PCR擴(kuò)增管混勻;將擴(kuò)增管放入PCR儀器中,按照下列條件擴(kuò)增:50℃ 5 min;94℃ 5 min;94℃ 25 s,56℃ 25 s,72℃25 s,35個循環(huán) ;72℃ 5 min。取出擴(kuò)增產(chǎn)物,2℃~8℃保存,具體操作按照產(chǎn)品說明書嚴(yán)格執(zhí)行。
3.3 雜交顯色:將顯色液、雜交反應(yīng)液、抗體液按照要求加入相應(yīng)管內(nèi),插入試劑架相應(yīng)位置中,運(yùn)行雜交程序:42℃ 5 min(預(yù)雜交液);42℃ 30 min(雜交反應(yīng)液);42℃ 6 min X 2(洗液1);28℃ 5 min X 2(洗液2);28℃ 20 min(抗體液);28℃ 5 min X 2(洗液2);28℃3 min(洗液3);42℃ 30 min(顯色液);28℃2 min X 2(預(yù)雜交液)。反應(yīng)結(jié)束后,取出芯片放入生物芯片識讀儀中,用Baio基因芯片圖像分析軟件(Baio Array Doctor)V2.0進(jìn)行圖像掃描與數(shù)據(jù)分析,輸出檢測結(jié)果。具體操作按照產(chǎn)品說明書嚴(yán)格執(zhí)行。
4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包,根據(jù)Hardy-Weiberg平衡定律計(jì)算各基因型個體數(shù)的期望值,組間基因型頻率及等位基因頻率的差異比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
圖1 安徽地區(qū)484例孕婦人群地理分布圖
1 安徽地區(qū)漢族女性人群MTHFR基因C677T基因型多態(tài)性 本研究共收集安徽地區(qū)孕婦外周血樣本484例(見圖1),年齡18~38歲(27.7±3.46)。將樣本MTHFR C677T位點(diǎn)檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行Hardy-Weiberg遺傳平衡檢驗(yàn),均符合Hardy-Weiberg定律,證明樣本具有該區(qū)域群體代表性。檢測結(jié)果顯示677CC、677CT和677TT基因型分別為122(25.2%)、238(49.2%)和124(25.6%)例,進(jìn)一步計(jì)算得出677C和677T等位基因在該人群中的分布頻率分別為49.8%和50.2%。數(shù)據(jù)見表1。
2 安徽地區(qū)與其他地區(qū)漢族女性人群基因多態(tài)性分布頻率對比分析 安徽地區(qū)與江蘇、湖北、四川等9省漢族女性人群MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性比較見表1。結(jié)果顯示,安徽地區(qū)女性人群677T等位基因頻率為50.2%,與江蘇(43.5%)、湖北(40.3%)、河南(60.2%)、陜西地區(qū)(54.3%)女性人群等位基因頻率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而與山東(63.1%)、四川(36.0%)、云南(36.3%)、廣東(28.5%)以及海南地區(qū)(24.0%)女性人群等位基因頻率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外,本研究及比較結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)MTHFR基因C677T等位基因頻率具有顯著的地區(qū)漸變趨勢,即由南向北等位基因的頻率越來越高(最南方的海南省為24.0%,中部的安徽省為50.2%,而最北邊的山東省為63.1%)。
表1 安徽地區(qū)漢族孕婦人群與其他9省漢族女性人群MTHFR C677T基因型及其等位基因頻率比較[9]
葉酸是細(xì)胞分裂與修復(fù)的關(guān)鍵因子,且在調(diào)節(jié)表觀基因的表達(dá)方面發(fā)揮重要作用。孕婦在孕期需要更多的葉酸以滿足胎兒生長的需要。研究表明,流產(chǎn)、神經(jīng)管畸形、唇腭裂等多種疾病的發(fā)生與葉酸的濃度密切相關(guān)[6,7,10]。我國從2006年起,規(guī)定懷孕前3個月開始補(bǔ)充葉酸,由國家免費(fèi)提供,劑量為每天400微克,用以預(yù)防神經(jīng)管畸形、唇腭裂等多種出生疾病。然而研究發(fā)現(xiàn),MTHFR基因中C677T在人群中的多態(tài)性使酶活性嚴(yán)重下降。因此,每個個體對葉酸的代謝能力不同,使得葉酸的補(bǔ)充宜遵循個體化用藥原則。
本研究對安徽地區(qū)484名漢族孕婦體內(nèi)MTHFR基因進(jìn)行分型,結(jié)果顯示該人群中MTHFR基因C677T位點(diǎn)存在基因多態(tài)性現(xiàn)象。通過與其他9省比較結(jié)果發(fā)現(xiàn),該位點(diǎn)等位基因頻率存在地區(qū)差異性,即C677T等位基因從南到北有逐漸上升的趨勢。安徽地區(qū)與山東、四川、云南、廣東以及海南地區(qū)女性人群等位基因頻率具有顯著差異,提示該位點(diǎn)在安徽與這些地區(qū)有著不同的遺傳背景。此外,安徽地區(qū)677T基因頻率為50.2%,提示將近50%孕婦攜帶風(fēng)險突變基因,對這些孕婦的個體化用藥指導(dǎo)是進(jìn)一步降低出生缺陷的重要方法。
中國地域廣闊、民族眾多,多項(xiàng)研究表明女性人群中MTHFR基因C677T多態(tài)性的分布存在一定的群體和地域差異。因此,基于MTHFR基因C677T多態(tài)性檢測的孕期葉酸個體化用藥指導(dǎo)將是進(jìn)一步降低出生缺陷的重要手段。
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Polymorphism of MTHFR Among Pregnant Woman in Anhui Province
WANG Bo, FAN Li-ping, SHI De-bao, et al.Department of clinic laboratory, the First affiliated hospital of Anhui Medical University, Hefei230022
Objective To investigate the genotype distribution of the methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR) C677T essential for the folic acid biosynthetic pathway among Chinese Han pregnant women in Anhui province, so as to provide pregnant women with guidance of supplementing folic acid. Methods By mean of PCR- chip hybridization method, 484 samples collected from Anhui province were detected the genotype distributions and allele frequencies of MTHFR C677T, then, the results were compared with published data in other 9 provinces of China. ResultsIn Anhui Han pregnant women population,the CC,TC,and TT genotypic frequencies of SNP C677T were 25.2 % ,49.2% and 25.6 %,respectively.Significant different of genotypic frequencies have been observed between Anhui women population and Shandong, Sichuan, Yunnan and Hainan women population (P<0.05). Conclusion The distributions of C677T in the MTHFR gene showed geographical variations. The polymorphisms of MTHFR may play a role in birth defects risk, thus, periconceptional folic acid supplementation and healthcare following gene polymorphism investigation may be a powerful measure to decrease congenital malformations.
Anhui province Pregnant woman population MTHFR Gene polymorphism
R392.11
A
1671-2587(2017)06-0581-04
10.3969/j.issn.1671-2587.2017.06.015
*本課題受國家自然基金(No. 81601446)、安徽省自然科學(xué)基金(No.1708085QH210)、安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研基金(No.3101005001238)資助
230022 合肥,安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科
汪波(1988–),男,安徽合肥人,檢驗(yàn)技師,博士,主要從事病原微生物學(xué)檢測,(E-mail)wangbo8711@126.com。
徐元宏,男,教授,主任技師,碩士生導(dǎo)師,(E-mail)xyhong1964@163.com。
2017-04-10)
(本文編輯:潘?。?/p>