王珊珊 吳昊 李梁

（沈陽工學(xué)院 生命工程學(xué)院，撫順 113122）

花椒揮發(fā)油的提取及其抑菌抗蟲活性測定

王珊珊 吳昊 李梁

（沈陽工學(xué)院 生命工程學(xué)院，撫順 113122）

本實(shí)驗(yàn)研究了不同溶劑對花椒揮發(fā)油的提取效果，進(jìn)行了花椒揮發(fā)油對不同菌種的抑菌實(shí)驗(yàn)，并探究了其對棉鈴蟲幼蟲的拒食性和忌避性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)乙醚作為提取劑時，提取率最高為8.77%；對不同菌種的抑菌效果無明顯差別；乙醚提取的花椒揮發(fā)油對棉鈴蟲幼蟲在拒食率及忌避率上均優(yōu)于其他溶劑所提取的揮發(fā)油，對棉鈴蟲幼蟲有著更好的抑制力。

花椒揮發(fā)油；棉鈴蟲；拒食性；忌避性；抗菌活性

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim），為蕓香科花椒屬落葉灌木或小喬木。原產(chǎn)地為中國，是中國特有的香辛料之一，果皮、種子、枝、葉均可入藥，其藥物功效在《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》中均有記載，并且在《中華人名共和國藥典》（2005版）中記載有“溫中止痛，殺蟲止癢”的功效［1-2］。衛(wèi)生部于2002年確認(rèn)了花椒為藥食兩用的原料。

花椒揮發(fā)油具有高度選擇性，在施藥條件下易于分解，無殘留，無污染，與環(huán)境和諧，對人畜安全，對天敵生物沒有毒性，且多數(shù)對害蟲有引誘、忌避、拒食和生長調(diào)節(jié)等作用［3，4］。花椒揮發(fā)油在抗炎、抑菌殺蟲、抗腫瘤等方面具有較強(qiáng)的藥理活性［5-6］。蔣小龍等［7］發(fā)現(xiàn)，花椒揮發(fā)油對玉米、稻谷等在倉儲過程中出現(xiàn)的害蟲以及儲糧中的曲霉和青霉具有一定的防治效果，因此，花椒在植物性殺蟲劑方面也有廣闊的開發(fā)前景。

棉鈴蟲是棉花蕾鈴期重要鉆蛀性害蟲，其幼蟲主要蛀食蕾、花、鈴，也取食棉花的嫩尖和嫩葉，形成孔洞和缺刻，造成無頭棉，影響棉花的正常發(fā)育［18］，使棉花產(chǎn)量降低，損害農(nóng)民利益。本研究以期得到一種綠色環(huán)保的天然抗蟲劑，從而降低棉鈴蟲幼蟲對棉花的蛀食，減少棉花的蟲害，減少農(nóng)民的損失。為花椒揮發(fā)油的綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 花椒 市售干品四川大紅袍。

1.1.2 菌種及培養(yǎng)基 菌種：大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，酵母菌，黑曲霉，灰曲霉，米曲霉。培養(yǎng)基：細(xì)菌培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；霉菌培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。

1.1.3 主要儀器及試劑 主要儀器有索氏提取器，圓底燒瓶，冷凝管，電熱套，恒溫水浴鍋，電子天平，超凈工作臺，高壓蒸汽滅菌鍋。使用的試劑無水乙醇，甲醇，乙醚，石油醚，無水硫酸鈉均為分析純。

1.1.4 受試?yán)ハx 2-3齡棉鈴蟲幼蟲。

1.2 方法

1.2.1 花椒揮發(fā)油的提取 采用索氏提取法［8］。將粉碎過的花椒粉末過20目篩后，稱取10 g于濾紙筒中，并將其置于安裝好的索氏提取器內(nèi)，在圓底燒瓶內(nèi)分別加入100 mL乙醚、石油醚、甲醇和無水乙醇這4種有機(jī)溶劑，并分別在45℃、65℃、70℃和85℃和各自回流4 h，收集提取液，再分別在34℃、60℃、64℃和78℃的水浴中揮干溶劑至恒重，得到揮發(fā)油。

1.2.2 得率計(jì)算與狀態(tài)觀察

花椒揮發(fā)油提取率=（M-M0）/10

其中，M（g）為揮發(fā)油連同容器重量；M0（g）為干燥容器重量。每次實(shí)驗(yàn)樣品用量20 g。分別從顏色、氣味、狀態(tài)這3個方面對不同溶劑提取得到的揮發(fā)油進(jìn)行感官評定并記錄結(jié)果。

1.2.3 菌懸液的制備 取活化的菌株，向無菌的試管中加人無菌生理鹽水，挑取1-2環(huán)大小適宜的菌群，制成濃度為105-106CFU/ml的菌懸液［9］。

1.2.4 抑菌實(shí)驗(yàn) 采用牛津杯法［10-12］。配置培養(yǎng)基滅菌后倒入已滅菌的培養(yǎng)皿冷卻制成平板，將配置好的菌懸用無菌移液槍吸取200 μL后均勻涂布于培養(yǎng)基表面。將滅菌后的牛津杯置于已涂布有生長期受試菌種菌懸液的平板上，并向牛津杯中分別注入上一步實(shí)驗(yàn)中的4種揮發(fā)油并用相應(yīng)無機(jī)溶劑作對照，分別于溫箱中培養(yǎng)36 h后進(jìn)行抑菌圈直徑的測量，進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，求其平均值，單位mm。

1.2.5 拒食活性測定［13-15］采用小葉碟添加法。挑選生命力較強(qiáng)、大小均一的受試?yán)ハx20條，隔離于錐形瓶中保持其饑餓狀態(tài)5 h后，取出并將其置于潔凈的培養(yǎng)皿中；將采摘的新鮮樹葉裁剪成邊長為1 cm的正方形葉碟，將其浸泡于有機(jī)溶劑稀釋一倍的揮發(fā)油中1-2 s后取出，揮干溶劑后置于放有試蟲的培養(yǎng)皿內(nèi)，對照組將葉碟浸于相應(yīng)有機(jī)溶液中1-2 s，取出后揮干溶劑并按照實(shí)驗(yàn)組操作。分別在6 h、12 h、18 h和24 h后觀察測量拒食面積并計(jì)算拒食率，進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，求其平均值。公式如下：

拒食率（%）=［（對照組取食面積-處理組取食面積）/對照組取食面積］×100%

1.2.6 忌避活性測定［13，16］采用培養(yǎng)皿濾紙涂藥法。裁剪與培養(yǎng)皿直徑一致的圓形濾紙片，對折并在距離中線一毫米處將其剪成兩片類似半圓狀的濾紙片，其中一片用有機(jī)溶劑稀釋過一倍的花椒揮發(fā)油浸泡處理并揮干溶劑；另一片用相應(yīng)有機(jī)溶劑浸泡處理并揮干溶劑進(jìn)行對照，兩片濾紙片在互不接觸的情況下用透明膠固定于培養(yǎng)皿底部，備用。

在培養(yǎng)皿中放入等量試蟲，用濕潤紗布蓋好培養(yǎng)皿，在保證培養(yǎng)皿中氧氣充足的情況下放置觀察，并分別在3 h、6 h、9 h、12 h后觀察試蟲情況、計(jì)算忌避率，進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，求其平均值。公式如下：

忌避率（%）=［（對照蟲數(shù)-處理蟲數(shù)）/對照蟲數(shù)］×100%

2 結(jié)果

2.1 不同溶劑提取花椒揮發(fā)油的得率與狀態(tài)觀察

分別選用4種不同的有機(jī)溶劑，按照1.2.1的方法進(jìn)行提取并按照1.2.2的方法進(jìn)行計(jì)算及狀態(tài)觀察。分別進(jìn)行3次提取，求其平均值，平均提取率如圖1所示。乙醚作為提取劑的提取率最高為8.77%，無水乙醇次之為7.93%，石油醚作為提取劑的提取率最低為5.37%，可見當(dāng)乙醚作為花椒揮發(fā)油的提取劑時，可最大限度將花椒中的揮發(fā)油提取出來。

圖1 四種溶劑對花椒揮發(fā)油提取率的比較

由表1可見，甲醇與乙醇的提取物性狀比較相似，均為深褐色，原因可能為兩種有機(jī)溶劑形狀相似，所提得揮發(fā)油組成成分亦比較相似，而乙醇提取揮發(fā)油成浸膏狀的原因可能為乙醇沸點(diǎn)相對較高，在提取和分離的過程中可能由于高溫而導(dǎo)致?lián)]發(fā)油發(fā)生一定程度的氧化［17］，從而使其性狀發(fā)生改變；乙醚與石油醚提取揮發(fā)油的形狀相似，均為淡色透明液體。石油醚和無水乙醇的提取液在分離溶劑后仍留有輕微溶劑味，可能是提取過程中揮發(fā)油中部分組成成分與溶劑發(fā)生輕微反應(yīng)導(dǎo)致。

表1 不同溶劑提取花椒揮發(fā)油的狀態(tài)觀察

2.2 抑菌活性比較

用牛津杯法，測定了4種不同的有機(jī)溶劑提取花椒揮發(fā)油的抑菌活性，其結(jié)果見表2。各種溶劑提取的花椒揮發(fā)油都對細(xì)菌有著一定的抑制作用，其中，相比較而言，以乙醚的提取液抑制效果最佳且對各類菌均有較明顯抑制效果，而抑制效果相對較差的為乙醇提取的揮發(fā)油。推測為乙醇提取的揮發(fā)油性狀不佳，流動性不好，無法更大范圍的抑制菌種生長。

表2 不同溶劑提取花椒揮發(fā)油的抑菌圈直徑（cm）

2.3 抗蟲活性比較

2.3.1 拒食活性測定 采用小葉碟添加法，測定了4種溶劑提得到的揮發(fā)油對棉鈴蟲幼蟲的拒食活性。其結(jié)果見圖2。

圖2 不同溶劑提取的花椒揮發(fā)油對棉鈴蟲幼蟲的拒食活性測定結(jié)果

由圖2可見，各溶劑提取的揮發(fā)油均對試蟲具有一定的拒食活性，而且效果較為明顯，不過隨著時間的推移，各實(shí)驗(yàn)組的拒食活性均有不同程度的降低，這是由于花椒揮發(fā)油存在揮發(fā)性，隨著時間的增加揮發(fā)油濃度不斷降低，拒食活性也隨之減小。

2.3.2 忌避作用測定 采用培養(yǎng)皿濾紙涂藥法。不同溶劑提取花椒揮發(fā)油對棉鈴蟲的忌避作用結(jié)果見圖3至圖6。棉鈴蟲對乙醚提取揮發(fā)油的忌避性始終較高，但同時會隨著時間的推移有所下降（圖3），其原因推測為隨時間變化揮發(fā)油中的揮發(fā)性物質(zhì)揮發(fā)掉，從而使其對昆蟲的驅(qū)逐性逐漸降低；棉鈴蟲對石油醚提取的花椒揮發(fā)油一開始忌避性很高，但隨著時間的不斷增加，忌避性下滑很快直至不明顯（圖4），由此可見石油醚提取出的花椒精油極易揮發(fā)，并可推測出其提取的揮發(fā)油成分不全；棉鈴蟲對甲醇提取的花椒揮發(fā)油忌避性始終適中，并無明顯下滑（圖5），由此可得出結(jié)論：甲醇提取的揮發(fā)油不易揮發(fā)，可較長久時間保存；棉鈴蟲對無水乙醇提取的花椒揮發(fā)油忌避性普遍偏低（圖6），結(jié)合揮發(fā)油性狀可得出結(jié)論，無水乙醇提取的揮發(fā)油可能隨乙醇的揮發(fā)加速花椒揮發(fā)油的揮發(fā)，使忌避率迅速下降。

綜上所述，石油醚提取花椒揮發(fā)油忌避率波動范圍最大，無水乙醇提取花椒精油其次，乙醚提取花椒精油忌避率波動范圍最小且忌避率普遍偏高。

圖3 棉鈴蟲對乙醚提取花椒揮發(fā)油忌避率測定結(jié)果

圖4 棉鈴蟲對石油醚提取花椒揮發(fā)油忌避率測定結(jié)果

圖5 棉鈴蟲對甲醇提取花椒揮發(fā)油忌避率測定結(jié)果

圖6 棉鈴蟲對無水乙醇提取花椒揮發(fā)油忌避率測定結(jié)果

3 討論

植物次生代謝物中對昆蟲有拒食性和忌避性的物質(zhì)主要有萜烯類、生物堿和酚類等物質(zhì)［19］。昆蟲的取食行為分為遠(yuǎn)距離定位，近距離降落和接觸3個主要階段，是一個由多種化學(xué)感受器參與，受神經(jīng)系統(tǒng)控制完成的生理行為。根據(jù)功能分類，化學(xué)感受器分為嗅覺感受器和味覺感受器，嗅覺感受器遠(yuǎn)距離感知植物中揮發(fā)性的次生代謝物質(zhì)，味覺感受器在與植物接觸后感知植物中的營養(yǎng)成分和取食抑制劑的種類和數(shù)量［20］。棉鈴蟲幼蟲的化學(xué)感受器對印楝素、肌醇和黑芥子苷敏感［21］?；瘜W(xué)物質(zhì)對昆蟲的拒食作用可能通過影響昆蟲口器上的感受器對營養(yǎng)物質(zhì)的識別和刺激效應(yīng)，進(jìn)而引起昆蟲厭食［22］。

在抗蟲-拒食性和抗蟲-忌避性試驗(yàn)中均出現(xiàn)受試?yán)ハx意外死亡的情況，除卻遭受意外碾壓，同族相殘等明確死亡方式外，還有少量試蟲死因不明。查閱資料后發(fā)現(xiàn)花椒揮發(fā)油對黏蟲幼蟲和楊毒蛾幼蟲均有一定程度的觸殺作用，及對小菜蛾幼蟲、黏蟲幼蟲、楊毒蛾幼蟲均具有極強(qiáng)的熏蒸毒殺作用［23］。在試驗(yàn)過程中，雖已將對照組及實(shí)驗(yàn)組的濾紙片進(jìn)行溶劑揮干處理，但并無法確定是否有少量殘留，更無法確定該殘留對蟲體是否有類似“熏蒸性”的影響。因此并不排除花椒揮發(fā)油對其產(chǎn)生“觸殺性”及“熏蒸性”的可能，但由于這一現(xiàn)象并不常見且出現(xiàn)頻率不穩(wěn)定，因此并未將“觸殺性”及“熏蒸性”列入實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。

4 結(jié)論

本研究通過對不同有機(jī)溶劑索氏提取花椒揮發(fā)油得率比較試驗(yàn)可知，乙醚提取花椒揮發(fā)油得率最高且性狀良好；不同溶劑提取花椒揮發(fā)油對不同菌種抑菌效果試驗(yàn)可知，4種溶劑提取的花椒揮發(fā)油對不同菌種抑菌效果無明顯差別，對細(xì)菌普遍具有抑制性，但對霉菌的抑制性并不明顯；不同有機(jī)溶劑提取花椒揮發(fā)油對棉鈴蟲抗蟲性試驗(yàn)可知，乙醚提取花椒精油首先在拒食率上高于其他溶劑所提取的揮發(fā)油，又在忌避率上穩(wěn)定且微高于其他溶劑所提取的揮發(fā)油，由此可得出結(jié)論，乙醚提取花椒揮發(fā)油對棉鈴蟲幼蟲有著更好的抑制力。

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Extraction of Volatile Oil from Zanthoxylum and Determination of Its Antibacterial Activity and Insect Resistance

WANG Shan-shan WU Hao LI Liang
（Shenyang Institute of Technology，School of Life Engineering，F(xiàn)ushun 113122）

Extraction effects of volatile oil from Zanthoxylum by different solvents were studied，then the experiment of its antibacterial activity was conducted，and the antifeeding and repellency of cotton bollworms to volatile oil from Zanthoxylum were investigated. The results of the experiment were as follows，the best extraction rate was 8.77% while using ether as solvent，and there was no significant difference on antibacterial activity between strains. The extracted volatile oil from Zanthoxylum by ether showed priority on antifeeding and repellency of cotton bollworm larvae than those by other solvents，thus it should have better inhibitory effects on the larvae.

volatile oil；cotton bollworms；antifeeding；repellency；antibacterial activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0412

2017-05-22

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（201713201000003）

王珊珊，女，碩士研究生，研究方向：生化與微生物發(fā)酵；E-mail：shuihugai@163.com

（責(zé)任編輯 朱琳峰）