周建華 ，李志雄 ，楊燕燕 ，謝金東 ，俞春英 ，林 瑋 ，劉德強(qiáng) ，王訓(xùn)立

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，福建 福州 350122；2.福建省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，福建 福州 350011）

基于微衛(wèi)星DNA標(biāo)記分析福建獼猴與河南獼猴的遺傳多樣性

周建華1，李志雄2，楊燕燕1，謝金東1，俞春英1，林 瑋1，劉德強(qiáng)1，王訓(xùn)立1

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，福建 福州 350122；2.福建省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，福建 福州 350011）

目的 應(yīng)用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記分析福建獼猴與河南獼猴的遺傳多樣性。 方法 采用14個(gè)微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)對(duì)福建獼猴與河南獼猴遺傳多樣性進(jìn)行分析，經(jīng)基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳等，用POPGENE 1.32等軟件統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果 14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)均存在高度的遺傳多態(tài)性，共檢測(cè)到了等位基因166個(gè)，其觀察等位基因數(shù)（Na）在 5～15個(gè)，平均為10.071 5個(gè)；有效等位基因數(shù)（Ne）為3.604 6～11.878 8；雜合度（H）為 0.735 7～0.932 5；香隆信息指數(shù)（I）為 1.395 7～2.557 8；多態(tài)信息含量（PIC）為 0.675 0～0.909 5。以14個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記為測(cè)度，福建獼猴的Ne、H、I和PIC的平均值均低于河南獼猴。 結(jié)論 本研究有效地分析了福建獼猴與河南獼猴兩群體的遺傳多態(tài)性，為今后建立兩種群遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)方法提供理論依據(jù)。

微衛(wèi)星標(biāo)記；獼猴；遺傳多樣性

獼猴作為一種重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)研究，當(dāng)今，利用珍貴的獼猴自然資源和人工養(yǎng)殖獼猴的規(guī)模正在不斷擴(kuò)大。我國有豐富的獼猴資源，共有6個(gè)獼猴亞種，福建獼猴是其中亞種之一［1］。為了保護(hù)獼猴遺傳多樣性，保護(hù)地方特有獼猴的基因資源，有必要對(duì)不同地域的猴群進(jìn)行遺傳背景調(diào)查，研究比較各地獼猴的遺傳多樣性現(xiàn)狀。微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA），也稱為簡(jiǎn)單序列重復(fù)（simple sequence repeat，SSR），在生物基因組中一般以1～6個(gè)堿基為其核心序列、首尾相連組成串聯(lián)核苷酸重復(fù)序列。由于核心序列重復(fù)數(shù)目的不同，產(chǎn)生了DNA多態(tài)性，是一種理想的分子標(biāo)記，已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建，親緣關(guān)系、遺傳多樣性分析，品種及菌株鑒別等［2-5］。 本研究從福建獼猴（福建亞種）（Macacamulatta littoralis）的原主產(chǎn)地―福建武夷山區(qū)野捕來的野生猴群中和從河南新野某養(yǎng)殖場(chǎng)引進(jìn)的河南獼猴中各隨機(jī)抽取28只，利用14個(gè)微衛(wèi)星DNA標(biāo)記對(duì)該兩猴群進(jìn)行遺傳多樣性分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 福建獼猴（福建亞種）和河南獼猴來源于福建省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所，各28只，普通級(jí)，雌雄各半，年齡8～14歲，體質(zhì)量5～11 Kg，飼養(yǎng)于普通級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室；特許獵捕證（閩）：（獵）字 2008-1 號(hào)，準(zhǔn)運(yùn)證：（豫）動(dòng)運(yùn)字［2009］第 3、4、7號(hào)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（閩）2010-0002號(hào)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SPXK（閩）2010-0005號(hào)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 Wizard?Genomic DNA Purification Kit試劑盒（美國 Promega 公司），Gotaq?Green Master Mix試劑盒 （美國 Promega公司），pBR322 DNA／Msp I標(biāo)記物（TIANGEN 公司，中國）。凝膠成像系統(tǒng)（美國BioRad公司），電泳儀、垂直電泳槽（北京六一儀器廠）和ABIVeriti梯度PCR儀（美國 ABI公司）。

1.3 基因組DNA提取 空腹自上肢靜脈抽取全血2 mL，EDTA抗凝。采用Wizard Genomic DNA Purification Kit試劑盒提取方法提取基因組DNA，詳細(xì)操作步驟見說明書。

1.4 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 自GenBank網(wǎng)站及相關(guān)文獻(xiàn)［6-11］查取具有多態(tài)性高的50個(gè)微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系25μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性 3 min；94℃變性 30 s，40℃～61℃復(fù)性30 s，72℃延伸 60 s，30個(gè)循環(huán)，72℃最終延伸 7min。擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。

1.5 電泳及結(jié)果記錄 50個(gè)微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)中在兩猴群中共有14個(gè)位點(diǎn)都呈特異性擴(kuò)增，每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)都有5個(gè)及以上等位基因，表現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性。14個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定是否在長度范圍之內(nèi)；后經(jīng)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染和凝膠成像系統(tǒng)照相保存。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用BioRad凝膠成像系統(tǒng)對(duì)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖帶進(jìn)行分析，確定其核苷酸條帶分子量大小，以大小不同的擴(kuò)增片段為不同的等位基因按照從小到大的順序分別依次定名為 A、B、C、D、E……。用 POPGENE 1.32 軟件計(jì)算出各基因位點(diǎn)的等位基因頻率（gene frequency）、觀察等位基因數(shù)（observed number of alleles，Na）、有效等位基因數(shù)（effective number of alleles，Ne）、雜合度（heterozygosity，H）、香隆信息指數(shù)（Shannon's information index，I）等指標(biāo)，并根據(jù)Botstein等的公式利用Excel計(jì)算多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè) 對(duì)14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，本文以D21S1246位點(diǎn)的電泳圖譜為例說明，見圖1。

圖1 D21S1246位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

2.2 福建獼猴與河南獼猴14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因頻率分布信息 分析14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在福建獼猴和河南獼猴中的觀察等位基因數(shù)目及其頻率的分布信息，其能反映出個(gè)體間的遺傳概貌情況。14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在兩猴群中均存在高度的遺傳多態(tài)性，共檢測(cè)到了等位基因166個(gè)，觀察等位基因數(shù)（Na）有 5～15個(gè)，平均為10.0715個(gè)。其中，最多的位點(diǎn)是D1S207，福建猴和河南猴分別有15個(gè)和14個(gè)等位基因；最少的位點(diǎn)是D1S548，都有5個(gè)等位基因。見表1。

2.3 福建獼猴與河南獼猴14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的群體遺傳多樣性分析 有效等位基因數(shù)目（Ne）福建猴和河南猴分別為3.733 3～11.614 8和3.604 6～11.878 8，平均7.015 4和7.031 1個(gè)；雜合度（H）福建猴和河南猴分別為0.745 5～0.930 5和0.735 7～0.932 5，平均 0.855 9 和 0.857 7；香隆信息指數(shù)（I）福建猴和河南猴分別為 1.399 8～2.557 8和1.395 7～2.544 5之間，平均2.025 3和2.051 5；多態(tài)信息含量（PIC）福建猴和河南猴分別為 0.686 2～0.907 4和 0.675 0～0.909 5， 平均0.817 4和0.823 3。以上4個(gè)指標(biāo)兩猴群都是D1S207位點(diǎn)最高，D1S548位點(diǎn)最低，并且福建獼猴的Ne、H、I和PIC的平均值均低于河南獼猴。見表2。

3 討 論

群體的遺傳多樣性通常使用多個(gè)基因位點(diǎn)遺傳多樣性參數(shù)的平均值來描述。有效等位基因（Ne），其值為純合度的倒數(shù)。等位基因在群體中分布越均勻，有效等位基因數(shù)越接近所檢測(cè)到的等位基因的絕對(duì)數(shù)，它表明等位基因之間的相互影響情況。香隆信息指數(shù)（I）表示群體內(nèi)多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)多少和頻率分布情況，描述了群體內(nèi)以標(biāo)記為單位的平均離散程度，即多樣性；I值越大則群體的離散性越高，多樣性越豐富。雜合度（H）是群體內(nèi)遺傳變異的量度，其值的高低反映了群體內(nèi)個(gè)體的均勻度，若數(shù)值高，表明遺傳變異大，反之則群體內(nèi)的遺傳變異就小。多態(tài)信息含量（PIC）用以描述微衛(wèi)星位點(diǎn)的變異程度，當(dāng)PIC＞0.5時(shí)，為高度多態(tài)位點(diǎn)。

從表1可以看出，14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，除D1S548外各位點(diǎn)的等位基因數(shù)目和大小，群體間都有一定的差別，大都有各自的特有等位基因；所有位點(diǎn)的等位基因頻率，兩猴群也基本不同，體現(xiàn)出不同的遺傳差異。從表2可以看出，14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，兩猴群的Ne數(shù)目從3.604 6～11.878 8不等，H和I都比較高，PIC值皆大于0.5，說明這14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)具有較高的可信度，均屬于高度多態(tài)性位點(diǎn)，能較好地反映福建獼猴與河南獼猴兩猴群的遺傳多樣性。

從表2也可以看出，福建獼猴的Ne、H、I和PIC的平均值均低于河南獼猴，這種差別可能與地域來源及飼養(yǎng)管理方式有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)福建獼猴來源為野生獼猴，其生活習(xí)性存在著一定程度的近交繁殖［12］。河南獼猴引進(jìn)于新野一家新建的養(yǎng)殖場(chǎng)，其獼猴來源不一，群體的基因流較雜，檢測(cè)到的遺傳多樣性相對(duì)較高。這與季芳等［13］對(duì)海南和廣西獼猴的遺傳多樣性研究的結(jié)果相類似，島嶼型猴群（海南）的遺傳變異低于大陸型猴群（廣西）。福建野生猴群由于自然地域的隔離，基因交流少；而人工養(yǎng)殖，如有嚴(yán)格的飼養(yǎng)繁殖制度和遺傳監(jiān)控，適時(shí)引進(jìn)種猴，隨機(jī)交配，避免近交繁殖，群體的基因交流范圍廣，遺傳多樣性就較豐富。

表1 福建獼猴和河南獼猴14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因頻率信息

表2 福建獼猴和河南獼猴兩群體14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性

本研究利用14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，分析了福建獼猴與河南獼猴兩群體的遺傳多態(tài)性，為今后兩種群制定科學(xué)的繁殖措施，建立完善的遺傳譜系和遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)方法及保護(hù)策略提供理論依據(jù)，對(duì)保護(hù)獼猴這一珍貴的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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R－332

A

1000-338X（2017）05-0030-04

2017－07－03

福建省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究重點(diǎn)項(xiàng)目（2014Y0080）。

周建華（1969—），男，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)研究。

王訓(xùn)立（1964—），男，研究員。 E-mail：wxl@fjtcm.edu.cn