鄭維威 呂長坤 張文靜

·基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)·

雷公藤甲素誘導(dǎo)急性髓細(xì)胞白血病干細(xì)胞凋亡及其機(jī)制*

鄭維威 呂長坤 張文靜

目的 探討雷公藤甲素誘導(dǎo)急性髓細(xì)胞白血病干細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。方法 采用MTT法檢測雷公藤甲素對KG-1細(xì)胞的增殖抑制作用，計(jì)算出IC50值，按照濃度梯度用雷公藤甲素處理KG-1細(xì)胞48 h，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡變化。Western blot法檢測Bcl-2、β-catenin、p-AKT和AKT 等蛋白的變化。結(jié)果 雷公藤甲素對KG-1細(xì)胞的增殖抑制呈劑量依賴性，IC50值約為4 nmmol/L，其還可誘導(dǎo)KG-1細(xì)胞凋亡。雷公藤甲素能夠下調(diào)Bcl-2、β-catenin，p-AKT等蛋白的表達(dá)水平。結(jié)論 雷公藤甲素誘導(dǎo)KG-1細(xì)胞的分子機(jī)制可能與Bcl-2、β-catenin、p-AKT的下調(diào)有關(guān)。

雷公藤甲素 髓細(xì)胞白血病干細(xì)胞 凋亡

急性髓細(xì)胞性白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一種造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病。目前研究表明AML干細(xì)胞是AML起源及難治復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。AML干細(xì)胞具有自我更新能力以及無限再殖潛力，對化療藥物耐藥[1]。因此。尋找針對AML干細(xì)胞的治療藥物是AML最根本的治療策略。雷公藤甲素是從中草藥雷公藤中提取出來的一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯成分，具有一定的抗腫瘤作用，近年來廣受關(guān)注[2]。為探討雷公藤甲素抗急性髓細(xì)胞白血病干細(xì)胞的分子機(jī)制，我們開展了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

材料與方法

1 試劑及抗體 雷公藤甲素購自Sigma公司，RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基購于上海生工；胎牛血清購于Biological Industries；MTT 粉劑購于Sigma公司；一抗：β-catenin，p-AKT，AKT和Bcl-2購于CST；GAPDH購于康成生物；二抗：HRP偶聯(lián)的抗兔、抗鼠購于康成生物；PVDF 膜購于上海生工；ECL購于PIERCE公司。AV/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購于美國BD公司。FITC標(biāo)記小鼠抗人CD34單克隆抗體、PE標(biāo)記小鼠抗人CD38單克隆抗體購于BD美國公司，AnnexinV/FITC凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物有限公司，RIPA裂解液購于碧云天公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng)及分選 將人AML細(xì)胞株KG-l細(xì)胞株（來自浙江大學(xué)腫瘤研究所）置于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中（含1%青-鏈霉素），置37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均處于對數(shù)期。應(yīng)用CD34-FITC、CD38-PE和Anti-FITC、PE分別標(biāo)記KG-1，使用流式細(xì)胞儀分選出CD34+CD38-KG-1細(xì)胞。

3 MTT法檢測雷公藤甲素對KG-1細(xì)胞的增殖抑制作用 將細(xì)胞懸液（5×104/ml）加入到96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，培養(yǎng)4 h后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求加入不同濃度的雷公藤甲素100 μl，另設(shè)空白孔，不加藥對照，每組6個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μl的5 mg/ml的MTT溶液，反應(yīng)4 h，離心吸去培養(yǎng)基，每孔加200 μl DMSO搖勻后，用酶標(biāo)儀（波長570 nm）測吸光度值（A）。利用公式測定抑制率（%）=（1–A實(shí)驗(yàn)組/A對照組）×100%，然后用Graphpad計(jì)算出IC50。

4 流式細(xì)胞儀檢測雷公藤甲素誘導(dǎo)KG-1細(xì)胞凋亡比例 KG-1細(xì)胞（1×105/ml）按照0、2、4、8、16 nmol/L濃度，加入雷公藤甲素處理，48 h 后收集細(xì)胞，用冷的PBS洗2遍，取1×106個細(xì)胞加入1 ml結(jié)合緩沖液重懸，取100 μl加入Annexin V/FITC 5 μl和PI 5 μl，混勻室溫避光孵育15 min，然后加入400 μl結(jié)合緩沖液，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。

5 Western blotting檢測雷公藤甲素對KG-1細(xì)胞Bcl-2、β-catenin、p-AKT和AKT 等蛋白的影響

KG-1細(xì)胞（1×105/ml）按照0、2、4、8、16 nmol/L濃度，加入雷公藤甲素處理，48 h后收集細(xì)胞，蛋白裂解液冰上裂解20 min，4 ℃、12 000g離心10 min，提取上清總蛋白。取20 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，用含5%奶粉的TBST室溫1 h。一抗4 ℃過夜，二抗室溫1 h，ECL顯影，膠片曝光成像。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件，多個樣本均數(shù)的比較采用方差分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 雷公藤甲素對KG-1細(xì)胞的增殖抑制作用 隨著濃度的增高，抑制作用增強(qiáng)，提示雷公藤甲素對KG-1細(xì)胞的增殖抑制作用呈劑量依賴關(guān)系。TPL對KG-1細(xì)胞的IC50值為4 nmol/L。見圖1。

2 雷公藤甲素誘導(dǎo)KG-1細(xì)胞的凋亡 根據(jù)課題組前期研究[3]，分別用0、2、4、8、16 nmol/L的雷公藤甲素處理KG-1細(xì)胞48 h 后，細(xì)胞的凋亡比例分別為1.5%、12.5%、15.9%、24.0%和43.5%，隨著藥物濃度的上升而增加，呈劑量依賴性（圖2），提示雷公藤甲素能夠誘導(dǎo)KG-1細(xì)胞凋亡。

3 雷公藤甲素對KG-1細(xì)胞Bcl-2、β-catenin、p-AKT和AKT 等蛋白表達(dá)的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，0、2、4、8、16 nmol/L雷公藤甲素處理KG-1細(xì)胞48 h后，隨著藥物濃度的增高，Bcl-2、β-catenin、p-AKT等蛋白的表達(dá)水平降低，提示雷公藤甲素能夠下調(diào)Bcl-2、β-catenin、p-AKT等蛋白的表達(dá)（圖3）。

圖1 雷公藤甲素對KG-1細(xì)胞的增殖抑制作用

圖2 雷公藤甲素可誘導(dǎo)KG-1細(xì)胞的凋亡

圖3 雷公藤甲素對KG-1細(xì)胞Mcl-1,β-catenin，p-AKT和AKT 表達(dá)的影響

討 論

目前的觀點(diǎn)認(rèn)為，AML干細(xì)胞在AML耐藥中扮演著十分重要的角色，是AML治療失敗的根本原因，針對AML干細(xì)胞的靶點(diǎn)成為AML治療的選擇手段之一。AML干細(xì)胞很難通過化學(xué)治療殺滅，其自我更新與復(fù)制將使AML的治療更加困難，因此，臨床上一直在尋找特異性殺傷AML干細(xì)胞的方法[4]。本實(shí)驗(yàn)所用的KG-1細(xì)胞來源于AML-M0男性患者，對常規(guī)AML化療藥物天然耐藥。該細(xì)胞系高表達(dá)CD34、CD123，基本不表達(dá)CD38，經(jīng)過流式細(xì)胞儀檢測，其 CD34+CD38–比例高達(dá)95.3%。有研究表明，KG-1a細(xì)胞經(jīng)過流式細(xì)胞儀分選，其 CD34+CD38–比例為98.15%，且82.4%的細(xì)胞位于G0/G1期[5]，這兩種細(xì)胞均高度符合AML干細(xì)胞的免疫表型，故我們將該細(xì)胞系用于AML干細(xì)胞的功能及機(jī)制研究。

雷公藤甲素具有廣譜、高效的抗腫瘤作用，對急性白血病、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、乳腺癌等都有較高活性[6]。研究表明，低濃度的TPL可以提高去甲氧柔紅霉素（IDA）誘導(dǎo)白血病干細(xì)胞的凋亡比例，低TPL（IC20濃度：5 nm）顯著增強(qiáng)了去甲氧柔紅霉素殺傷LSC的效果。TPL聯(lián)合IDA減少了LSC中HIF-1α的表達(dá)水平，其下游基因如BNIP3、VEGF和CAIX，表達(dá)水平也下降，同時，ROS的表達(dá)增加，NRF2表達(dá)減少也是TPL引發(fā)細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制之一[5]。但TPL誘導(dǎo)白血病干細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制目前尚不完全清楚。

Bcl-2是Bcl家族中抑制凋亡亞家族的典型代表，它是一種細(xì)胞原癌基因，可通過改變線粒體的通透性，抑制凋亡誘導(dǎo)因子的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡[7]。本研究結(jié)果表明，雷公藤甲素下調(diào)了KG-1細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，由此推測雷公藤甲素誘導(dǎo)KG-1細(xì)胞凋亡的作用可能與Bcl-2的表達(dá)下降有關(guān)。β-catenin是干細(xì)胞的標(biāo)志性分子之一，在白血病干細(xì)胞的自我更新與復(fù)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，介導(dǎo)混合系白血病干細(xì)胞的產(chǎn)生和耐藥[8]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，雷公藤甲素誘導(dǎo)KG-1細(xì)胞凋亡與下調(diào)β-catenin的表達(dá)有關(guān)。Akt 是原癌基因c-Akt 的表達(dá)產(chǎn)物，又稱蛋白激酶B，在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、生理代謝、衰老及疾病和癌癥等細(xì)胞生理病理活動的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用[9]。實(shí)驗(yàn)表明，雷公藤甲素可抑制磷酸化Akt的表達(dá)，這一結(jié)果說明，雷公藤甲素誘導(dǎo)KG-1細(xì)胞凋亡與磷酸化Akt的表達(dá)下降有一定的關(guān)系。

綜上所述，雷公藤甲素可以誘導(dǎo)急性髓細(xì)胞白血病干細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與抑制Bcl-2、β-catenin、p-AKT等蛋白的表達(dá)水平有關(guān)，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

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3 陳將華，鄭維威，姜旭東，等.雷公藤甲素通過抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒HERV-K Np9基因轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)人急性T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞凋亡[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，12（5）：702-706.

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Mechanism of Triptolide Induced Apoptosis of Acute Myelogenous Leukemia Stem CellsZHENG

WEI-wei，LV CHANG-kun，ZHANG WEN-jing. Dept.of Laboratory Medicine，Affiliated Anhui Provincial Hospital，Anhui Medical University，Hefei，Anhui230000

Objective To study the molecular mechanisms of acute myelogenous leukemia stem cell apoptosis induced by triptolide. Methods Proliferation inhibition of triptolide to KG-1 cell was determined by MTT, IC50 concentration was calculated. According to the concentration gradient of triptolide, KG-1cells were collected to detect cell apoptosis via flow cytometry 48h after treatment. Bcl-2, beta-catenin, p-AKT and AKT proteins were detected by Western blot. Results Triptolide to KG-1 cell proliferation inhibition is in dose dependent manner and IC50 is about 4 nmmol/L, it can also induce apoptosis of KG-1 cell. Bcl-2, beta-catenin, p-AKT proteins can be down-regulated by triptolide.Conclusions Molecular mechanism of triptolide induced KG - 1 cell may be related to the Bcl-2, beta-catenin and p-AKT.

Triptolide Myeloid leukemia stem cell Apoptosis

R446.1 R733.71

A

1671-2587（2017）06-0540-03

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.06.002

*本課題受國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81700154）資助

230000 合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院檢驗(yàn)科（鄭維威，張文靜）；商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)技術(shù)系（呂長坤）

鄭維威（1984–），男，安徽鳳陽人，主管技師，博士，主要從事臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)及臨床血液學(xué)研究，（E-mail）379667349@qq.com。

2017-06-25）

（本文編輯：王虹）