何華偉，王葉菁，宋凱，王姣，位曙光，趙朋，趙萍

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家蠶蛋白酪氨酸磷酸酶基因克隆、表達(dá)純化與結(jié)構(gòu)分析

何華偉1,2，王葉菁1,2，宋凱1，王姣2，位曙光1，趙朋1，趙萍1

1 西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715 2 西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400715

何華偉, 王葉菁, 宋凱, 等. 家蠶蛋白酪氨酸磷酸酶基因克隆、表達(dá)純化與結(jié)構(gòu)分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(11): 1827–1839.He HW, Wang YJ, Song K, et al. Cloning, expression, purification and structure analysis of protein tyrosine phosphatase of Bombyx mori. Chin J Biotech, 2017, 33(11): 1827–1839.

蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase, PTP, EC 3.1.3.48) 特異性地催化去除磷酸化修飾的酪氨酸殘基上的磷酸基團(tuán)，導(dǎo)致蛋白去磷酸化，從而調(diào)控了細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和免疫等生命活動(dòng)。家蠶蛋白酪氨酸磷酸酶h (BmPTP-h) 參與了核型多角體病毒(Nucleopolyhedrovirus，NPV) 在家蠶體內(nèi)的復(fù)制過程，但目前對(duì)于BmPTP-h結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的了解并不多。本文從家蠶中腸克隆了基因編碼序列，分析了BmPTP-h的基因組結(jié)構(gòu)、mRNA結(jié)構(gòu)、序列特征、二級(jí)結(jié)構(gòu)和溶液中的狀態(tài)。同源氨基酸序列比對(duì)分析表明BmPTP-h與多種昆蟲NPV的PTP序列具有高相似度，暗示了它們可能具有共同的起源和相似的功能。文中構(gòu)建了原核表達(dá)載體，通過大腸桿菌在25 ℃下表達(dá)獲得了可溶性的重組BmPTP-h，利用Ni-NTA親和層析純化了BmPTP-h。凝膠過濾分析顯示BmPTP-h在溶液中可以形成聚集體和單體。圓二色光譜分析顯示重組的BmPTP-h包含α螺旋結(jié)構(gòu)，升高溫度導(dǎo)致BmPTP-h的α螺旋結(jié)構(gòu)去折疊，α螺旋結(jié)構(gòu)含量下降。這些研究為深入研究BmPTP-h的結(jié)構(gòu)和調(diào)控機(jī)理提供了基礎(chǔ)。

家蠶，蛋白酪氨酸磷酸酶，克隆，表達(dá)純化，結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化反應(yīng)是生物體內(nèi)最重要的生化反應(yīng)之一，在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和免疫等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1-4]。磷酸化主要由蛋白激酶介導(dǎo)，去磷酸化是通過蛋白磷酸酶來實(shí)現(xiàn)。蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase，PTP，EC 3.1.3.48)是一類超家族磷酸酶，通過特異性地催化去除磷酸化修飾的酪氨酸殘基上的磷酸基團(tuán)來改變其磷酸化狀態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞功能的調(diào)控[4]。PTPs通常分為3大類：特異性PTPs、雙特異性PTPs和低分子量PTPs。特異性和低分子量PTPs的底物是含有酪氨酸的蛋白，而雙特異性PTPs的底物除了含有酪氨酸的蛋白，還可以是含有絲氨酸和蘇氨酸的蛋白。雙特異性PTPs包括促分裂素原活化蛋白激酶磷酸酶、細(xì)胞分裂周期蛋白Cdc25和腫瘤抑制因子PTEN等[5]。盡管氨基酸序列和底物各不相同，大多數(shù)的PTPs都具有一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)模體(Motif) (H/V)C(X)R(S/T)。該結(jié)構(gòu)模體對(duì)PTP的催化活性具有關(guān)鍵作用[6]。PTPs功能異常與多種疾病相關(guān)，包括Ⅱ型糖尿病、癌癥、免疫功能紊亂等[2,4,7-8]，如PTEN基因突變可以導(dǎo)致腦癌、胸癌和前列腺癌等癌癥的發(fā)生[9]。PTP1B可以負(fù)調(diào)控胰島素信號(hào)通路，有望作為治療Ⅱ型糖尿病、胰島素功能受阻和肥胖癥的有效分子靶標(biāo)[10]。因此，PTPs成為了當(dāng)前藥物研究的熱點(diǎn)靶標(biāo)之一。

PTPs普遍存在于動(dòng)物、微生物和病毒中。在哺乳動(dòng)物中，PTPs因其重要的功能引起了廣泛的關(guān)注，然而昆蟲PTPs的研究相對(duì)關(guān)注度則較低。1998年，Takagi等首次發(fā)現(xiàn)苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(，) 編碼的PTP不僅具有去磷酸酶活性，還具有RNA加帽酶活性[11]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)病毒編碼的PTP在病毒侵染昆蟲細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用。例如一個(gè)來自煙草夜蛾幼蟲體內(nèi)寄生物布拉卡病毒的PTP可能通過破壞宿主前胸腺組織中關(guān)鍵蛋白磷酸化平衡，從而影響了宿主的前胸腺功能[12]；側(cè)溝繭蜂的布拉卡病毒入侵宿主后，其編碼的PTP-H2和PTP-H3抑制了宿主免疫細(xì)胞的吞噬作用[13]，PTP-H2還可以誘導(dǎo)宿主部分免疫應(yīng)答相關(guān)細(xì)胞的凋亡，從而導(dǎo)致宿主免疫應(yīng)答沉默[14]；在甜菜夜蛾的血細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)菜蛾絨繭蜂布拉卡病毒的PTP，發(fā)現(xiàn)其可以抑制宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答[15]。2005年，Kamita等發(fā)現(xiàn)家蠶NPV (BmNPV) 編碼的PTP可以增強(qiáng)被病毒感染的家蠶運(yùn)動(dòng)行為，敲除該基因后病毒在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)明顯下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)家蠶細(xì)胞中存在一個(gè)與BmNPV編碼的PTP同源的PTP (BmPTP-h)，將基因插入到BmNPV病毒中，可以部分恢復(fù)病毒感染導(dǎo)致的家蠶運(yùn)動(dòng)行為增強(qiáng)，推測(cè)BmNPV的PTP可能起源于其宿主家蠶，然后被選擇性地保存于家蠶基因組中，從而有利于病毒的侵染和傳播[16]。2016年，本實(shí)驗(yàn)室Wang等發(fā)現(xiàn)BmNPV病毒感染家蠶誘導(dǎo)了BmPTP-h在家蠶中的表達(dá)，通過RNAi和過表達(dá)證實(shí)了BmPTP-h可以促進(jìn)BmNPV病毒在家蠶體內(nèi)的復(fù)制[17]。

BmPTP-h在BmNPV病毒侵染家蠶的過程中發(fā)揮著重要作用，然而我們目前對(duì)BmPTP-h的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)知之甚少。本文從家蠶中腸組織克隆獲得了基因，并將其構(gòu)建到原核表達(dá)載體pSKB2進(jìn)行表達(dá)，利用鎳親和層析的方法純化獲得了重組BmPTP-h蛋白。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步分析了BmPTP-h的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，為深入理解其結(jié)構(gòu)和調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

實(shí)驗(yàn)所用家蠶品種為大造，由西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室家蠶基因資源庫(kù)提供。5齡3天家蠶中腸組織cDNA由本實(shí)驗(yàn)室劉莉娜提供。原核表達(dá)載體pSKB2來自美國(guó)西南醫(yī)學(xué)中心張學(xué)武教授實(shí)驗(yàn)室。pSKB2是基于pET-28a(+) 載體改造而來，將pET-28a(+) 中thrombin酶切位點(diǎn)替換為prescission酶切位點(diǎn)，其他保持不變。感受態(tài)細(xì)胞1-T1和BL21 (DE3) 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。HiFiDNA聚合酶購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司，內(nèi)切酶HⅠ和dⅢ購(gòu)自New England Biolabs，T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司。其他分子生物學(xué)試劑盒和試劑等購(gòu)自生工生物工程 (上海) 股份有限公司。

1.2 序列和結(jié)構(gòu)分析

借助家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)SilkDB (http://silkdb. org) 和PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/) 分析家蠶基因在家蠶基因組中的結(jié)構(gòu)、mRNA組成和編碼序列，利用Protparam工具 (http://web.expasy.org/protparam/) 分析BmPTP-h氨基酸組成、蛋白分子量、等電點(diǎn)和氨基酸疏水性，利用SMART (http://smart. embl-heidelberg.de/) 預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)域，通過PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) 預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)[18]。將BmPTP-h氨基酸序列提交BLAST進(jìn)行氨基酸同源序列比對(duì)分析，然后利用Mega構(gòu)建進(jìn)化樹比較不同物種的PTP之間的相似性[19]。

1.3 重組表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)基因的編碼序列，利用Primer Premier設(shè)計(jì)引物，正、反向引物分別為5′-CGATGCCTAAACTTCCCGAT-3′和5′-CCCTTAACGATACCTTCTTCTAGTTG-3′，其中下劃線分別表示HⅠ和d Ⅲ的酶切位點(diǎn)。以5齡3天家蠶中腸組織cDNA為模板[20]，通過PCR擴(kuò)增獲得基因，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，將獲得的DNA片段切膠，通過試劑盒純化回收，將pSKB2載體與目的DNA片段分別利用HⅠ和d Ⅲ進(jìn)行雙酶切，再利用T4 DNA連接酶將二者連接構(gòu)建重組載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化1-T1，并利用菌落PCR、雙酶切和基因測(cè)序?qū)χ亟M載體進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4 蛋白表達(dá)

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室之前的方案[6,21-23]，對(duì)BmPTP-h重組蛋白進(jìn)行表達(dá)純化。首先將測(cè)序驗(yàn)證后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) 細(xì)胞，選擇單菌落在37 ℃過夜培養(yǎng)，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)至600約0.6–1.0，加入0.1 mmol/L IPTG在25 ℃下培養(yǎng)20 h誘導(dǎo)BmPTP-h表達(dá)，然后4 ℃、12 000 r/min離心20 min收集細(xì)胞，加入緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol/L氯化鈉，10%甘油) 懸浮細(xì)胞，冰浴超聲破碎，然后于4 ℃下 12 000 r/min離心20 min，分別收集細(xì)胞破碎后的上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.5 蛋白純化

在25 ℃下大量誘導(dǎo)重組BmPTP-h蛋白表達(dá)，收集細(xì)胞，冰浴超聲破碎，然后離心收集細(xì)胞破碎后的上清，過濾后在4 ℃下利用Ni-NTA親和層析純化。利用包含不同咪唑濃度的緩沖液分別洗脫，收集洗脫液，進(jìn)行SDS-PAGE分析，然后選擇較純的BmPTP-h蛋白組分濃縮，利用HiPrep 26/10脫鹽柱除去咪唑，收集脫鹽后的蛋白溶液，濃縮后于–80 ℃凍存。

1.6 凝膠過濾分析

將純化的蛋白在4 ℃以12 000 r/min離心20 min，然后取上清0.5 mL載入Superdex 20010/300 GL凝膠層析柱進(jìn)行凝膠過濾分析，流速0.5 mL/min，收集相應(yīng)蛋白組分，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.7 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

將純化的BmPTP-h蛋白通過超濾濃縮離心管置換到磷酸緩沖液PBS中，然后利用圓二色光譜儀MOS-500分析BmPTP-h蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。測(cè)試溫度設(shè)定為25 ℃，波譜掃描范圍為190–250 nm，比色皿光程為1 cm，蛋白濃度為0.1 mg/mL，掃描速度為240 nm/min。

為分析溫度對(duì)BmPTP-h蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，從5 ℃逐漸升高溫度到80 ℃，記錄BmPTP-h蛋白在不同溫度下的圓二色光譜。以222 nm處的橢圓度絕對(duì)值|222|代表BmPTP-h蛋白的α螺旋結(jié)構(gòu)含量，然后對(duì)溫度作圖，分析溫度對(duì)BmPTP-h蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 BmPTP-h基因克隆與分析

以5齡3天家蠶中腸組織cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度約為639 bp的序列。將獲得的DNA片段與pSKB2載體分別雙酶切，然后連接，轉(zhuǎn)化1-T1細(xì)胞，分別利用菌落PCR (圖1A) 和雙酶切對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證，最后通過基因測(cè)序確認(rèn)克隆構(gòu)建成功。

基因 (GenBank登錄號(hào)692515) 全長(zhǎng)63 506 bp，由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成 (圖1B)。mRNA全長(zhǎng)1 203 bp，其中5′末端包含一段長(zhǎng)170 bp的非翻譯區(qū)序列 (5′-UTR)，3′末端包含一段長(zhǎng)373 bp的非翻譯區(qū)序列 (3′-UTR) 和一段由20個(gè)A組成的polyA加尾信號(hào)，中間為長(zhǎng)639 bp的編碼區(qū)序列 (圖1C)。

2.2 BmPTP-h蛋白序列和結(jié)構(gòu)分析

BmPTP-h蛋白包含212個(gè)氨基酸殘基，分子量為24.58 kDa，等電點(diǎn)為9.68。BmPTP-h蛋白中大多數(shù)氨基酸為親水性氨基酸，其總體親水性(Grand average of hydropathicity，GRAVY)平均值為–0.640 (圖2A)。SMART分析發(fā)現(xiàn)BmPTP-h蛋白主要由1個(gè)典型的雙特異性磷酸酶 (Dual specificity phosphatases，DSP) 結(jié)構(gòu)域 (40–173位氨基酸) 組成，C末端200–212位氨基酸殘基為一段低復(fù)雜度區(qū)域 (Low complexity region) (圖2B)。PubMed分析表明BmPTP-h屬于蛋白酪氨酸磷酸酶超家族一員，其中第46–156位氨基酸殘基組成了決定其酶學(xué)活性的催化結(jié)構(gòu)域 (Protein tyrosine phosphatase catalytic domain，PTPc) (圖2C)。二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示BmPTP-h蛋白由3個(gè)顯著部分組成，其中N末端由兩段長(zhǎng)長(zhǎng)的柔性無規(guī)則結(jié)構(gòu)包裹一段短的β片層結(jié)構(gòu)組成，C末端由一段長(zhǎng)長(zhǎng)的柔性無規(guī)則結(jié)構(gòu)組成，中間是由多段α螺旋結(jié)構(gòu)包裹一些短的β片層結(jié)構(gòu)組成 (圖2D–E)。

圖1 BmPTP-h基因克隆和分析(A：瓊脂糖凝膠分析菌落PCR產(chǎn)物；B：BmPTP-h基因在基因組中的序列分析；C：BmPTP-h基因mRNA結(jié)構(gòu)示意圖)

圖2 BmPTP-h蛋白序列和結(jié)構(gòu)分析(A：氨基酸疏水性分析；B：結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；C：保守結(jié)構(gòu)域分析；D：預(yù)測(cè)BmPTP-h蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；E：預(yù)測(cè)BmPTP-h蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu))

2.3 BmPTP-h蛋白同源序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)生分析

以BmPTP-h氨基酸序列為模板進(jìn)行BLAST分析，選取與BmPTP-h序列高度相似的PTP序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果如圖3A所示。從圖中可以看出，PTP包含兩部分相對(duì)高度保守的區(qū)域：N末端區(qū)域(殘基1–30，N30) 和靠近C末端的區(qū)域(殘基118–165，C48)，其中N30與PTP催化功能結(jié)構(gòu)域 (殘基46–156) 沒有關(guān)系，C48與PTP催化功能結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)。其實(shí)，PTP催化功能結(jié)構(gòu)域在不同物種中相對(duì)保守，其中C48高度保守，表明C48可能對(duì)PTP發(fā)揮催化功能具有至關(guān)重要的作用。

選取30種與BmPTP-h序列同源的物種的PTP進(jìn)行多序列比對(duì)分析，然后以此為基礎(chǔ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹 (圖3B)。結(jié)果顯示，BmPTP-h與同為鱗翅目昆蟲的棉鈴蟲PTP序列相似度最高，二者聚為一支。除此之外，BmPTP-h還與多種昆蟲NPV編碼的PTP序列高度相似，暗示了昆蟲與NPV的PTP序列可能有著共同的起源和相似的功能。

圖3 BmPTP-h與其他同源PTP蛋白的多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)生分析(A：多序列比對(duì)；B系統(tǒng)發(fā)生分析)

2.4 BmPTP-h蛋白表達(dá)純化

將克隆的基因與pSKB2載體連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體，如圖4A所示。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，將重組載體轉(zhuǎn)化BL21 (DE3) 細(xì)胞，在16 ℃、25 ℃和37 ℃下，分別加入0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)重組蛋白BmPTP-h的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在16 ℃和37 ℃下，BmPTP-h在細(xì)胞裂解后上清中的表達(dá)量不如25 ℃下的表達(dá)量高，因此選擇在25 ℃下加入0.1 mmol/L IPTG大量誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。圖4B顯示了BmPTP-h在BL21 (DE3) 細(xì)胞中在25 ℃下的表達(dá)情況。收集細(xì)胞，在4 ℃下通過Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白，分別利用包含50–500 mmol/L咪唑的緩沖溶液洗脫目的蛋白。SDS-PAGE結(jié)果顯示，含有250和500 mmol/L咪唑的緩沖溶液洗脫下來的目的蛋白純度超過了95% (圖4C，泳道7和8)。收集泳道7和8所對(duì)應(yīng)的蛋白洗脫組分，脫鹽后濃縮，于–80 ℃凍存。

圖4 BmPTP-h表達(dá)純化(A：BmPTP-h重組表達(dá)載體構(gòu)建示意圖；B：BmPTP-h在25 ℃下的表達(dá)分析；C：Ni-NTA親和層析純化BmPTP-h)

2.5 BmPTP-h蛋白溶液狀態(tài)分析

將純化的BmPTP-h蛋白流經(jīng)凝膠過濾層析柱，分析其在溶液中的折疊狀態(tài)，結(jié)果如圖5A所示。凝膠過濾圖譜顯示了兩個(gè)峰，SDS-PAGE分析表明第1個(gè)和第2個(gè)峰代表的都是重組BmPTP-h蛋白 (圖5B)。根據(jù)凝膠過濾層析柱手冊(cè)和圖5A中這2個(gè)峰的洗脫位置，可以推斷出第1個(gè)峰代表的是BmPTP-h的聚集形式，第2個(gè)峰代表的是BmPTP-h的單體形式，分子量約為30 kDa，表明重組表達(dá)的BmPTP-h在溶液中部分形成了聚集體，部分以單體形式存在。比較兩個(gè)峰的面積可以發(fā)現(xiàn)，BmPTP-h單體形式所占的比例大于其聚集體形式的比例。

2.6 BmPTP-h二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用圓二色光譜分析BmPTP-h蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖6A所示。圓二色光譜圖顯示，在約208 nm和222 nm處有兩個(gè)明顯的負(fù)峰，這是α螺旋結(jié)構(gòu)代表性的圓二色光譜峰形，表明純化的重組BmPTP-h蛋白含有α螺旋結(jié)構(gòu)。如果將BmPTP-h的圓二色光譜看作一定百分比含量的α螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲構(gòu)象的圓二色光譜的線性疊加，利用軟件可以計(jì)算出BmPTP-h中α螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲構(gòu)象的百分比含量分別為24%、6%和70%。因此，BmPTP-h中大多數(shù)氨基酸殘基形成了無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，其次為α螺旋結(jié)構(gòu)，只有極少數(shù)氨基酸殘基形成了β-折疊結(jié)構(gòu)。

圖5 BmPTP-h溶液狀態(tài)分析(A：凝膠過濾層析分析. 1和2分別表示紫外吸收峰的位置. B：SDS-PAGE分析. M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1和2分別表示圖A中對(duì)應(yīng)吸收峰的蛋白樣品)

圖6 BmPTP-h二級(jí)結(jié)構(gòu)及其熱穩(wěn)定性分析(A：圓二色光譜分析BmPTP-h二級(jí)結(jié)構(gòu)；B：圓二色光譜分析溫度對(duì)BmPTP-h α螺旋結(jié)構(gòu)的影響)

圓二色光譜中222 nm處的橢圓度絕對(duì)值(|222|)通?？梢杂脕泶淼鞍字笑谅菪龢?gòu)象的含量。以222值對(duì)溫度的變化作圖，從而研究BmPTP-h中α螺旋結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖6B所示。從圖中可以看出，隨著溫度的升高，222絕對(duì)值從24逐漸下降到10，表明在溫度的作用下，BmPTP-h蛋白的α螺旋結(jié)構(gòu)逐漸去折疊解螺旋，從而導(dǎo)致α螺旋結(jié)構(gòu)的含量逐漸下降。

3 討論

蛋白酪氨酸磷酸化與去磷酸化反應(yīng)在調(diào)控生命活動(dòng)的過程中發(fā)揮著極其重要的作用。PTP通過特異性地去磷酸化反應(yīng)參與對(duì)生命活動(dòng)的調(diào)控[4-7]。過去的研究表明，BmPTP-h參與了病毒入侵宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答過程[16-17]，但是這一過程的具體機(jī)制并不清楚。本文從家蠶中腸組織克隆了基因，表達(dá)純化了BmPTP-h蛋白，分析了其溶液狀態(tài)和結(jié)構(gòu)，為理解BmPTP-h的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能提供了基礎(chǔ)。

序列分析顯示，BmPTP-h蛋白等電點(diǎn)高達(dá)9.68。BmPTP-h的N末端和C末端富含堿性的精氨酸 (R) 和賴氨酸 (K) 殘基，二者對(duì)其等電點(diǎn)具有較大貢獻(xiàn)。除此之外，C末端還包含多個(gè)酸性的天冬氨酸 (D) 和谷氨酸 (E) 殘基，以及數(shù)個(gè)極性氨基酸殘基絲氨酸 (S)、蘇氨酸 (T) 和酪氨酸 (Y)。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析表明，BmPTP-h的N末端和C末端形成了無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，這些無規(guī)則結(jié)構(gòu)中的帶電荷氨基酸殘基和極性氨基酸殘基暴露于溶液中，彼此之間可能會(huì)發(fā)生相互作用，從而影響到蛋白質(zhì)的表達(dá)和蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。本文研究發(fā)現(xiàn)，BmPTP-h在25 ℃下表達(dá)獲得的可溶性蛋白含量較高。凝膠過濾分析顯示純化的蛋白部分形成了聚集體，表明BmPTP-h蛋白分子之間容易發(fā)生相互作用，影響蛋白的表達(dá)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，這與之前序列和結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果一致。

圓二色光譜分析表明BmPTP-h中α螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲構(gòu)象的百分比含量分別為24%、6%和70%。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，BmPTP-h蛋白α螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲構(gòu)象的百分比含量分別為25%、8%和67%。理論預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值比較一致，表明預(yù)測(cè)的BmPTP-h二級(jí)結(jié)構(gòu)具有較高的可信度。典型β-折疊構(gòu)象的圓二色光譜在215–220 nm之間會(huì)出現(xiàn)一個(gè)明顯的負(fù)峰。然而我們并沒有在BmPTP-h的圓二色光譜中發(fā)現(xiàn)該峰的存在，這可能是因?yàn)棣?折疊構(gòu)象在BmPTP-h中所占比例較低。無規(guī)則卷曲構(gòu)象的圓二色光譜在220 nm附近會(huì)出現(xiàn)一個(gè)小而寬的正峰。在α螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)象都存在的情況下，圓二色光譜通常會(huì)顯示出α螺旋構(gòu)象的特征譜峰。比較而言，BmPTP-h的圓二色光譜中α螺旋構(gòu)象的特征峰更加明顯，因此我們選擇了α螺旋構(gòu)象特征峰之一的222絕對(duì)值來反映溫度對(duì)BmPTP-h蛋白中α螺旋結(jié)構(gòu)的影響。

二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明BmPTP-h蛋白含有大量的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)BmPTP-h的N末端和C末端形成了無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。在溫度的作用下，BmPTP-h蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)含量逐漸減少，這可能是因?yàn)锽mPTP-h中N末端和C末端暴露的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)在溫度的影響下，誘導(dǎo)了與其相鄰的α螺旋結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)生去折疊從而解螺旋，暗示了這些無規(guī)則結(jié)構(gòu)可能對(duì)BmPTP-h結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有重要影響。本實(shí)驗(yàn)室劉春利用基因芯片在家蠶后部絲腺中鑒定到一個(gè)特異表達(dá)的堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，將其命名為Bmsage。序列分析顯示，Bmsage的N末端和C末端由富含帶電荷氨基酸和極性氨基酸殘基組成，形成了無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，中間部分為螺旋-環(huán)-螺旋組成的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這樣的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與BmPTP-h較為相似。Bmsage在大腸桿菌中難以形成可溶性表達(dá)，在溶液中結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易形成聚集體[24]。這些性質(zhì)與BmPTP-h的性質(zhì)比較類似，可能與Bmsage的N末端和C末端無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)相關(guān)。因此，去除BmPTP-h中N末端和C末端的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，可能會(huì)有助于BmPTP-h在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，并增加其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，但并不清楚這些結(jié)構(gòu)對(duì)BmPTP-h的酶學(xué)活性和生物學(xué)功能是否會(huì)產(chǎn)生其他未知的影響，這是將來值得探究的研究?jī)?nèi)容。

Kamita等推斷BmNPV的PTP起源于BmPTP-h，認(rèn)為BmPTP-h參與了BmNPV病毒在宿主細(xì)胞中的復(fù)制[16]。氨基酸同源比對(duì)分析顯示，BmPTP-h與多種昆蟲NPV的PTP序列具有高度相似性，與BmNPV的PTP序列也具有較高相似性，暗示了這些PTPs可能具有共同的起源，并且發(fā)揮著相似的功能。關(guān)于昆蟲PTPs與病毒PTPs的起源與功能等，仍然需要有更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來揭示二者之間的關(guān)系。因此，研究BmPTP-h的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)于揭示昆蟲與病毒的互作和協(xié)同進(jìn)化具有重要的研究意義和科學(xué)價(jià)值。

凝膠過濾層析分析表明，BmPTP-h在溶液中可以形成單體。圓二色光譜分析顯示純化的BmPTP-h包含有24%的α螺旋結(jié)構(gòu)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果比較一致。這些結(jié)果表明通過原核細(xì)胞表達(dá)純化的BmPTP-h可以折疊形成一定的空間構(gòu)象。結(jié)構(gòu)域分析顯示，BmPTP-h包含有典型的PTP催化結(jié)構(gòu)域，可能具有蛋白酪氨酸磷酸酶催化活性。本實(shí)驗(yàn)室薛仁舉從家蠶大造克隆了基因。表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)基因從蟻蠶到蛾期都有表達(dá)，在家蠶所有組織中都表達(dá)，在5齡3天脂肪體中表達(dá)量最高。序列和結(jié)構(gòu)分析表明，BmPTP-h屬于雙特異性蛋白酪氨酸磷酸酶亞家族。系統(tǒng)發(fā)生分析表明BmPTP-h與昆蟲病毒PTP同源性較高，提示BmPTP-h可能與昆蟲病毒PTP具有類似的功能[25]，這些研究與我們的分析結(jié)果比較一致。他們構(gòu)建了原核表達(dá)載體，但沒有純化獲得蛋白，而是通過真核細(xì)胞表達(dá)獲得了具有活性的BmPTP-h蛋白[17]。我們利用Wang等[6]建立的測(cè)活方法都沒有檢測(cè)到BmPTP-h的酶學(xué)活性，這可能是因?yàn)樵思?xì)胞表達(dá)的BmPTP-h缺乏真核細(xì)胞表達(dá)的蛋白翻譯后修飾，這些修飾可能對(duì)酶活至關(guān)重要；或者是原核細(xì)胞表達(dá)的BmPTP-h在溶液中容易聚集而不易檢測(cè)到活性；或者是測(cè)活方法不當(dāng)導(dǎo)致無法檢測(cè)到活性。酶學(xué)活性是一個(gè)酶最基本、最關(guān)鍵的性質(zhì)之一，因此，盡快研究清楚無法檢測(cè)到原核細(xì)胞表達(dá)的BmPTP-h酶學(xué)活性的原因是我們今后的研究工作首先需要解決的問題。

總之，建立快速準(zhǔn)確地分析BmPTP-h酶學(xué)活性的方法，并利用該方法分析BmPTP-h的酶學(xué)性質(zhì)如米氏常數(shù)m、酶促反應(yīng)的最適pH、最適溫度、溫度對(duì)BmPTP-h酶學(xué)活性的影響等，對(duì)于深入研究BmPTP-h的結(jié)構(gòu)和功能尤為關(guān)鍵，這是我們今后需要繼續(xù)努力的方向。盡管真核細(xì)胞可以表達(dá)獲得具有活性的BmPTP-h蛋白[17]，但真核細(xì)胞表達(dá)周期長(zhǎng)，成本高，不利于大規(guī)模表達(dá)純化獲得目的蛋白。本文建立了BmPTP-h蛋白原核表達(dá)純化的方法，為系統(tǒng)深入地研究BmPTP-h蛋白結(jié)構(gòu)及其調(diào)控機(jī)理提供了基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Cloning, expression, purification and structure analysis of protein tyrosine phosphatase of

Huawei He1,2, Yejing Wang1,2, Kai Song1, Jiao Wang2, Shuguang Wei1, Peng Zhao1,and Ping Zhao1

1 State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400715, China2 College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China

Protein tyrosine phosphatase (PTP, EC 3.1.3.48) specifically catalyzes the removal of phosphate groups from phosphorylated tyrosine residues, resulting in protein dephosphorylation, thus regulates life activities such as cell growth, proliferation, differentiation and immunization. Protein tyrosine phosphatase h of(BmPTP-h) is involved in the replication of nucleopolyhedrovirus (NPV) in, but the structure and properties of BmPTP-h are little known so far. In this study, the coding sequence ofgene was cloned from the midgut of, and its genomic structure, mRNA structure, sequence signature, secondary structure and the state in solution were analyzed. Homologous amino acid sequences alignment analysis indicated that BmPTP-h had a high similarity to PTP sequences of numbers of insect NPVs, implying that they may have a common ancestor and similar function. We constructed a prokaryotic expression vector, expressed and obtained the soluble recombinant BmPTP-h inat 25 ℃, and purified BmPTP-h using Ni-NTA affinity chromatography. Gel filtration analysis showed that BmPTP-h was able to form aggregate and monomer in solution. Circular dichroism spectroscopy analysis showed that the recombinant BmPTP-h contained α-helix structure. Increasing temperature resulted in the unfolding of the α-helix structure of BmPTP-h and the decrease of the α-helix structure content of BmPTP-h. These studies provide a basis to better study the structure and regulation mechanism of BmPTP-h.

, protein tyrosine phosphatase, cloning, expression and purification, structure

February 14, 2017;

May 31, 2017

Yejing Wang. Tel: +86-23-68251575; E-mail: yjwang@swu.edu.cn

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31402139, 31572465), State Key Program of National Natural Science of China (No. 31530071), Chongqing Research Program of Basic Research and Frontier Technology (Nos. cstc2015jcyjA00040, cstc2015jcyjBX0035), Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. XDJK2013A019), Start-up Grant from Southwest University (No. SWU112111).

國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos. 31402139, 31572465)，國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No. 31530071)，重慶市基礎(chǔ)科學(xué)與前沿技術(shù)研究專項(xiàng)(Nos. cstc2015jcyjA00040, cstc2015jcyjBX0035)，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(No. XDJK2013A019)，西南大學(xué)博士基金(No. SWU112111) 資助。

2017-09-14

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