鄧澤熙盧水煥劉學員詹 球梁 靜陳湘鵬蔡質(zhì)梅熊義博黃心元

·論著·

餐后低血壓家兔模型建立探討

鄧澤熙1,盧水煥1,劉學員1,詹 球2,梁 靜2,陳湘鵬1,蔡質(zhì)梅1,熊義博1,黃心元1

目的通過高脂喂養(yǎng)與頸動脈內(nèi)膜干燥建立餐后低血壓的家兔模型。方法17只新西蘭兔隨機分四組，對照組普通飼料喂養(yǎng)，高脂喂養(yǎng)組予高脂飼料喂養(yǎng)，高脂喂養(yǎng)+單側手術組予高脂喂養(yǎng)并進行右側頸動脈氣體干燥，高脂喂養(yǎng)組+雙側手術組予高脂喂養(yǎng)并進行雙側氣體干燥。8周后留置胃管，行股動脈插管，監(jiān)測注食前后各組家兔血壓變化。結果光鏡下染色觀察：對照組頸部血管無明顯變化，高脂喂養(yǎng)組內(nèi)膜輕度增厚，可見血管平滑肌細胞的增生。高脂喂養(yǎng)+單側手術組的右側(手術側)頸動脈及高脂喂養(yǎng)+雙側手術組的雙側頸動脈管壁明顯增厚，管腔狹窄。高脂喂養(yǎng)+單側手術組注食后平均動脈壓(Mean arterial pressure，MAP)較注食前下降(P<0.05)；高脂喂養(yǎng)+雙側手術組注食后收縮壓(Systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(Diastolic blood pressure，DBP)、MAP均較注食前下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論利用高脂喂養(yǎng)與頸動脈內(nèi)膜干燥結合可建立餐后低血壓家兔模型，此方法簡單可行。

動脈粥樣硬化；低血壓；家兔；動物模型

餐后低血壓(postprandial hypotension，PPH)是老年人常見而特有的疾病，近年發(fā)現(xiàn)，PPH是老年人全因死亡的一個獨立的預測因子[1]，可能導致暈厥、跌倒，甚至短暫性腦缺血發(fā)作、心絞痛、心肌梗死等嚴重事件[2]。有關調(diào)查顯示，老年人中2/5的腦卒中患者、1/4的心肌梗死患者是由于低血壓引起的[3]。由于PPH的影響因素眾多，目前，其病因及發(fā)病機制尚不明確，治療方法有待開發(fā)。既往關于餐后低血壓的研究多局限于臨床觀察及流行病學數(shù)據(jù)收集整理。因此，建立一個穩(wěn)定可行的適用于臨床研究的餐后低血壓動物模型很有必要。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：雄性新西蘭白兔17只，月齡21～24月，體重(2.80±0.26)kg，由解放軍第一八一醫(yī)院動物實驗室提供。實驗對動物的處理方法符合中華人民共和國科學技術部頒發(fā)的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 主要實驗材料、儀器：高脂飼料(按2%膽固醇、6%花生油和92%普通飼料的比例加工配制，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；Picco2監(jiān)測儀(BeneviewT5，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；BH_2型顯微鏡(OlympusBX41)。

1.3 方法：健康新西蘭白兔共17只。隨機分為對照組、高脂喂養(yǎng)組、高脂喂養(yǎng)+單側手術組、高脂喂養(yǎng)+雙側手術組共四組，對照組2只，其余每組5只。對照組予普通飼料喂養(yǎng)，100g/日，其余三組高脂飼料喂養(yǎng)，100g/日，共喂養(yǎng)8周。

1.3.1 頸動脈內(nèi)膜氣體干燥：于喂養(yǎng)第2周時對高脂喂養(yǎng)+單側手術組、高脂喂養(yǎng)+雙側手術組實施右側頸動脈內(nèi)膜氣體干燥術，第6周時對高脂喂養(yǎng)+雙側手術組實施左側頸動脈內(nèi)膜氣體干燥術，術后繼續(xù)喂養(yǎng)至8周。

1.3.2 頸動脈內(nèi)膜氣體干燥術[4]：動物術前禁食12小時，不禁水。予3%戊巴比妥鈉30mg/kg經(jīng)耳緣靜脈麻醉后，仰臥位固定，頸部脫毛清潔消毒后，于頸正中旁開1cm切皮，于甲狀軟骨上方水平分離頸總動脈至分叉處，長約3cm，兩端以動脈夾阻斷血流。10ml注射器充滿生理鹽水，接4.5號頭皮針平行于血管縱軸方向穿刺阻斷血管的兩端，一端留小孔，另一端以生理鹽水沖洗置換出管腔內(nèi)的血液后，接上已調(diào)節(jié)好流量為250ml/min的醫(yī)用氧氣氣流，歷時5分鐘造成內(nèi)皮干燥，然后管腔內(nèi)重新充滿生理鹽水，放開動脈夾以恢復血流。濕潤棉片輕輕壓迫穿刺點3～5min止血，縫合皮膚創(chuàng)口并包扎。術后于大腿內(nèi)側肌注青霉素20萬iu/只。

1.3.3 注食前后血壓、心率、頸動脈竇壓力感受器敏感性(carotid sinus baroreflex，又稱BRS)的計算：喂養(yǎng)結束，四組大白兔分別予戊巴比妥麻醉(用量同上)，仰臥位固定。大腿內(nèi)側脫毛消毒后，沿股動脈搏動方向切皮，分離股動脈，股動脈插管，將壓力頭連接于Picco2監(jiān)測儀，監(jiān)測血壓、心率(HR)。經(jīng)鼻緩慢插入Fr14動物專用胃管，插入長度約15～20cm，插入成功后觀察5～10min，記錄血壓、HR，每2s采樣一次，共監(jiān)測30s。計算平均值及平均動脈壓(MAP)。經(jīng)胃管注入流食60ml(50%葡萄糖40ml，伊利純牛奶20ml)。注食后60min內(nèi)每5min按上述方法再次記錄血壓、心率。

由Logstic方程計算BRS[5]：HR=A/{1+exp[B(MAP-C)]}+D，其中A為HR變化的范圍，B為斜率相關系數(shù)，C為HR變化中點對應的血壓值(MAP50)，D為最小的HR值。

1.3.4 組織取材染色：實驗結束處死家兔，作頸正中切口，分離雙側頸總動脈至分叉處，留取3～4cm，沖洗血管內(nèi)血液，肉眼觀察各段血管斷端情況，然后以10%的福爾馬林溶液固定后。標本經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋、切片處理后，行蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色，光學顯微鏡觀察動脈內(nèi)壁病理學形態(tài)改變。

2 結果

2.1 一般情況：1只家兔于高脂喂養(yǎng)第三周死亡，2只在留置胃管注食測壓后死亡，其余14只均無中途患病或死亡，實驗過程未發(fā)現(xiàn)傷口感染，創(chuàng)口愈合良好，按計劃完成實驗。

2.2 各組兔頸動脈病理形態(tài)學觀察：(1)大體觀察：對照組、高脂喂養(yǎng)組的雙側頸動脈及高脂喂養(yǎng)+單側手術組的左側頸動脈均管壁柔軟，富有彈性，管腔內(nèi)膜光滑。高脂喂養(yǎng)+單側手術組的右側(手術側)頸動脈及高脂喂養(yǎng)+雙側手術組的雙側頸動脈均顏色黃白相間，管壁粗細不均，管壁僵硬，增厚，管腔內(nèi)膜粗糙不平，有點片狀脂紋或黃白色斑塊隆起。(2)光鏡下HE染色觀察：對照組頸動脈內(nèi)皮細胞完整，單層緊貼內(nèi)彈力板，中層平滑肌細胞排列整齊，胞漿呈嗜酸性紅染，無明顯脂質(zhì)沉積，圖1(見封3)。高脂喂養(yǎng)組內(nèi)膜輕度增厚，血管壁可見血管平滑肌細胞的增生，中膜變薄，圖2(見封3)。高脂喂養(yǎng)+單側手術組的右側(手術側)頸動脈及高脂喂養(yǎng)+雙側手術組的雙側頸動脈管壁明顯增厚，管腔狹窄，內(nèi)膜管腔面纖維組織細胞增生形成纖維帽，纖維帽下大量泡沫細胞堆積并有大量粉染的無定形物質(zhì)，形成粥樣斑塊，中膜肌層內(nèi)胞漿嗜酸性的平滑肌細胞減少，代之以大量的胞漿淡染和充滿脂質(zhì)空泡的泡沫細胞，圖3(見封3)。

2.3 四組兔注食前后各參數(shù)比較：普通喂養(yǎng)組、高脂喂養(yǎng)組、高脂喂養(yǎng)+單側手術組、高脂喂養(yǎng)+雙側手術組四組注食前各參數(shù)比較，HR組間比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，進一步兩兩比較顯示高脂喂養(yǎng)+雙側手術組HR顯著低于其他三組(P<0.05)。各組注食前后血壓比較，高脂喂養(yǎng)+單側手術組注食后MAP較注食前下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高脂喂養(yǎng)+雙側手術組注食后SBP、DBP、MAP均較注食前下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，各組BRS比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 四組兔SBP、DBP、HR及BRS水平比較

注：與本組注食前比較*P<0.05；與其他三組注食前比較△P<0.05

3 討論

PPH是老年人重要的臨床疾病，發(fā)病率高，可能導致暈厥、跌倒，甚至短暫性腦缺血發(fā)作、心絞痛、心肌梗死等嚴重事件[2]。由于PPH的影響因素眾多，目前還缺乏大規(guī)模的對照試驗證據(jù)。因此，其病因和發(fā)病機制仍不太明確，目前尚未有PPH動物模型制作的先例，建立一個成熟、可重復的餐后低血壓動物模型，對PPH的病因、發(fā)病機制研究及臨床診療的探討有重要意義?，F(xiàn)今國內(nèi)外對于PPH尚無明確統(tǒng)一的診斷標準。較公認的PPH診斷指餐后2h內(nèi)血壓較餐前下降>20mmHg，并且若餐前收縮壓>100mmHg，餐后<90mmHg，或餐后出現(xiàn)血壓下降并伴隨頭暈、暈厥等低血壓癥狀也可疑似診斷PPH[6]。動物實驗上PPH尚無明確標準，本實驗將注食前后SBP、MBP、MAP均明顯下降動物視為存在PPH用以研究。

國內(nèi)外臨床研究表明，PPH的發(fā)生，與壓力反射受損，特別是頸動脈竇壓力感受器敏感性下降密切相關[7]。本實驗通過高脂喂養(yǎng)+空氣干燥法建立家兔頸動脈(竇部)粥樣硬化模型，為保證家兔腦部基本血供，雙側頸動脈手術組在進行一側動脈干燥后，經(jīng)1個月再進行另一側手術。通過對靠近頸動脈竇部的頸動脈進行內(nèi)膜干燥，促進粥樣硬化斑塊的形成，影響壓力反射，使兔進食后血壓不能快速調(diào)節(jié)，出現(xiàn)PPH，成功建立了PPH家兔模型，也從側面驗證了PPH與頸動脈竇粥樣硬化密切相關[7]。臨床研究推測PPH可能與BRS的下降有關[7，8]，本實驗測得BRS各組比較無統(tǒng)計學差異，數(shù)據(jù)顯示各組間BRS差異極大，考慮跟樣本量偏小及動物間個體差異有關。

既往動脈硬化動物實驗多采用家兔及大鼠進行研究，家兔與人體血壓更為接近，且兔頸動脈內(nèi)膜損傷比大鼠更為可控，家兔動脈的生理病理特點也與人體更為相似[9]。頸動脈粥樣硬化動物模型的建立方法相對成熟，Le等[10]首次報告隔離頸動脈進行氣體干燥聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)復制動脈硬化病變。國內(nèi)動物實驗氣體干燥多采用原有報導使用氮氣干燥。本實驗采用臨床更為常用的醫(yī)用氧氣進行內(nèi)膜干燥損傷，同樣達到了理想效果，并節(jié)約了實驗成本。高脂喂養(yǎng)組動物及單側手術組未進行手術的一側頸動脈可見平滑肌增生，未見明顯脂質(zhì)沉淀，動脈硬化不明顯，一方面可能與實驗時間較短有關，一方面也反映了內(nèi)膜損傷在動脈硬化過程中的重要作用。本實驗氣體干燥組的頸動脈均發(fā)生了明顯動脈粥樣硬化并生成斑塊，出現(xiàn)明顯管腔狹窄。其中無頸動脈硬化家兔進食后血壓無明顯下降，單側頸動脈硬化組家兔僅有MAP下降，提示單側頸動脈硬化家兔基本能代償進食引起的血壓下降，而雙側頸動脈(竇部)硬化組家兔注食后SBP、DBP、MAP均顯著下降，注食前后對比有明顯統(tǒng)計學差異，該模型達到PPH動物實驗的要求，有望在餐后低血壓動物實驗研究中得到進一步的完善及廣泛應用。

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ExploreWaystoEstablishRabbitModelofPostprandialHypotension.

DENGZe_xi,LUShui_huan,LIUXue_yuan,etal.

181stHospitalofChinesePeople’sLiberationArmy,Guangxi541002,China

ObjectiveTo establish a rabbit model of atherosclerosis postprandial hypotension by using cholesterol_diet and carotid intimal dryness.MethodsSeventeen New Zealand rabbits were assigned into four groups randomly: normal group fed with normal food, lipo_fed group fed with high lipo food, lipo_fed and unilateral operation group fed with high lipo food and

an operation with right side carotid artery air_drying, lipo_fed and bilateral operation group fed with high lipo food and received an operation with bilateral carotid artery air_drying. After 8 weeks, the indwelling gastric tube and femoral artery catheterization were used to monitor the blood pressure changes of rabbits before and after the feeding.ResultsTrypan_blue staining was observed by light microscopy. there were no obvious changes in the blood vessels of control group; the intima was slightly thickened with proliferation of vascular smooth muscle cells in the high_lipo diet group. In the group of lipo_fed and bilateral operation and the group of lipo_fed and unilateral operation，the arterial wall was thickened and luminal stenosis was observed. In the group of lipo_fed and unilateral operation, the mean arterial pressure (MAP) was declined after the feeding (P<0.05). In the group of lipo_fed and bilateral operation, the SBP, DBP, MBP were all decreased statistically after the feeding (P<0.05).ConclusionsA rabbit model of atherosclerosis postprandial hypotension can be established by combination of high fat feeding and carotid intima drying, which is simple and feasible. which advantaged the experimental study of postprandial hypotension.

Atherosclerosis; hypotension; Rabbit; Animal model

廣西自治區(qū)桂林市科學研究與技術開發(fā)計劃項目(編號：20140310_3_1)；軍隊保健專項科研課題(編號：12BJZ14)

541002 廣西桂林，中國人民解放軍第181醫(yī)院(1.干部病房；2.動物實驗室)

鄧澤熙(1987_)，醫(yī)師

劉學員，主任醫(yī)師，E_mail：lxy37511@sohu.com

R443+.5

A

1009_816X(2017)04_0253_03

10.3969/j.issn.1009_816x.2017.04.03

2017_2_17)