楊柳，陳宇飛，王磊

(吉林工商學(xué)院 食品工程學(xué)院，長(zhǎng)春 130507)

調(diào)味粉中罌粟堿LAMP檢測(cè)方法建立及試劑盒研制

楊柳，陳宇飛，王磊

(吉林工商學(xué)院 食品工程學(xué)院，長(zhǎng)春 130507)

建立調(diào)味粉中罌粟堿LAMP(loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP)檢測(cè)方法，并研制出配套試劑盒。根據(jù)罌粟堿的特異性基因序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)12種罌粟、11種香辛料和1種虞美人核酸樣品進(jìn)行特異性、最佳溫度篩選及敏感性實(shí)驗(yàn)，根據(jù)優(yōu)化后的反應(yīng)條件，組裝試劑盒，并采用試劑盒對(duì)市售的8種調(diào)味粉進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：12種罌粟和虞美人發(fā)生了特異性反應(yīng)，最佳反應(yīng)溫度為65 ℃，LAMP檢測(cè)最低濃度達(dá)70 pg/μL，敏感性是PCR檢測(cè)的10倍。市售8種調(diào)味粉中，有1種含有罌粟堿成分。實(shí)驗(yàn)所建立的檢測(cè)方法及研制的試劑盒對(duì)調(diào)味粉中摻加罌粟粉檢測(cè)具有重要意義。

調(diào)味粉；罌粟堿；LAMP；濁度法；熒光法；試劑盒

食品行業(yè)中某些不法商販，為了牟取暴利，利用罌粟殼的成癮特性，在食品尤其是火鍋香料、調(diào)料中進(jìn)行了添加，對(duì)消費(fèi)者的身體和心理造成嚴(yán)重的傷害[1]。罌粟為一年生草本植物，含有的生物堿包括罌粟堿、嗎啡、那可丁等20多種[2]。其中，罌粟堿是自然界中存在的一種重要的芐基異喹啉類生物堿，在阿片類植物如罌粟的殼和籽中含量較高[3]，久服易成癮，過(guò)量攝入會(huì)引起心律不齊[4]。

對(duì)于罌粟堿等生物堿的檢測(cè)，國(guó)內(nèi)并無(wú)統(tǒng)一的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，給食品監(jiān)督管理工作帶來(lái)難度[5]。文獻(xiàn)中關(guān)于食品摻加罌粟堿的檢測(cè)方法有高效液相色譜法[6]、PCR法[7]、酶聯(lián)免疫法[8]等，這些方法存在靈敏度低、干擾嚴(yán)重、操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題[9]。因此，急需建立一種更加準(zhǔn)確、快速和簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。

LAMP技術(shù)，是由日本科學(xué)家Notomi等[10]于2000年發(fā)明的。其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異性引物，在鏈轉(zhuǎn)換DNA聚合酶的作用下恒溫?cái)U(kuò)增，具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、產(chǎn)物易檢測(cè)等特點(diǎn)[11]。目前，LAMP技術(shù)在檢測(cè)致病菌[12]、轉(zhuǎn)基因[13]、耐藥基因[14]、寄生蟲[15]等方面被廣泛應(yīng)用。但是迄今為止，還未見(jiàn)LAMP技術(shù)用于檢測(cè)罌粟堿方面的報(bào)道。

本研究的目的是建立罌粟堿LAMP檢測(cè)方法并開(kāi)發(fā)配套試劑盒，對(duì)調(diào)味粉中摻加罌粟粉的檢測(cè)與監(jiān)測(cè)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

罌粟：收集于東北三?。幌阈亮希嘿?gòu)于長(zhǎng)春歐亞超市；虞美人：采自長(zhǎng)春北湖濕地公園；復(fù)合調(diào)味料：購(gòu)于長(zhǎng)春市光復(fù)路市場(chǎng)。

1.1.2 試劑

Tris-HC 上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；Triton X-100 上海聯(lián)碩生物科技有限公司；甜菜堿、Chelex-100 北京索寶生物科技有限公司；dNTP 美國(guó)Pharmacia公司；NP-40 西安晶彩生物科技有限公司；Takara試劑盒 寶生物工程(大連)有限公司；氫氧化鈉、EDTA、硫酸銨、氯化鉀、硫酸鎂、氯化錳 廣州西隴化工有限公司；瓊脂糖 北京沃比森科技有限公司； LAMP法DNA擴(kuò)增試劑盒、LAMP反應(yīng)管、熒光染料 日本榮研化學(xué)株式會(huì)社。

1.1.3 儀器

La-320C實(shí)時(shí)濁度儀 日本榮研化學(xué)株式會(huì)社；CHB-100HB-100型恒溫金屬浴 杭州博日科技有限公司；NanoQ微分光光度計(jì) 北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司；ST5型凝膠成像儀 VILBER公司；ETC811型基因擴(kuò)增儀 蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品核酸提取

對(duì)12種罌粟、11種香辛料和1種虞美人分別進(jìn)行3次液氮研磨，稱取100 mg樣本，使用Takara試劑盒，按照說(shuō)明書提取DNA。

1.2.2 特異性基因及LAMP反應(yīng)引物設(shè)計(jì)

對(duì)罌粟堿基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，確定罌粟堿靶基因序列。采用王麗等[16]的方法設(shè)計(jì)3套LAMP基因引物，見(jiàn)表1。

表1 LAMP引物設(shè)計(jì)Table 1 LAMP primers design

1.2.3 LAMP反應(yīng)體系建立

參考王瑾等[17]的方法建立LAMP反應(yīng)體系，其中 5 pmol F3 和 B3，20 pmol LB和LF。將反應(yīng)溫度設(shè)定為60～67 ℃，將反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為60 min，采用雙蒸水作為陰性對(duì)照。

1.2.4 LAMP反應(yīng)原理

1.2.4.1 濁度法

根據(jù)焦磷酸鎂白色沉淀，利用濁度儀進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。

1.2.4.2 熒光法

在LAMP反應(yīng)體系中加入鈣黃綠素，目視檢測(cè)。

1.2.5 最佳引物篩選實(shí)驗(yàn)

將建立的LAMP反應(yīng)體系溫度設(shè)定為64 ℃恒溫，以核酸濃度較高的8號(hào)罌粟為對(duì)象，分別利用PA7，PA48和PA100 3套LAMP引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，篩選最佳引物。

1.2.6 最佳溫度篩選實(shí)驗(yàn)

用篩選出的最佳引物進(jìn)行溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，設(shè)置溫度為60～67 ℃，梯度為1 ℃，以8號(hào)罌粟樣本為對(duì)象，篩選最佳溫度，確立最佳實(shí)驗(yàn)體系。

1.2.7 特異性實(shí)驗(yàn)

在最佳實(shí)驗(yàn)體系下，采用濁度法進(jìn)行特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。樣品為12種罌粟、11種香辛料和1種虞美人。

1.2.8 敏感性實(shí)驗(yàn)

以8號(hào)罌粟基因組為對(duì)象，定量后將總DNA進(jìn)行10倍稀釋，使得最終DNA濃度分別為70,7.0,0.7 ng/μL和70，7.0，0.7，0.07 pg/μL，陰性對(duì)照為雙蒸水，分別采用熒光顯色法和濁度法檢測(cè)LAMP 方法的敏感性。

PCR反應(yīng)采用袁瑛娜等[15]的方法，對(duì)比PCR反應(yīng)與LAMP反應(yīng)的敏感性。

1.2.9 試劑盒組裝及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)確立的最佳引物、聚合酶及相關(guān)的試劑組裝LAMP檢測(cè)試劑盒，對(duì)市售8種復(fù)合調(diào)味粉進(jìn)行檢測(cè)，并與國(guó)標(biāo)檢測(cè)法進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，3套引物對(duì)模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，在60 min內(nèi)，PA7引物組沒(méi)有發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，PA48引物組在24 min時(shí)的濁度為0.056，即剛剛開(kāi)始擴(kuò)增，而PA100引物組濁度為0.3498，最先發(fā)生LAMP引物，因此選PA100引物組為最佳引物。

2.2 溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Results of temperature optimization experiment

由圖2可知，溫度在60～67 ℃時(shí)，都能發(fā)生LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，但反應(yīng)時(shí)間不同。63，64，65 ℃時(shí)發(fā)生LAMP反應(yīng)時(shí)間較早，在18 min時(shí)分別為0.077，0.081，0.082，由于溫度較高時(shí)特異性更好，所以將最佳溫度選為65 ℃。

2.3 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(濁度法)Fig.3 Results of specificity test (nephelometry)

由圖3可知，罌粟1～12號(hào)樣本都能發(fā)生LAMP反應(yīng)，其他香辛料均不發(fā)生反應(yīng)，體現(xiàn)了LAMP反應(yīng)的特異性。虞美人LAMP擴(kuò)增時(shí)間較晚，但也能發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，分析原因，虞美人屬于罌粟科罌粟屬植物，所含成分與罌粟相近，所以也能發(fā)生反應(yīng)。因?yàn)檎{(diào)味粉產(chǎn)品中不添加虞美人，因此不影響檢測(cè)效果。

2.4 敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(濁度法)Fig.4 Results of sensitivity test (nephelometry)

圖5 敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(染色法)Fig.5 Results of sensitivity test (staining method)

注：從左到右，模板濃度依次為70，7，0.7 ng/μL和70，7，0.7，0.07 pg/μL，陰性對(duì)照。

由圖4和圖5可知，將10倍梯度稀釋的罌粟堿基因組模板用于LAMP 反應(yīng)，濁度法與染色法實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，LAMP最低檢測(cè)濃度為70 pg/μL。

圖6 PCR敏感性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Results of sensitivity test for PCR

注：從左到右，模板濃度依次為70，7，0.7 ng/μL和70，7，0.7，0.07 pg/μL，陰性對(duì)照。DNA Marker 為D2000。

將10倍梯度稀釋的基因組用于PCR反應(yīng)，由圖6可知， PCR最低檢測(cè)濃度為0.7 ng/μL，因此LAMP法敏感性是普通PCR方法的10倍。

2.5 試劑盒驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖7 試劑盒驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Results of detection test for seasoning powders

由圖7可知，使用該試劑盒對(duì)市場(chǎng)上8種復(fù)合調(diào)味粉進(jìn)行檢測(cè)，其中一種調(diào)味粉(4號(hào)樣本)顯示陽(yáng)性，即含有罌粟堿成分。采用國(guó)標(biāo)法檢測(cè)，符合率為100%。

3 結(jié)論

本研究對(duì)收集的12種罌粟、11種香辛料和1種虞美人，使用Takara試劑盒，采用 NanoQ微分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，最終確定從罌粟種子中提取DNA，其含量最高。

根據(jù)罌粟堿靶基因序列，采用LAMP引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。NCBI網(wǎng)站序列對(duì)比顯示：引物對(duì)罌粟基因具有特異性。因此，12種罌粟都發(fā)生LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，11種香辛料均不發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。因?yàn)橛菝廊藢儆诶浰诳评浰趯?，與罌粟基因相近，所以也能發(fā)生反應(yīng)。但虞美人不含罌粟堿成分，在調(diào)味粉產(chǎn)品中不添加，因此，檢測(cè)中虞美人呈陽(yáng)性，對(duì)調(diào)味粉中罌粟堿的有效檢測(cè)沒(méi)有影響。

組裝的試劑盒對(duì)市售8種復(fù)合調(diào)味粉進(jìn)行摻假檢測(cè)，有一種含有罌粟成分。罌粟堿毒性巨大，市售復(fù)合調(diào)味粉一定要經(jīng)過(guò)檢測(cè)，確定不含罌粟成分后方能入市，確保食品安全。

本研究建立的方法準(zhǔn)確可靠，簡(jiǎn)便快速，有助于市場(chǎng)中對(duì)調(diào)味粉的監(jiān)管。

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ConstructionofLAMPDetectionMethodforPapaverineinSeasoningPowdersandDevelopmentofKit

YANG Liu, CHEN Yu-fei, WANG Lei

(School of Food Engineering, Jilin Business and Technology College, Changchun 130507, China)

The LAMP detection method for papaverine in seasoning powders is constructed and the corresponding kit is developed.The primer is designed based on the specific genes sequence of papaverine.The specificity test, screening test for optimum temperature and sensitivity test of 12 poppies,11 spices and nucleic acid sample of a corn poppy are made.The kit is assembled based on the optimized reaction conditions, and 8 commercially seasoning powders are detected by using kit. The results are determined as follows:12 poppies and corn poppy show the specific reaction.The optimum temperature is 65 ℃ and the minimum detectable concentration is 70 pg/μL,the sensitivity is 10 times larger than that of PCR.There is papaverine in one of the 8 commercially seasoning powders.The detection method and development of kit have great significance for monitoring the adulteration of poppy powder in seasoning powders.

seasoning powders；papaverine；LAMP；nephelometry；fluorescence；kit

TS264.2

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.12.035

1000-9973(2017)12-0158-04

2017-08-01

吉林省醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展引導(dǎo)資金項(xiàng)目(20150311097YY)

楊柳(1975-)，女，教授，研究方向：食品安全檢測(cè)。