王慧茹 潘健

肺癌小鼠模型中刪除MDSCs對(duì)CD8+T細(xì)胞的影響

王慧茹 潘健

目的 在路易斯肺癌LLC荷瘤小鼠模型中通過刪除外周血中骨髓來源的抑制細(xì)胞（MDSCs），探討MDSCs對(duì)CD8+T細(xì)胞數(shù)量和功能、體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)及小鼠生存期的影響。方法 將C57小鼠皮下接種LLC，尾靜脈注射Gr-1抗體刪除荷瘤小鼠血液中的MDSC或注射對(duì)照抗體，于不同時(shí)間點(diǎn)采尾血，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中MDSC和CD8+T細(xì)胞的變化，記錄腫瘤生長(zhǎng)情況和小鼠生存期，比較兩組荷瘤小鼠的脾細(xì)胞對(duì)LLC細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果 LLC荷瘤7 d后小鼠中MDSCs比例（%）（23.870±1.350）顯著高于正常小鼠（7.600±0.677）（P＜0.001），CD8+T細(xì)胞比例（%）（7.906±0.428）顯著低于正常小鼠（11.220±0.606）（P＜0.001）； 荷瘤7 d注射Gr-1刪除抗體或?qū)φ湛贵w，3 d后刪除組外周血MDSCs比例（%）較未刪除組顯著降低（分別為1.578±0.299 vs 38.340±3.214，P＜0.001），CD8+T細(xì)胞比例（%）顯著高于未刪除組（分別為9.464±0.820 vs 4.024±0.488，P＜0.001）； 抗體注射10 d后刪除組MDSCs比例（%）較之前顯著增加（31.980±3.595），但仍然低于普通荷瘤組（63.660±5.763）（P=0.001 6），CD8+T細(xì)胞比例（%）較之前降低（5.806±0.554），仍高于普通荷瘤組（2.894±0.330）（P=0.001 9）；MDSCs刪除組小鼠腫瘤生長(zhǎng)減緩（P＜0.05）、生存期延長(zhǎng)（P=0.036，中位生存期46 d vs 53 d）。結(jié)論 在LLC荷瘤小鼠中刪除MDSC能解除其對(duì)CD8+T細(xì)胞的抑制，減緩腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)小鼠生存期。

肺癌 骨髓來源的抑制細(xì)胞 CD8+T細(xì)胞 免疫抑制

據(jù)國(guó)家癌癥中心統(tǒng)計(jì)，肺癌是我國(guó)發(fā)病和致死率最高的腫瘤，嚴(yán)重威脅人群生命健康[1]。機(jī)體免疫監(jiān)視功能下降是腫瘤發(fā)病和進(jìn)展的重要特征之一，研究表明多種復(fù)雜因素參與其中。其中骨髓來源的抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）是一群異質(zhì)性病理激活的未成熟骨髓細(xì)胞，在腫瘤微環(huán)境中顯著增加，發(fā)揮抑制抗腫瘤免疫的功能，而去除MDSCs的抑制作用或誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）等，可能在腫瘤治療研究中發(fā)揮積極意義[2]。現(xiàn)以路易斯肺癌LLC荷瘤小鼠模型經(jīng)刪除血液中MDSCs，探討MDSCs對(duì)CD8+T細(xì)胞數(shù)量和功能、體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)及小鼠生存期的影響。

材料與方法

1 材料

1.1 細(xì)胞系：小鼠Lewis肺癌細(xì)胞LLC細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所免疫實(shí)驗(yàn)室保存。DMEMF12培養(yǎng)基加10%胎牛血清用于LLC細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為飽和濕度、37℃、5%CO2，每3天左右當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%左右融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6～8周雌性C57BL/6小鼠購(gòu)自北京維通利華公司，體重18～20 g，于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。

1.3 主要試劑和儀器：Gr-1刪除抗體（RB6-8C5）、FITC標(biāo)記的CD11b抗體、PE標(biāo)記的Gr-1抗體、CD8-PE、CD3-PE/CY7購(gòu)自BioLegend公司。流式細(xì)胞儀為Millipore Guava。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：消化收集LLC細(xì)胞，PBS洗滌，臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞活力大于95%，細(xì)胞計(jì)數(shù)。用PBS調(diào)整濃度為1×107/ml，混勻后皮下接種于8周雌性C57小鼠背部，每只接種100 μl約1×106，待腫瘤長(zhǎng)到直徑約3～6 mm時(shí)（約第7天），剔除腫瘤大小不合規(guī)定的小鼠，將剩余小鼠隨機(jī)分為2組，每組5只，實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射Gr-1刪除抗體100 μg，對(duì)照組尾靜脈注射兔IgG100 μg。在抗體注射后的第3、7、10天分別留取血液進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè)。同時(shí)每3～4天測(cè)量腫瘤直徑，腫瘤大小計(jì)算公式為v=0.52×a×b×b，同時(shí)記錄小鼠生存時(shí)間。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)：在規(guī)定時(shí)間減去小鼠尾巴一小段，留取血液約20 μl，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后，調(diào)整白細(xì)胞濃度為1×107/ml，檢測(cè)MDSCs，用抗體CD11b-FITC和Gr-1-PE標(biāo)記染色，CD8+T細(xì)胞用CD3-PE/CY7、CD8-PE染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。數(shù)據(jù)分析應(yīng)用FlowJo 7.6軟件。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism V軟件，數(shù)據(jù)用表示。組間差異采用t檢驗(yàn)，小鼠生存期的比較采用Kaplan-Meier 分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 C57小鼠荷LLC腫瘤細(xì)胞1周后，腫瘤生長(zhǎng)直徑約為3～6 mm的橢球狀，外周血中CD11b+Gr-1+的MDSCs比例（%）為23.870±1.350，顯著高于對(duì)照非荷瘤小鼠的7.600±0.677（P＜0.001），同時(shí)CD8+T細(xì)胞比例（%）7.906±0.428顯著低于正常小鼠（11.22±0.606）（P=0.0021），提示隨著LLC腫瘤的生長(zhǎng)，外周血中出現(xiàn)了大量MDSCs，同時(shí)抑制了CD8+T細(xì)胞的比例（見圖1）。

圖1 C57小鼠荷瘤7 d后外周血中MDSC和CD8+T細(xì)胞的變化（每組5只小鼠）

2 荷瘤小鼠注射Gr-1抗體或?qū)φ湛贵w3 d后檢測(cè)外周血中MDSCs比例（%），刪除組為1.578±0.299，顯著低于對(duì)照組38.340±3.214（P＜0.001），表明刪除抗體有效消除了MDSCs；（圖2A）。刪除MDSCs的小鼠外周血中CD8+T細(xì)胞比例（%）為9.464±0.820，顯著高于對(duì)照未刪除組4.024±0.488（P＜0.001），提示刪除MDSCs能有效消除其對(duì)CD8+T細(xì)胞的抑制（圖2B）。

3 C57小鼠荷瘤17 d時(shí)，此時(shí)刪除MDSCs的實(shí)驗(yàn)組小鼠已經(jīng)距注射Gr-1抗體10 d，檢測(cè)兩組小鼠外周血發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠中MDSCs比例（%）已經(jīng)升高為63.660±5.763，雖然也顯著高于刪除組的31.980±3.595（P=0.0016），但結(jié)果已提示隨著時(shí)間的推移，刪除抗體的效果已大大減弱。（圖3A）。同時(shí)對(duì)照組小鼠的CD8+T細(xì)胞比例（%）繼續(xù)減少為2.894±0.330，仍顯著低于刪除MDSCs組的5.806±0.554（P=0.0019）（圖3B）。

圖2 C57小鼠荷瘤10 d注射不同抗體后外周血中MDSC和CD8+T細(xì)胞的變化（每組5只小鼠）

圖3 C57小鼠荷瘤17 d注射不同抗體后外周血中MDSC和CD8+T細(xì)胞的變化（每組5只小鼠）

圖4 C57小鼠荷瘤注射不同抗體后腫瘤生長(zhǎng)曲線

4 兩組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示，如圖4所示，注射Gr-1抗體刪除MDSCs能顯著抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)（第13天，P=0.025；第17天，P=0.043），但隨著抗體的代謝消除，腫瘤生長(zhǎng)重新恢復(fù)，兩組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（第21天，P=0.052）。圖5的生存曲線顯示，注射刪除MDSCs組的小鼠中位生存時(shí)間為53 d，顯著高于對(duì)照組小鼠的46 d（P=0.036）。

圖5 C57小鼠荷瘤注射不同抗體后的生存曲線（每組5只小鼠）

討 論

腫瘤免疫治療被科學(xué)雜志評(píng)為2013年度十大科學(xué)進(jìn)展首位，表明腫瘤免疫逃逸在腫瘤的發(fā)病和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，而逆轉(zhuǎn)免疫細(xì)胞的抑制狀態(tài)可能對(duì)腫瘤治療發(fā)揮積極的意義[3]。MDSCs和Treg是兩個(gè)發(fā)揮免疫抑制作用的細(xì)胞群，MDSCs主要由未成熟的巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及粒細(xì)胞組成。人類MDSCs被確定為CD33+CD11b+HLADRlow，小鼠 MDSCs被確定為Gr1+CD11b+[4，5]。本研究通過建立小鼠LLC皮下腫瘤刪除MDSCs模型，連續(xù)檢測(cè)外周血MDSCs、CD8+T細(xì)胞的比例變化和特點(diǎn)，探索刪除MDSCs在免疫治療中的意義。

正常狀態(tài)下，小鼠體內(nèi)MDSCs主要集中在骨髓，外周血和脾臟中的比例較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示正常C57小鼠外周血MDSC的比例為（7.600±0.677）%，而接種LLC腫瘤的小鼠，7 d后雖出瘤不久，但外周血中MSDCs比例已顯著提升約3倍（23.870±1.350）%。隨著腫瘤的生長(zhǎng)，10 d后MDSCs比例不斷攀升為（38.340±3.214）%，17 d后MDSC已上升為外周血中白細(xì)胞的主要成分（63.660±5.763）%，其原因可能為腫瘤生長(zhǎng)過程中分泌的眾多細(xì)胞因子誘導(dǎo)骨髓造血干細(xì)胞不斷分化發(fā)育為MDSCs，向周圍器官和腫瘤微環(huán)境遷移，導(dǎo)致其大量聚集于骨髓、外周血、脾臟、淋巴結(jié)和腫瘤組織周圍，發(fā)揮免疫負(fù)調(diào)控的功能[6]。本結(jié)果顯示，在注射Gr-1刪除抗體3 d后，外周血中MDSCs大部分已被刪除，僅為（1.578±0.299）%，此時(shí)CD8+T細(xì)胞比例已恢復(fù)至（9.464±0.820）%，雖然低于非荷瘤小鼠的（11.220±0.606）%，但已顯著高于同時(shí)間段未刪除MDSC的荷瘤小鼠（4.024±0.488）%，提示此時(shí)減少的MDSCs降低了其對(duì)CD8+T細(xì)胞的免疫抑制作用。研究表明MDSCs可通過表達(dá)高水平的ARGl，分解環(huán)境中存在的T細(xì)胞活化所必需的氨基酸—精氨酸，從而導(dǎo)致CD4+和CD8+T細(xì)胞活化受阻；MDSC還能下調(diào)TCR相關(guān)ζ鏈，ζ鏈缺失導(dǎo)致CD4+和CD8+T細(xì)胞活化信號(hào)不能傳遞[7]；MDSC也可誘導(dǎo)T細(xì)胞阻滯在G0/G1周期；通過消耗環(huán)境中T細(xì)胞活化所必需的半胱氨酸，阻斷T細(xì)胞活化[8]；MDSC經(jīng)下調(diào)naive T細(xì)胞淋巴結(jié)歸巢必需的分子CD62L表達(dá)，使naive T細(xì)胞不能有效遷移到能夠接受腫瘤抗原刺激的淋巴結(jié)，導(dǎo)致活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少[9]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是另一種重要的免疫抑制細(xì)胞，研究表明MDSC 細(xì)胞可作為抗原提呈細(xì)胞攝取、處理并向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞呈遞耐受原，進(jìn)而介導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的募集和擴(kuò)增，發(fā)揮聯(lián)合抑制反應(yīng)[10]。我們推測(cè)刪除MDSC后小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例也會(huì)減小，共同減輕免疫抑制反應(yīng)，從而得到較長(zhǎng)的生存期。

本研究是通過一次注射抗體刪除MDSCs，其效果持續(xù)時(shí)間在第3天最顯著，注射抗體10 d后，MDSCs比例又開始迅速升高，與此同時(shí)CD8+T細(xì)胞由于MDSCs的免疫抑制作用，受到抑制比例顯著下降，小鼠腫瘤也生長(zhǎng)得更快，與對(duì)照組的差異開始消失。由于腫瘤生長(zhǎng)過程中釋放的多種細(xì)胞因子等能誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞分化為MDSCs，因此持續(xù)消除MDSCs的免疫抑制作用需要間隔多次注射抗體，才能取得更好的抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果。然而，小鼠的生存期顯示雖荷瘤20多天后兩組小鼠的原位腫瘤生長(zhǎng)無明顯差異，刪除MDSC組小鼠的生存期卻高于對(duì)照小鼠，提示干預(yù)免疫功能更大的意義在于改善生存期，而其抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用較為有限。肝癌的臨床研究也表明較高的MDSCs細(xì)胞比例與較差的預(yù)后相關(guān)[11]。

本研究在小鼠肺癌模型中刪除MDSCs細(xì)胞，證實(shí)MDSCs細(xì)胞的減少能顯著解除其對(duì)CD8+T細(xì)胞的抑制作用，同時(shí)減緩腫瘤生長(zhǎng)及改善小鼠生存期。關(guān)于MDSCs細(xì)胞抑制抗腫瘤免疫及改善生存期的具體分子機(jī)制等有待更深入的研究。

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The Influence of MDSC Depletion on CD8+ T Cells in Lung Carcinoma of Mouse Model

WANG Hui-ru，PAN Jian.Anhui Provincial Hospital23001

Objective To explore the effect of MDSCs on the number and function of CD8+T cells，tumor growth in vivo and survival in Lewis lung cancer mice. Methods LLC tumor cells were inoculated into the flank of C57 LB/6 mice.MDSC were depleted by intravenous administration of Gr-1 blocking antibody. Tail blood was collected and CD8+T cells，MDSCs and splenocyte cytotoxicity of LLC were detected by flow cytometry. Tumor growth and survival of tumor bearing mice were recorded. Results On day 7 after tumor inoculation，the percentages of MDSCs from tumor bearing mice were significantly higher than the control （23.87±1.35% vs 7.600±0.677%，P＜0.001） and CD8+T cells were declined compared with the control （7.906±0.428%） vs （11.22±0.606%，P＜0.001）. Gr-1 blocking antibody was administered to deplete MDSCs. On day 3 after administration，the percentages of MDSCs were rapidly decreased（1.578±0.299% vs 38.34±3.214%，P＜0.001） and CD8+T cells were significantly higher than control mice（9.464±0.820 vs 4.024±0.488，P＜0.001）. On day 10 after administration，MDSCs percentages were increased，but decreased when compared to control mice（1.578±0.299%） vs（38.34±3.214%，P=0.0016） and CD8+T cells were deceased but elevated compared with control mice（9.464±0.820%）vs（ 4.024±0.488%，P=0.0019）. Tumor growth in mice with MDSCs depletion was markedly inhibited compared with control group（P＜0.05）. The survival of mice with MDSCs depletion was notably longer than control mice（P=0.036，median survival 46 vs 53）. Conclusion MDSCs depletion in LLC tumor bearing mice eliminated the inhibition of CD8+T cells by MDSCs Leading to a restriction of tumor growth and prolonged survival.

Lung carcinoma Myeloid-derived suppressor cells CD8+Tcells Immunosuppression

R734.2 R392.11

A

1671-2587（2017）06-0543-04

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.06.003

230001 合肥，安徽省立醫(yī)院輸血科

王慧茹（1987–），女，安徽合肥人，檢驗(yàn)技師，博士，主要從事腫瘤免疫相關(guān)研究工作，（E-mail）wanghuiruru@163.com。

潘健，男，副主任技師，碩士，（E-mail）707957231@qq.com。

2017-05-21）

（本文編輯：王虹）