胡珺，王常高，林建國(guó)，杜馨，蔡俊

(湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430068)

響應(yīng)面法優(yōu)化假單胞菌HFE733產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵培養(yǎng)基的研究

胡珺，王常高，林建國(guó)，杜馨，蔡俊*

(湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430068)

研究采用響應(yīng)面法對(duì)假單胞菌HFE733產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。在前期運(yùn)用單因素試驗(yàn)優(yōu)化的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出培養(yǎng)基組分中影響脂肪酶活力的2個(gè)顯著性因素：酵母膏和橄欖油。運(yùn)用單因素試驗(yàn)研究非顯著因素的最低添加量來(lái)降低生產(chǎn)成本，然后運(yùn)用最陡爬坡試驗(yàn)找到中心復(fù)合試驗(yàn)的中心點(diǎn)，最后利用中心復(fù)合設(shè)計(jì)確定顯著性因素之間的交互作用及最佳組成。結(jié)果表明：最佳培養(yǎng)基組分為酵母膏34 g/L、橄欖油5.92 mL/L、蔗糖12.5 g/L、CuSO4·5H2O 0.4 g/L、MnSO4·H2O 0.2 g/L，在此條件下脂肪酶酶活可達(dá)到9.27 U/mL，與模型預(yù)測(cè)值相近，且與單因素優(yōu)化后的酶活(4.53 U/mL)相比，提高了104.64%。

假單胞菌；脂肪酶；響應(yīng)面法；培養(yǎng)基優(yōu)化

脂肪酶(E.C.3.1.1.3)，又稱(chēng)三酰甘油?；饷?。在水相中，能將甘油三脂水解生成甘油一酯、二酯或者直接生成甘油和脂肪酸[1]。在非水相體系中，脂肪酶具有良好的脂化、轉(zhuǎn)脂、醇解和胺解等特性[2]，該特性可使脂肪酶被廣泛應(yīng)用在藥物合成、造紙、紡織、食品、化妝品等行業(yè)[3，4]。由于在食品行業(yè)中脂肪酶能水解底物生成飽和和不飽和的脂肪酸、羧酸和酮酸[5]，而這些物質(zhì)是風(fēng)味物質(zhì)的主要組成成分，能提升食品的品質(zhì)和口感，因此近年來(lái)脂肪酶被越來(lái)越多地應(yīng)用在食品烘焙、乳制品和糖果的生產(chǎn)中[6，7]，以期望達(dá)到提升食品質(zhì)量和增香的目的。

本研究以實(shí)驗(yàn)室篩選的假單胞菌(Pseudomonassp. HFE733)作為出發(fā)菌株，在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)其液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，提高酶活的同時(shí)，降低了原料成本，為后期應(yīng)用在增香乳制品上打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

假單胞菌(Pseudomonassp.HFE733)： 實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

ZHWY系列雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；AR1140型電子分析天平 奧豪斯國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司；3K15冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；ZSD-1270全自動(dòng)生化培養(yǎng)箱；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；PHS-25 pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，(NH4)2SO45 g/L，K2HPO4·3H2O 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，蛋白胨25 g/L，橄欖油10 mL/L；

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖12.5 g/L，酵母膏20 g/L，CuSO4·5H2O 0.5 g/L，MnSO4·H2O 0.5 g/L，橄欖油10 mL/L；

斜面保藏培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉20 g/L。

1.3 脂肪酶粗酶液的制備與酶活的測(cè)定

取假單胞菌(Pseudomonassp.HFE733)接種于種子培養(yǎng)基，在30 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)12 h；取5 mL(接種量10%)種子培養(yǎng)液接種于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)60 h。4 ℃，8000 r/min離心15 min后取上清液即得粗酶液。

采用GB/T 23535-2009《脂肪酶制劑》中所述的酸堿滴定法測(cè)定脂肪酶酶活。脂肪酶酶活定義為：1 mL液體酶，在一定溫度和pH條件下，1 min水解底物產(chǎn)生1 μmol的可滴定的脂肪酸，即為1個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)

Plackett-Burman設(shè)計(jì)是以最少試驗(yàn)次數(shù)找到對(duì)脂肪酶酶活有顯著性影響的因素(可信度大于95%的因素作為主效應(yīng))的試驗(yàn)方法[8]。選用試驗(yàn)次數(shù)N=12的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取單因素優(yōu)化試驗(yàn)中對(duì)菌株產(chǎn)脂肪酶影響較大的培養(yǎng)基的5個(gè)組分，每個(gè)因素取高低2個(gè)水平，高水平為“+”，低水平為“-”，以脂肪酶酶活(U/mL)為響應(yīng)值Y。通過(guò)該設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，篩選出顯著性因素進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的各因素和水平見(jiàn)表 1。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)各因素與水平Table 1 Plackett-Burman design factors and levels

1.4.2 最低添加量試驗(yàn)

對(duì)于Plackett-Burman試驗(yàn)分析得出的不顯著因素，為了簡(jiǎn)化培養(yǎng)基組分和降低成本，采用單因素試驗(yàn)確定這些培養(yǎng)基成分的最低添加量。

1.4.3 最陡爬坡試驗(yàn)

在Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出的顯著性因素后，對(duì)其最佳值區(qū)域進(jìn)行進(jìn)一步確定的實(shí)驗(yàn)方法。根據(jù)顯著性因素效應(yīng)值確定變化步長(zhǎng)和變化方向，近一步靠近最佳值區(qū)域。找到拐點(diǎn)，為后續(xù)的中心復(fù)合設(shè)計(jì)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1.4.4 Central Composite Design(CCD)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)及最陡爬坡試驗(yàn)的結(jié)果，通過(guò)二因素五水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)確定假單胞菌的最適培養(yǎng)基成分。用軟件Design Expert 8.0.6對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸分析，確定顯著性因素的最佳添加量，依據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面三維立體分析圖。CCD試驗(yàn)自變量水平的編碼值和實(shí)際值見(jiàn)表2。

表2 中心復(fù)合設(shè)計(jì)各因素與水平Table 2 Central composite design factors and levels

1.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)Design Expert 8.0.6由回歸方程計(jì)算出顯著性因素酵母膏和橄欖油產(chǎn)酶的最佳濃度，同時(shí)預(yù)測(cè)出在最佳濃度下的預(yù)測(cè)值。通過(guò)在各組分最佳濃度下所測(cè)得的實(shí)際酶活值與響應(yīng)面預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，以驗(yàn)證模型是否可靠，進(jìn)而確定最終優(yōu)化培養(yǎng)基組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果與分析

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。

續(xù) 表

對(duì)表3中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析和方差分析，分析結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

表4 Plackett-Burman設(shè)計(jì)回歸分析Table 4 Regression analysis of Plackett-Burman design

注：模型在5%水平上差異顯著，“*”代表顯著因素；表5和表8與此同。

表5 Plackett-Burman設(shè)計(jì)方差分析Table 5 Variance analysis of Plackett-Burman design

由Plackett-Burman設(shè)計(jì)回歸分析可以看出，該回歸模型的p值(prob>F)=0<0.05，則該模型在95%的置信區(qū)間內(nèi)顯著。酵母膏和橄欖油的p值分別為0.017和0.031，均小于0.05，則酵母膏和橄欖油在95%的置信區(qū)間內(nèi)顯著，而蔗糖、CuSO4·5H2O和MnSO4·H2O的p值分別為0.139，0.273和0.505，均大于0.05，則蔗糖、CuSO4·5H2O和MnSO4·H2O在95%的置信區(qū)間內(nèi)不顯著。由Plackett-Burman設(shè)計(jì)方差分析可以看出，其決定系數(shù)R2=0.7963，說(shuō)明回歸方程可以解釋高達(dá)79.63%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.2 最低添加量試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)，由于R2=0.7963<0.9，因此為了進(jìn)一步提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度，對(duì)不顯著因素蔗糖、CuSO4·5H2O和MnSO4·H2O做最低添加量實(shí)驗(yàn)，以期達(dá)到培養(yǎng)基成分最優(yōu)最小的用量。

圖1 最低添加量的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Fig.1 Design and results of the minimum additive amount experiment

由圖1(a)可知，隨著蔗糖添加量的增加，脂肪酶酶活逐漸增加，當(dāng)蔗糖濃度為12.5 g/L時(shí)，脂肪酶酶活達(dá)到最大值8.58 U/mL；由圖1(b)可知，隨著硫酸銅添加量的增加，脂肪酶酶活逐漸增加，當(dāng)硫酸銅濃度為0.4 g/L時(shí)，脂肪酶酶活達(dá)到最大值7.58 U/mL；由圖1(c)可知，隨著硫酸錳添加量的增加，脂肪酶酶活逐漸增加，當(dāng)硫酸錳添加量為0.2 g/L時(shí)，脂肪酶酶活達(dá)到最大值為7.65 U/mL。故選擇蔗糖、硫酸銅和硫酸錳的添加量分別為12.5，0.4，0.2 g/L。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

為了進(jìn)一步提高脂肪酶酶活，尋求發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)組合，根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)的回歸分析和方差分析，酵母膏為正效應(yīng)，說(shuō)明隨著添加量水平逐步升高，脂肪酶酶活也會(huì)得到提高。反之，橄欖油為負(fù)效應(yīng)，說(shuō)明隨著其添加水平的逐步降低，脂肪酶酶活將會(huì)得到提高。據(jù)此，設(shè)計(jì)了最陡爬坡試驗(yàn)，見(jiàn)表6。

表6 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of the steepest climbing experiment

由表6可知，第2組試驗(yàn)時(shí)脂肪酶酶活最高，即酵母膏和橄欖油的用量分別為30 g/L和6 mL/L時(shí)，酶活為7.20 U/mL，隨著運(yùn)行序的進(jìn)一步增加，脂肪酶酶活逐漸降低。故選擇酵母膏和橄欖油的添加量分別為30 g/L和6 mL/L作為中心復(fù)合設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

2.4 中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)(Central Composite Design)

經(jīng)Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選得到2種顯著影響脂肪酶酶活的培養(yǎng)基成分，即酵母膏和橄欖油，根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)得到中心復(fù)合試驗(yàn)的中心點(diǎn)，即酵母膏和橄欖油的添加量分別為30 g/L和6 mL/L。以此2種顯著性因素的濃度為自變量，脂肪酶的酶活(U/mL)為響應(yīng)值，進(jìn)行二因素五水平的中心復(fù)合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，其設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 中心復(fù)合設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Design and results of central composite

表8 中心復(fù)合設(shè)計(jì)回歸分析Table 8 Regression analysis of central composite design

由表8可知，模型的p(prob>F)<0.05，說(shuō)明模型具有顯著性，該二次模型多元相關(guān)性系數(shù)R2=0.9593，表明預(yù)測(cè)僅有4.07%的變異情況不能由該模型解釋?zhuān)M項(xiàng)p值為0.6540表明失擬項(xiàng)不顯著，模型沒(méi)有失擬現(xiàn)象。A，A2和B2對(duì)酶活的影響顯著。

通過(guò)二次模型回歸系數(shù)的計(jì)算，得到如下方程以表征2個(gè)顯著性因素酵母膏和橄欖油對(duì)脂肪酶酶活力的影響:

Y=10.13+0.18A+0.085B-0.15AB-0.57A2-0.43B2。

式中：Y代表脂肪酶的預(yù)測(cè)值(U/mL)，A和B分別代表酵母膏和橄欖油的質(zhì)量濃度(g/L)。

根據(jù)Design Expert 8.0.6軟件對(duì)回歸方程中的交互項(xiàng)AB繪制響應(yīng)面分析圖，觀(guān)察其對(duì)脂肪酶酶活的影響。

圖2 酵母膏和橄欖油的交互作用對(duì)脂肪酶酶活影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface for interaction effects of yeast extract and olive oil on lipase activity

由圖2可知，當(dāng)酵母膏添加量不變時(shí)，隨著橄欖油含量的增加，酶活力出現(xiàn)了先增大后減小的趨勢(shì)。同樣，當(dāng)橄欖油含量不變時(shí)，隨著酵母膏添加量的增加，酶活力也明顯出現(xiàn)了先增大后減小的趨勢(shì)，且曲面呈鐘罩型，說(shuō)明兩者之間交互作用顯著。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件對(duì)回歸方程求解，得出菌株產(chǎn)脂肪酶的最佳培養(yǎng)基組成為：酵母膏34 g/L、橄欖油5.92 mL/L，其他培養(yǎng)基成分為：蔗糖12.5 g/L、硫酸銅0.4 g/L、硫酸錳0.2 g/L，在此條件下做3次驗(yàn)證性試驗(yàn)，測(cè)得脂肪酶酶活平均值為9.27 U/mL。實(shí)測(cè)值與回歸方程預(yù)測(cè)值9.91 U/mL相對(duì)誤差很小，由此可見(jiàn)，用該回歸模型優(yōu)化假單胞菌(Pseudomonassp.HFE733)產(chǎn)脂肪酶進(jìn)行的分析和預(yù)測(cè)是可行的，且具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究以實(shí)驗(yàn)室自行篩選并保存的假單胞菌(Pseudomonassp. HFE733)為出發(fā)菌株，利用響應(yīng)面法對(duì)其液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，得到的最佳培養(yǎng)基組分為：酵母膏34 g/L、橄欖油5.92 mL/L、蔗糖12.5 g/L、硫酸銅0.4 g/L、硫酸錳0.2 g/L。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果(9.27 U/mL)與預(yù)測(cè)值(9.91 U/mL)基本吻合，說(shuō)明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化假單胞菌產(chǎn)脂肪酶是合理可靠的，且酶活與單因素優(yōu)化后的最大酶活力(4.53 U/mL)相比，提高了104.64%，為后期應(yīng)用在增香乳制品上打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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StudyonOptimizationofCultureMediumforLipaseProductionbyPseudomonassp.HFE733UsingResponseSurfaceMethodology

HU Jun, WANG Chang-gao, LIN Jian-guo, DU Xin, CAI Jun*

(Key Laboratory of Fermentation Engineering, Ministry of Education, Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China)

In this study, response surface methodology (RSM) is employed to optimize the fermentation culture medium for lipase production byPseudomonassp. HFE733 in submerged fermentation. Based on single factor experiments,two significant influence factors are screened by the method of Plackett-Burman design as: yeast extract and olive oil. To reduce the production cost, the minimum additive amount experiment is used to find out the minimum additive amount of non-significant factors, and the steepest ascent design is applied to obtain the center point of central composite design, and the optimal concentration and correlations of two factors are identified by central composite design. The result indicates that the optimal fermentation components for lipase production are as follows: yeast extract is 34 g/L, olive oil is 5.92 mL/L, sucrose is 12.5 g/L, CuSO4·5H2O is 0.4 g/L, MnSO4·H2O is 0.2 g/L. The enzyme activity in verification test reaches 9.27 U/mL, consistent with the model predicted value, which is 104.64% higher than that of single factor experiments' results (4.53 U/mL).

Pseudomonassp.； lipase；RSM；culture medium optimization

TS201.25

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.003

1000-9973(2017)12-0012-05

2017-06-15 *通訊作者

國(guó)家自然科學(xué)基金(31401807)

胡珺(1988-)，男，碩士，研究方向：發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化與放大;

蔡俊(1968-)，男，教授，博士，研究方向：微生物發(fā)酵工程。