金應(yīng)福，韓莉，張莎莎，李世忠，劉偉豐，陶勇

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通過(guò)番茄紅素環(huán)化酶的優(yōu)化構(gòu)建β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌株

金應(yīng)福1,2，韓莉1，張莎莎1,2，李世忠1，劉偉豐1，陶勇1

1 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

金應(yīng)福, 韓莉, 張莎莎, 等. 通過(guò)番茄紅素環(huán)化酶的優(yōu)化構(gòu)建β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌株. 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(11): 1814–1826.Jin YF, Han L, Zhang SS, et al. Construction of high-yield strain by optimizing lycopene cyclase for β-carotene production. Chin J Biotech, 2017, 33(11): 1814–1826.

目標(biāo)產(chǎn)物的合成途徑往往需要對(duì)關(guān)鍵酶的來(lái)源、表達(dá)水平等因素進(jìn)行系統(tǒng)性?xún)?yōu)化才能實(shí)現(xiàn)代謝通量的最大化。β-胡蘿卜素是一類(lèi)具有重要應(yīng)用價(jià)值的萜類(lèi)化合物，其中番茄紅素環(huán)化酶 (Lycopene cyclase，CrtY)是β-胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵酶，能夠催化FAD依賴(lài)的環(huán)化反應(yīng)將番茄紅素轉(zhuǎn)化合成β-胡蘿卜素。本研究通過(guò)對(duì)CrtY的系統(tǒng)優(yōu)化提高β-胡蘿卜素的合成水平，并確定CrtY的表達(dá)對(duì)代謝通路的影響。在大腸桿菌中以番茄紅素合成模塊為基礎(chǔ)，通過(guò)引入番茄紅素環(huán)化酶基因Y構(gòu)建了β-胡蘿卜素合成模塊。并進(jìn)一步利用寡聚接頭介導(dǎo)的DNA組裝方法 (Oligo-linker mediated assembly method，OLMA) 引入一系列不同強(qiáng)度的人工設(shè)計(jì)的核糖體結(jié)合位點(diǎn) (Ribosome-binding site，RBS)，對(duì)CrtY的表達(dá)強(qiáng)度、基因來(lái)源等因素進(jìn)行高通量的優(yōu)化。通過(guò)OLMA文庫(kù)構(gòu)建和平板篩選，獲得了5株高產(chǎn)β-胡蘿卜素的工程菌株。在搖瓶中，5株工程菌株的β-胡蘿卜素產(chǎn)量可達(dá)15.79?18.90 mg/g DCW (Dry cell weight)，比優(yōu)化前提高了65%。進(jìn)一步選取了其中的CP12菌株，在5 L發(fā)酵罐上，利用高密度培養(yǎng)技術(shù)驗(yàn)證工程菌株合成β-胡蘿卜素的能力。最終β-胡蘿卜素產(chǎn)量可達(dá)1.9 g/L。RBS強(qiáng)度分析及代謝中間體分析表明，適當(dāng)?shù)亟档虲rtY表達(dá)強(qiáng)度能夠有利于β-胡蘿卜素模塊相關(guān)基因之間協(xié)同發(fā)揮作用。以上結(jié)果為β-胡蘿卜素合成途徑的優(yōu)化規(guī)律提供了理論指導(dǎo)。

番茄紅素環(huán)化酶 (CrtY)，大腸桿菌，β-胡蘿卜素，寡聚接頭介導(dǎo)的DNA組裝 (OLMA)，代謝工程

β-胡蘿卜素是自然界中一種重要的天然色素，屬于萜類(lèi)脂溶性化合物。β-胡蘿卜素具有很強(qiáng)的抗氧化活性，能夠發(fā)揮多種重要的生理功能，其中包括體內(nèi)維生素A的前體物質(zhì)、預(yù)防腫瘤、延緩衰老、促進(jìn)免疫功能[1-4]。在食品、醫(yī)藥、保健品、化妝品、飼料等多個(gè)領(lǐng)域，β-胡蘿卜素均具有重要的應(yīng)用價(jià)值和廣泛的市場(chǎng)前景[5-6]。生產(chǎn)β-胡蘿卜素的手段主要包括天然提取法、化學(xué)合成法、生物合成法。其中天然提取法通過(guò)從胡蘿卜等植物中提取獲得β-胡蘿卜素，由于產(chǎn)率低、受季節(jié)影響等原因，無(wú)法滿足市場(chǎng)需求?；瘜W(xué)合成法雖然產(chǎn)量大、成本低，但具有毒化學(xué)物質(zhì)殘留等缺陷。相比而言，以微生物發(fā)酵為基礎(chǔ)的生物合成法，易大規(guī)模生產(chǎn)，具有天然、安全等特點(diǎn)，是最具有發(fā)展前景的生產(chǎn)手段。

目前在微生物發(fā)酵法生產(chǎn)β-胡蘿卜素的相關(guān)研究中，通過(guò)代謝工程手段改造β-胡蘿卜素合成途徑，從而提高β-胡蘿卜素的生產(chǎn)水平一直是重要研究熱點(diǎn)之一。其中大腸桿菌因其易于培養(yǎng)和大規(guī)模發(fā)酵，同時(shí)具有完善的遺傳改造手段，成為代謝工程合成β-胡蘿卜素的最主要宿主菌株。與所有萜類(lèi)化合物一樣，β-胡蘿卜素的生物合成途徑依賴(lài)兩種五碳前體——異戊烯焦磷酸 (Isopentenyl pyrophosphate，IPP) 和二甲基烯丙基焦磷酸 (Dimethyl allyl pyrophosphate，DMAPP)。IPP與DMAPP通過(guò)類(lèi)胡蘿卜素 (Carotenoids) 合成基因簇編碼蛋白的催化作用，經(jīng)多步縮合反應(yīng)生成β-胡蘿卜素。在這一過(guò)程中，GGPP合成酶CrtE (Geranylgeranyl pyrophosphate synthase)、八氫番茄紅素合成酶CrtB (Phytoene synthase)、八氫番茄紅素脫氫酶CrtI (Phytoene desaturase)能夠首先催化合成β-胡蘿卜素的前體番茄紅素。番茄紅素進(jìn)一步在番茄紅素環(huán)化酶CrtY的作用下產(chǎn)生β-胡蘿卜素。

目前，國(guó)內(nèi)外β-胡蘿卜素合成途徑的改造在提高IPP及DMAPP前體供應(yīng)方面開(kāi)展了大量工作[7-10]。自然界中IPP和DMAPP主要有兩條生物合成途徑：以乙酰CoA為前體的甲羥戊酸途徑 (MVA途徑) 和以丙酮酸及3磷酸甘油醛為前體的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑 (MEP途徑)。在大腸桿菌中構(gòu)建異源MVA途徑的工作以Keasling JD為代表[11-13]。Keasling JD等在大腸桿菌中引入了釀酒酵母的MVA途徑基因，并將MVA途徑分解成上游模塊及下游模塊分別進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)過(guò)HMGR等關(guān)鍵靶點(diǎn)的基因替換與改造等手段，解除了HMG-CoA等中間體積累，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中利用MVA途徑高水平合成紫穗槐等萜類(lèi)產(chǎn)物。大腸桿菌中MEP途徑的改造則以Stephanopoulos G為代表[14-15]。Stephanopoulos G等通過(guò)代謝流分析、隨機(jī)改造等辦法，驗(yàn)證了敲除A、E、F等對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)量的提高。此外不同研究組通過(guò)改造、等靶點(diǎn)重構(gòu)中央代謝途徑，或AB、AB和B的過(guò)表達(dá)，均能改善MEP途徑前體供應(yīng)，從而有效提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量[16-17]。

相對(duì)前體供應(yīng)途徑改造而言，國(guó)內(nèi)外對(duì)類(lèi)胡蘿卜素合成基因簇的優(yōu)化工作還非常薄弱。大多數(shù)代謝工程合成β-胡蘿卜素的工作中，直接采用了泛菌屬等少數(shù)微生物來(lái)源的基因簇合成β-胡蘿卜素。本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，通過(guò)挖掘不同來(lái)源的E、B和I基因，并利用不同強(qiáng)度的RBS對(duì)基因的表達(dá)水平同時(shí)進(jìn)行調(diào)控，從而顯著提高了番茄紅素的合成水平[18]。以上結(jié)果表明，蛋白表達(dá)的精細(xì)調(diào)控對(duì)類(lèi)胡蘿卜素合成基因簇功能優(yōu)化具有重要作用。在代謝工程傳統(tǒng)蛋白表達(dá)調(diào)控改造中，通常采用隨機(jī)突變或理性設(shè)計(jì)的辦法構(gòu)建不同強(qiáng)度的調(diào)控元件。但隨機(jī)突變的調(diào)控元件強(qiáng)度無(wú)法控制；而理性設(shè)計(jì)的調(diào)控元件無(wú)法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的設(shè)計(jì)與構(gòu)建，缺乏同時(shí)、高通量對(duì)多種因素進(jìn)行優(yōu)化的手段，極大影響了途徑和模塊優(yōu)化的效率。本研究以先期優(yōu)化的番茄紅素合成模塊 (EBI) 為基礎(chǔ)，通過(guò)引入番茄紅素環(huán)化酶基因 (Y) 構(gòu)建β-胡蘿卜素合成模塊 (圖1)，利用高通量的寡聚接頭介導(dǎo)的DNA組裝方法(Oligo-linker mediated assembly method，OLMA)，從大規(guī)模RBS序列設(shè)計(jì)、改變基因來(lái)源等多個(gè)方面對(duì)Y的表達(dá)進(jìn)行微調(diào)控，實(shí)現(xiàn)對(duì)β-胡蘿卜素合成模塊的高通量?jī)?yōu)化，并闡明Y表達(dá)水平對(duì)模塊和代謝途徑中其他基因功能以及目標(biāo)產(chǎn)物的影響。寡聚接頭介導(dǎo)的DNA組裝方法是一種將小片段調(diào)控序列引入在寡聚接頭的DNA組裝文庫(kù)構(gòu)建方法，可同時(shí)調(diào)節(jié)大于50 bp和小于50 bp的影響因素[18]。該方法的獨(dú)特性在于寡聚接頭 (小于50 bp因素) 既可以被用作介導(dǎo)組裝的“橋梁”，也可以被設(shè)計(jì)啟動(dòng)子、RBS等調(diào)控元件。由于寡聚接頭易于合成，從而可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的元件設(shè)計(jì)和組裝。并且該方法可以同時(shí)對(duì)基因來(lái)源、位置等因素 (大于50 bp因素) 進(jìn)行調(diào)控。通過(guò)將小于50 bp的影響因素被設(shè)計(jì)在化學(xué)合成的寡聚接頭中，而大于 50 bp的影響因素則通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)載體引入，通過(guò)IIS型限制性?xún)?nèi)切酶獲得相應(yīng)的互補(bǔ)片段進(jìn)行一步組裝，大大提高了文庫(kù)的構(gòu)建效率和豐度。本研究將有助于闡明β-胡蘿卜素合成模塊表達(dá)的規(guī)律，為進(jìn)一步提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量及其在工業(yè)中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

圖1 β-胡蘿卜素合成模塊的構(gòu)建

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

表達(dá)宿主菌BW25113由本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆宿主菌Trans1-T1購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他所有菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。

1.1.2 儀器與試劑

紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，UV2500，日本島津公司 (Shimadzu)；凝膠成像系統(tǒng)，Bio-pro 200E，美國(guó)西蒙公司 (SIM)；電轉(zhuǎn)化儀，Micro-pulser，美國(guó)伯樂(lè)公司 (Bio-Rad)；PCR儀，Mastercycler ProS，德國(guó)安本德公司 (Eppendorf)；微孔板恒溫振蕩器，MB100-4A，杭州州奧盛儀器有限公司；酶標(biāo)儀，Synergy MX/SMATC，美國(guó)伯騰儀器公司 (BioTek)；5 L發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；高效液相色譜 (HPLC)，Agilent 1220，美國(guó)安捷倫公司 (Agilent)。

胰蛋白胨、酵母粉購(gòu)自O(shè)xoid公司；β-胡蘿卜素、番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Thermo Scientific公司； FastPfu DNA聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Gibson克隆試劑盒、各種限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、磷酸化酶購(gòu)自NEB (北京) 公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega (北京) 有限公司；其他常規(guī)生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基與溶液

LB (Luria-Bertani) 培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，1% NaCl，其中LB固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂粉。

ZYM自誘導(dǎo)培養(yǎng)基：100 mL培養(yǎng)基中含酵母粉0.5 g，蛋白胨1 g，甘油0.5 g，葡萄糖0.05 g，阿拉伯糖0.2 g，Na2SO40.07 g，NH4Cl 0.27 g，MgSO40.024 g，KH2PO40.34 g，Na2HPO40.9 g，0.1 mL微量元素，pH 7.0[20]。

M9培養(yǎng)基：100 mL培養(yǎng)基中含終濃度 2 mmol/L MgSO4，0.1 mmol/L CaCl2，20 mL 5×M9鹽溶液 (200 mL溶液中含Na2PO4·7H2O 12.8 g，KH2PO43.0 g，NaCl 0.5 g，NH4Cl 1.0 g)，pH 7.0。

抗生素：培養(yǎng)基中根據(jù)菌株添加抗生素，不同抗生素的終濃度為：氯霉素17 μg/mL，卡那霉素50 μg/mL，鏈霉素50 μg/mL，四環(huán)素50 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 分子生物學(xué)構(gòu)建

各種分子克隆反應(yīng)按照所用酶、試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，所用引物見(jiàn)表2。其中Y基因的PCR擴(kuò)增以相應(yīng)菌株的基因組為模板，細(xì)菌基因組采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取。PCR條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。啟動(dòng)子、終止子片段分別以相應(yīng)質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。帶有啟動(dòng)子、終止子的CrtY表達(dá)質(zhì)?；蚴荏w質(zhì)粒的構(gòu)建采用多片段Gibson組裝方法，按照文獻(xiàn)[21]方法進(jìn)行。

表1 菌株與質(zhì)粒

表2 文中所用引物

1.2.2 OLMA文庫(kù)構(gòu)建

OLMA文庫(kù)構(gòu)建按照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行。其中寡聚接頭是通過(guò)將互補(bǔ)的兩條單鏈oligo退火形成雙鏈oligo。反應(yīng)條件為終濃度各為10 μmol/L的單鏈oligo在90 ℃溫育5 min，然后以每秒0.1 ℃的速度降至4 ℃。退火后將雙鏈DNA稀釋至終濃度100 nmol/L，將不同強(qiáng)度的寡聚接頭等比例混合，利用磷酸化酶進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，獲得最終的寡聚接頭片段。

1.2.3 重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及生物轉(zhuǎn)化

挑取單克隆在新鮮的相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待600值達(dá)到0.6?0.8，以1%的接種量轉(zhuǎn)接到含有相應(yīng)抗性的ZYM自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)12?14 h，誘導(dǎo)MVA途徑基因的表達(dá)。4 ℃、4 000 r/min條件下離心，棄去培養(yǎng)基，然后用M9培養(yǎng)基和1% 葡萄糖的轉(zhuǎn)化液重懸菌體至10/L，37 ℃、220 r/min搖床進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化20 h。測(cè)定轉(zhuǎn)化后β-胡蘿卜素產(chǎn)量水平。

1.2.4 β-胡蘿卜素、番茄紅素的測(cè)定

對(duì)生物轉(zhuǎn)化后的菌體細(xì)胞測(cè)定菌體600，取1×108CFU細(xì)胞的培養(yǎng)液離心收集菌體，雙蒸水洗滌菌體1次，于菌體中加入1 mL丙酮，冰上萃取2 h后，13 000 r/min離心10 min，吸取上清液。β-胡蘿卜素的測(cè)定用分光光度計(jì)掃描340?550 nm的吸收光譜，并讀取454 nm處的特征吸收峰值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算β-胡蘿卜素的產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3次重復(fù)。用β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。β-胡蘿卜素、番茄紅素產(chǎn)物的定性分析通過(guò)HLPC方法測(cè)定上述樣品，使用Phenomenex Luna 5u C8(2) 100A色譜柱，流動(dòng)相為水+丙酮 (體積比為20:80)，以β-胡蘿卜素、番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定。

1.2.5 OLMA文庫(kù)的篩選

平板篩選，37 ℃培養(yǎng)12 h后將黃色克隆挑取于含有200 μL LB培養(yǎng)基的96孔深孔板中，于37 ℃、800 r/min的微孔板恒溫振蕩器中培養(yǎng)10 h后按1:40的比例接種于200 μL含誘導(dǎo)物的ZYM自誘導(dǎo)培養(yǎng)基的96孔深孔板中，于37 ℃、800 r/min的振蕩器中恒溫培養(yǎng)16 h。將誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液稀釋20倍，用酶標(biāo)儀測(cè)定600。同時(shí)取20 μL的培養(yǎng)液，4 000 r/min離心10 min收集菌體，加入400mL乙醇-丙酮混合液 (體積比4:1) 冰上萃取2 h。萃取完成后12 000 r/min離心10 min，吸取200mL上清液于96孔微孔板中 (平底)，用酶標(biāo)儀讀取454 nm處的吸光值，計(jì)算吸光值與菌體600的比值，利用該值評(píng)判相應(yīng)克隆的β-胡蘿卜素合成能力。

1.2.6 中間產(chǎn)物分析

對(duì)生物轉(zhuǎn)化后的菌體細(xì)胞，測(cè)定菌體600，取5×109CFU細(xì)胞的培養(yǎng)液離心收集菌體，用–80 ℃預(yù)冷的甲醇重懸，超聲后離心收取上清，經(jīng)冷凍干燥制備樣品。樣品委托清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)測(cè)試中心UPLC-MS/MS分析檢測(cè)。

1.2.7 5 L發(fā)酵水平生產(chǎn)β-胡蘿卜素

挑取單克隆在相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，5%的接種量接入到裝液量為100 mL的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5 h，再接入裝液量為2 L的5 L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基為 (/L)：20 g葡萄糖，5 g酵母粉，0.6 g MgSO4，9 g KH2PO4，4 g (NH4)2HPO4，及微量元素。生長(zhǎng)溫度控制在37 ℃，pH控制在7.0，空氣流速為4 L/min，發(fā)酵過(guò)程中DO控制在30%，發(fā)酵過(guò)程中恒速補(bǔ)料。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)β-胡蘿卜素大腸桿菌菌株的構(gòu)建

根據(jù)NCBI序列設(shè)計(jì)引物PagY-F/PagY-R和EryY-F/EryY-R，分別以提取的成團(tuán)泛菌CGMCC1.2244和赤桿菌sp.Nan35的基因組總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得Pag-Y和Ery-Y基因片段。分別用tac-F/tac-R和tL3-F/tL3-R引物，以質(zhì)粒pSC7s為模板，分別擴(kuò)增出tac啟動(dòng)子片段tac和終止子片段tL3。采用Ⅰ單酶切本實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的含有番茄紅素合成基因簇EBI的載體pLY116，回收載體大片段后，采用Gibson方法分別與tac/Pag-Y/tL3或tac/Ery-Y/tL3進(jìn)行多片段連接，篩選陽(yáng)性克隆，得到具有完整合成途徑的β-胡蘿卜素合成模塊質(zhì)粒pCP07和pCP08。將pCP07及pCP08質(zhì)粒和分別含有MVA上游途徑基因的pYESKs質(zhì)粒和MVA下游途徑基因的pSKPMIc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)，獲得具有合成β-胡蘿卜素能力的工程菌株CP07及CP08 (圖2)。

為了驗(yàn)證CP07和CP08的功能，將CP07和CP08接種于ZYM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)β-胡蘿卜素合成途徑蛋白，收集菌體后重懸于20 mL含有1%葡萄糖的M9培養(yǎng)基中，搖瓶生物轉(zhuǎn)化20 h。收集菌體后用丙酮萃取產(chǎn)物，檢測(cè)β-胡蘿卜素含量，以無(wú)β-胡蘿卜素合成模塊質(zhì)粒的菌株CP00為對(duì)照。結(jié)果表明 (圖3，7C)，經(jīng)轉(zhuǎn)化后CP07和CP08的色素產(chǎn)物均為單一的β-胡蘿卜素，β-胡蘿卜素合成水平分別達(dá)到約8.79 mg/g DCW及8.08 mg/g DCW。

圖2 在番茄紅素合成模塊的基礎(chǔ)上引入CrtY及OLMA文庫(kù)

圖3 CP07和CP08的β-胡蘿卜素合成水平

2.2 寡聚接頭介導(dǎo)DNA組裝 (OLMA) 文庫(kù)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

為了實(shí)現(xiàn)β-胡蘿卜素合同途徑中基因表達(dá)的平衡，并進(jìn)一步提高β-胡蘿卜素的合成水平，采用寡聚接頭介導(dǎo)DNA組裝 (OLMA) 文庫(kù)構(gòu)建的策略對(duì)Y的表達(dá)水平進(jìn)行微調(diào)控，OLMA文庫(kù)的設(shè)計(jì)和構(gòu)建過(guò)程如圖2和圖4所示。

選擇Pag-Y及Ery-Y兩種Y基因以增加文庫(kù)的多樣性。分別采用引物HPagY-F/ HPagY-R和HEryY-F/HEryY-R，以質(zhì)粒pCP07和pCP08為模板，擴(kuò)增HPag-Y和HEry-Y基因片段。采用Ⅰ和Ⅰ雙酶切標(biāo)準(zhǔn)載體pHD，以Gibson方法分別與HPag-Y和HEry-Y連接，篩選陽(yáng)性克隆，獲得用于OLMA文庫(kù)構(gòu)建的Pag-Y及Ery-Y基因供體質(zhì)粒pHD07和pHD08。其中Y基因序列兩端分別帶有Ⅰ酶切位點(diǎn)，上下游酶切粘性末端分別為T(mén)TAA和GTAT。

進(jìn)一步對(duì)于構(gòu)建文庫(kù)所用的RBS序列優(yōu)化。根據(jù)文獻(xiàn)中的設(shè)計(jì)原則，以Pag-Y及Ery-Y的序列為基礎(chǔ)，利用RBS Calculator軟件計(jì)算出不同強(qiáng)度的RBS[18]，并選取了50個(gè)可覆蓋較大強(qiáng)度范圍 (~100?50 000) 的RBS，將RBS核心序列、及上下游的粘性末端CAGG與TTAA設(shè)計(jì)在寡聚接頭序列中。并制備磷酸化的寡聚接頭。

圖4 利用OLMA優(yōu)化β-胡蘿卜素合成模塊的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

以pLY116為基礎(chǔ)構(gòu)建受體質(zhì)粒。利用引物ccd-F/ccd-R，以質(zhì)粒pOSIP為模板，擴(kuò)增編碼毒蛋白的B基因片段，采用Gibson方法與tac/tL3及經(jīng)Ⅰ單酶切的pLY116進(jìn)行多片段連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DB3.1中，篩選陽(yáng)性克隆，獲得受體質(zhì)粒pLY116-TC。該質(zhì)粒由于含有B毒蛋白無(wú)法在DB3.1以外的正常大腸桿菌細(xì)胞中生長(zhǎng)，從而消除文庫(kù)構(gòu)建中的假陽(yáng)性。其中B基因序列兩端分別帶有Ⅰ酶切位點(diǎn)，上下游酶切粘性末端分別為CAGG和GTAT。

將受體質(zhì)粒pLY116-TC、兩種供體質(zhì)粒及雙鏈寡聚接頭在含有Ⅰ和T4 DNA連接酶的反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)一步組裝，電轉(zhuǎn)化進(jìn)入T1感受態(tài)細(xì)胞。提取混合質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)入含有pYESKs質(zhì)粒和pSKPMIc質(zhì)粒的BW25113感受態(tài)細(xì)胞中，用于下一步篩選。

2.3 OLMA文庫(kù)的篩選和鑒定

以CP07及CP08為對(duì)照，隨機(jī)挑取33個(gè)克隆于96孔深孔板中，經(jīng)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)、ZYM培養(yǎng)基自誘導(dǎo)后，乙醇-丙酮檢萃取，并用酶標(biāo)儀檢測(cè)單位菌體的β-胡蘿卜素含量。結(jié)果如圖5A所示，β-胡蘿卜素產(chǎn)量為0.47?1.04。根據(jù)相對(duì)產(chǎn)量數(shù)值分布看，所構(gòu)建的OLMA文庫(kù)可以引起正態(tài)分布的β-胡蘿卜素產(chǎn)量變化，說(shuō)明該手段能夠有效地調(diào)控Y的活性從而得到不同的β-胡蘿卜素產(chǎn)量 (圖5B，C)。

圖5 利用96孔板對(duì)OLMA文庫(kù)的篩選和鑒定

挑選克隆中有5株β-胡蘿卜素產(chǎn)量明顯超過(guò)CP07及CP08。選擇相應(yīng)的克隆命名為CP09–CP13，并進(jìn)行復(fù)篩。將上述菌株在含有ZYM培養(yǎng)基的搖瓶中誘導(dǎo)后進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，檢測(cè)β-胡蘿卜素產(chǎn)量。結(jié)果表明，5株菌的β-胡蘿卜素產(chǎn)量分別為16.89、16.89、15.79、18.89和16.96 mg/g DCW，其中最高的CP12的β-胡蘿卜素產(chǎn)量比對(duì)照菌株CP07和CP08分別提高了65%和72% (圖6B)。同時(shí)對(duì)ZYM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)后菌體量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)CP09-CP13在誘導(dǎo)后的菌體量均比CP07和CP08有明顯提高 (圖6A)。

為了進(jìn)一步確定微調(diào)控對(duì)Y表達(dá)的作用，對(duì)上述菌株進(jìn)一步對(duì)序列進(jìn)行分析。5株菌的RBS序列及相對(duì)強(qiáng)度見(jiàn)表3。

為了進(jìn)一步研究Y表達(dá)調(diào)控對(duì)代謝途徑的影響，選取CP12的生物轉(zhuǎn)化后菌體進(jìn)行中間產(chǎn)物分析，檢測(cè)菌體細(xì)胞中MVA代謝中間產(chǎn)物HMG-CoA (3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A) 以及IPP/DMAPP的含量。結(jié)果表明 (圖7)，與優(yōu)化前菌株CP07相比，CP12的HMG-CoA含量提高約30%，而同時(shí)IPP/DMAPP的含量下降了4倍。采用HPLC檢測(cè)轉(zhuǎn)化后CP12的色素產(chǎn)物類(lèi)型，結(jié)果表明CP12的色素產(chǎn)物與CP07、CP08一致，均只含有β-胡蘿卜素 (圖7C)。

2.4 高產(chǎn)β-胡蘿卜素菌株的發(fā)酵驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證所篩選的高產(chǎn)β-胡蘿卜素菌株的生產(chǎn)能力，選取CP12菌株在5 L發(fā)酵罐水平上進(jìn)行發(fā)酵及β-胡蘿卜素的生產(chǎn) (圖8)。開(kāi)始發(fā)酵后控制菌體生長(zhǎng)至10 h時(shí)，加入20 mL 20%的阿拉伯糖誘導(dǎo)物。15 h時(shí)開(kāi)始檢測(cè)β-胡蘿卜素產(chǎn)物積累。結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵30 h后菌體濃度可達(dá)150/L，同時(shí)β-胡蘿卜素產(chǎn)物積累明顯上升。至發(fā)酵50 h后，菌體濃度可達(dá)200/L。β-胡蘿卜素產(chǎn)量約為1.9 g/L。

圖6 搖瓶中高產(chǎn)菌株的生物量(A) 及β-胡蘿卜素產(chǎn)量(B)

表3 高產(chǎn)菌株的RBS、CrtY信息

圖7 菌株的代謝中間產(chǎn)物分析

圖8 CP12的β-胡蘿卜素發(fā)酵時(shí)間曲線

3 討論

利用代謝工程手段在微生物中改造目標(biāo)產(chǎn)物的合成途徑，通常需要解決多種異源蛋白的同時(shí)表達(dá)問(wèn)題，從而解除途徑中多個(gè)關(guān)鍵性限制瓶頸，提高目標(biāo)產(chǎn)物合成水平。之前的研究表明利用OLMA方法對(duì)番茄紅素合成模塊中的E、B、I協(xié)同表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化能夠顯著提高番茄紅素的合成水平，證明蛋白表達(dá)的精細(xì)控制對(duì)類(lèi)胡蘿卜素合成基因簇具有重要作用[18]。在β-胡蘿卜素合成模塊中，番茄紅素環(huán)化酶是一種需要結(jié)合FAD作為配體的環(huán)化酶[22]，具有典型的跨膜結(jié)構(gòu)域[23]。這一類(lèi)蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)往往具有很大的挑戰(zhàn)性，之前的報(bào)道也證實(shí)番茄紅素環(huán)化酶容易在大腸桿菌中形成不溶性包涵體[22]。本研究嘗試以O(shè)LMA方法為基礎(chǔ)對(duì)番茄紅素環(huán)化酶的活性進(jìn)行高效率的優(yōu)化。結(jié)果表明優(yōu)化后的菌株CP09-CP13的β-胡蘿卜素產(chǎn)量均能提高60%以上。通過(guò)對(duì)高產(chǎn)菌株中RBS強(qiáng)度分析，5株高產(chǎn)菌株中有4株采用了低強(qiáng)度的RBS (預(yù)測(cè)強(qiáng)度為1147–3088)，這一結(jié)果表明降低表達(dá)強(qiáng)度有利于番茄紅素環(huán)化酶的活性。由于Y及β-胡蘿卜素合成模塊其他基因的表達(dá)產(chǎn)物在CP07-CP13的菌株中表達(dá)量少，很難用SDS-PAGE分析 (結(jié)果未列出)，因此進(jìn)一步用代謝中間體的積累分析相關(guān)途徑和模塊的功能。相關(guān)結(jié)果證實(shí)在降低番茄紅素環(huán)化酶表達(dá)強(qiáng)度的工程菌株中，能夠明顯減少I(mǎi)PP/DMAPP的中間體積累，說(shuō)明β-胡蘿卜素合成模塊的活性得到了提高。菌株CP07和CP12中色素產(chǎn)物均僅以β-胡蘿卜素的形式存在，表明Y在兩個(gè)菌株中的表達(dá)量均足夠?qū)⒎鸭t素轉(zhuǎn)化為β-胡蘿卜素。因此可以推測(cè)在菌株CP12中Y優(yōu)化對(duì)β-胡蘿卜素產(chǎn)量的提高可能是由于平衡了Y與EBI之間的表達(dá)，并促進(jìn)了EBI的功能。值得注意的是，菌株CP09- CP13不僅β-胡蘿卜素產(chǎn)量明顯提高，在合成途徑誘導(dǎo)之后菌體生長(zhǎng)也比CP07和CP08明顯提高，生長(zhǎng)提高的原因尚不清楚。文獻(xiàn)報(bào)道證 實(shí)[11-12,24]，MVA途徑的代謝中間體包括HMG-CoA、甲羥戊酸、IPP/DMAPP等均對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有毒性。在本研究中，菌株CP12中的IPP/DMAPP水平比未經(jīng)優(yōu)化的對(duì)照菌株CP07減少了4倍，暗示高產(chǎn)菌株生長(zhǎng)的提高可能是由于代謝途徑暢通后，解除了IPP/DMAPP的生長(zhǎng)抑制引起的。

在微生物代謝工程改造中，只有異源途徑、模塊中不同異源蛋白的表達(dá)處于相對(duì)平衡的狀態(tài)時(shí)，才能使模塊的功能以及模塊間的“適配性”、模塊與宿主細(xì)胞間的“適配性”達(dá)到最優(yōu)狀態(tài)。本研究以β-胡蘿卜素模塊為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)模塊中關(guān)鍵性的番茄紅素環(huán)化酶的優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了異源蛋白表達(dá)的平衡，為高產(chǎn)β-胡蘿卜素菌株的進(jìn)一步優(yōu)化及工業(yè)化應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Construction of high-yield strain by optimizing lycopene cyclase for β-carotene production

YingfuJin1,2, LiHan1, ShashaZhang1,2, ShizhongLi1, WeifengLiu1, and YongTao1

1 Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

To optimize key enzymes, such as to explore the gene resources and to modify the expression level, can maximize metabolic pathways of target products. β-carotene is a terpenoid compound with important application value. Lycopene cyclase (CrtY) is the key enzyme in β-carotene biosynthesis pathway, catalyzing flavin adenine dinucleotide (FAD)-dependent cyclization reaction and β-carotene synthesis from lycopene precursor. We optimized lycopene cyclase (CrtY) to improve the synthesis of β-carotene and determined the effect of CrtY expression on metabolic pathways. Frist, we developed a β-carotene synthesis module by coexpressing the lycopene β-cyclase geneY withEBI module in. Then we simultaneously optimized the ribosome-binding site (RBS) intensity and the species of crtY using oligo-linker mediated DNA assembly method (OLMA). Five strains with high β-carotene production capacity were screened out from the OLMA library. The β-carotene yields of these strains were up to 15.79?18.90 mg/g DCW (Dry cell weight), 65% higher than that of the original strain at shake flask level. The optimal strain CP12 was further identified and evaluated for β-carotene production at 5 L fermentation level. After process optimization, the final β-carotene yield could reach to 1.9 g/L. The results of RBS strength and metabolic intermediate analysis indicated that an appropriate expression level of CrtY could be beneficial for the function of the β-carotene synthesis module. The results of this study provide important insight into the optimization of β-carotene synthesis pathway in metabolic engineering.

lycopene cyclase,, β-carotene, oligo-linker mediated DNA assembly, metabolic engineering

February 14, 2017;

April 24, 2017

Weifeng Liu. Tel: +86-10-64807478; Fax: +86-10-64807419; E-mail: liuwfv@163.com Yong Tao. Tel/Fax: +86-10-64807419; E-mail: taoyong@im.ac.cn

Supported by:Key Research Program of the Chinese Academy of Sciences (No. ZDRW-ZS-2016-3).

中國(guó)科學(xué)院重點(diǎn)部署項(xiàng)目 (No. ZDRW-ZS-2016-3) 資助。