騰橋 夏麗潔 張富春

（新疆大學生命科學與技術(shù)學院 生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

人GPC3基因的原核表達及多克隆抗體的制備

騰橋 夏麗潔 張富春

（新疆大學生命科學與技術(shù)學院 生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

旨在構(gòu)建人磷酯酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican3，GPC3）原核蛋白，制備小鼠GPC3抗血清。擴增人 GPC3基因cDNA的完整的開放閱讀框，克隆至pET28a原核表達載體，在大腸桿菌BL21表達菌株中誘導表達磷酯酰肌醇蛋白聚糖融合蛋白，利用親和層析的方法純化his-融合蛋白，通過SDS-PAGE電泳檢測蛋白的純度，并測定蛋白含量；免疫Balb/c小鼠，制備抗血清。結(jié)果顯示，成功制備了小鼠抗GPC3多克隆抗體，抗體滴度為1∶51 200，經(jīng)Western blot檢查特異性良好。原核表達的重組人GPC3蛋白具有較好的免疫原性。

磷酯酰肌醇蛋白聚糖3；融合蛋白；多克隆抗體

肝癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，嚴重威脅著人類的健康［1］。在中國，由于存在較為嚴重的乙型肝炎病毒（HBV）感染等致癌風險因素，肝癌的發(fā)病率和死亡率態(tài)勢尤為嚴峻。肝癌的治療手段主要包括肝移植、腫瘤切除及非切除性局部療法如肝動脈化療栓塞等［2］。由于肝癌特別是原發(fā)性肝癌（HCC）早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移以及治療后易復發(fā)［3］，因此，尋找一個可以準確判斷預后的指標和有效的肝癌治療靶點具有重要意義。

早期診斷和治療是提高原發(fā)性肝細胞癌療效的關(guān)鍵因素之一。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican 3，GPC3）作為硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族成員，該基因編碼580個氨基酸能夠產(chǎn)生大約70 kD的核心蛋白。核心蛋白由兩個亞基構(gòu)成，弗林蛋白在358-359氨基酸位置將該核心蛋白裂解為N端和C端兩個亞基，N末端存在著一種分泌型信號蛋白，C末端通過與糖基磷脂酰肌醇（GPI）共價結(jié)合，從而使GPC3核心蛋白錨定于肝細胞膜上，且C端最末50個氨基酸決定兩條硫酸乙酰肝素鏈（HS）插入點的位置，使該鏈靠近細胞膜［4］。GPC3在胚胎及重要組織例如肝臟，肺，腎臟中大量表達，然而，在成人器官中的表達量較低。此外，有研究顯示GPC3原發(fā)性肝癌中特異性高表達，而在成人正常肝組織低表達或不表達。從而提示GPC3對肝癌診斷具有顯著的靈敏性和特異性，可作為識別原發(fā)性肝癌組織（HCC）特異性腫瘤標志物［5-7］。

本實驗以克隆的人肝癌磷脂酰肌醇蛋白聚糖3全長基因（GPC3）為目的基因，重組后的表達載體轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）。經(jīng)IPTG誘導表達獲得GPC3蛋白，并使用Western blot技術(shù)鑒定蛋白表達。利用親和層析的方法純化his-融合蛋白并免疫Balb/c小鼠，制備抗血清，旨為后續(xù)進一步實驗研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株和實驗動物 E.coli DH5α感受態(tài)細胞、E.coli BL21表達菌株、質(zhì)粒pET28a質(zhì)粒，均由新疆大學生物資源基因工程重點實驗室提供；Balb/c小鼠購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.2 試劑 限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I 與Xho I、T4 DNA連接酶、Ex-Taq酶、蛋白預染Marker、DL5000 DNA Marker均購自TaKaRa大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒均購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司產(chǎn)品；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、IPTG均購自北京索萊寶有限公司產(chǎn)品。PVDF膜為Minipore公司產(chǎn)品。His標記的鼠源一抗，HRP標記的山羊抗鼠二抗IgG均為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 重組載體的構(gòu)建 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的人GPC3 cDNA的核苷酸序列設計擴增GPC3基因全長去信號肽的一對引物，上下游分別帶有EcoR I和Xho I酶切位點。引物序列：Primer1：5'-CGGAA TTCATGCAGCCCCCGCCGCCGCCGCCGGACGCCAC CTG-3' Primer2：5'-CCCTCGAGTCAGTGCACCAGG AAGAAGAAGCAC-3'上下游引物劃線處分別為限制性內(nèi)切酶EcoR I 和Xho I。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。PCR反應總體系為50 μL：緩沖液 5 μL；模板 DNA 1 μL；dNTP 2.5 μL ；上下游引物各0.5 μL；Ex-Taq酶0.5 μL；補滅菌水至50 μL。PCR 反應條件：95℃ 3 min；95℃ 20 s，55℃30 s，72℃ 2 min，共30個循環(huán)；72℃ 5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR片段大小，利用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將回收的目的片段與pET28a質(zhì)粒于37℃過夜雙酶切后，通過切膠方法回收經(jīng)雙酶切的目的片段和pET28a載體，然后利用T4 DNA連接酶于16℃過夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞。挑取形態(tài)大小較好的單克隆先進行菌液PCR鑒定，再進行雙酶切鑒定，最后將重組質(zhì)粒送去上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序鑒定，鑒定正確后轉(zhuǎn)化入E.coli BL21 表達菌株。

1.2.2 重組蛋白的表達檢測與純化 選取經(jīng)鑒定正確的重組菌株過夜培養(yǎng)，以1∶200轉(zhuǎn)接入新鮮的LB培養(yǎng)基中，待OD600值約為0.6時，加入終濃度0.5 mmol/L IPTG，37℃誘導培養(yǎng)6 h，收集菌體用PBS重懸并放置-80℃反復凍融，然后用超聲儀器破碎細胞，利用親和層析的方法純化his-融合蛋白，通過SDS-PAGE電泳檢測蛋白的純度，并用過BCA法測定蛋白含量。

1.2.3 GPC3融合蛋白免疫小鼠 選取6周齡的Balb/c小鼠，100 μg/只免疫GPC3蛋白，第一次免疫采用弗氏完全佐劑，純化后的GPC3融合蛋白與弗氏完全佐劑1∶1混勻，充分乳化后，于小鼠背部皮下多點注射。2周后加強免疫，劑量同上，用不完全弗氏佐劑充分乳化后，于小鼠腹部皮下多點注射，二免10 d后進行第3次加強免疫，三免10 d后Balb/c小鼠眼眶采血，將血樣于37℃孵育20 min，然后放入4℃冰箱中過夜可見有血清析出，3 500 r/min 離心10 min后取上清，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 鼠抗人GPC3多克隆抗體制備 （1）采用ELISA法檢測GPC3抗血清效價，簡要步驟：先將純化的GPC3蛋白作為抗原稀釋至4 μg/mL于對應的96孔板中加入100 μL，然后每孔加入包被液體100 μL，4℃過夜包被，使GPC3蛋白附著于板中。次日將包被液棄去，加入200 μL的5%脫脂奶粉封閉，37℃孵育2 h，PBST洗滌后，每孔加入100 μL倍比稀釋的不同滴度一抗溶液（每個滴度選用3個重復），37℃孵育120 min，PBST洗滌后，每孔加入100 μL二抗（1∶1 500稀釋），37℃孵育60 min，PBST充分洗滌后加入顯色液50 μL，37℃避光顯色10 min；加入終止液50 μL，于酶標儀450 nm處讀數(shù)。（2）Western Blot分析抗體特異性，將純化的GPC3蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳跑膠，轉(zhuǎn)膜，封閉后，用鼠抗人GPC3多克隆抗體（1∶500稀釋）作為一抗，羊抗鼠 IgG-HRP（1∶5 000 稀釋）做為二抗進行孵育，經(jīng)TBST充分洗滌后，用DAB顯色液避光顯色即可。

2 結(jié)果

2.1 GPC3基因PCR擴增鑒定

以人肝癌細胞HepG2總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用GPC3基因特異性去信號肽引物進行PCR擴增后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定（圖1），可見1 749 bp預計目的條帶。

圖1 PCR擴增cDNA瓊脂糖凝膠電泳鑒定

2.2 重組載體的構(gòu)建

先將PCR擴增的去信號肽的目的基因產(chǎn)物進行回收，然后將回收產(chǎn)物與pET28a質(zhì)粒經(jīng)EcoR I與Xho I雙酶切后，利用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞。隨機挑取單克隆先進行菌液PCR鑒定（圖2），再進行雙酶切鑒定，均獲得約1 749 bp片段（圖3），與目的基因大小一致；測序結(jié)果顯示與預測基因序列相同，證明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。

圖2 重組質(zhì)粒菌液PCR鑒定

圖3 重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I 與Xho I雙酶切鑒定

2.3 重組蛋白的表達及純化

為驗證重組蛋白的表達情況，重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導后進行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果（圖4）顯示獲得70 kD的蛋白條帶，包含GPC3蛋白65 kD及pET28a質(zhì)粒自帶的5 kD His標簽蛋白，重組蛋白表達與預期大小一致。并利用Western blot進一步驗證表達（圖5）。

圖4 重組質(zhì)粒SDS-PAGE鑒定

圖5 重組質(zhì)粒Western Blot鑒定

2.4 GPC3重組蛋白的純化

對重組表達菌株進行誘導培養(yǎng)，收集菌體并用PBS重懸菌體，將重懸的菌液進行超聲破碎，離心收集上清，利用親和層析的原理，通過Ni柱對GPC3重組蛋白進行純化。用SDS-PAGE電泳對純化后的重組蛋白分子進行檢測（圖6）。

圖6 融合蛋白純化SDS-PAGE鑒定

2.5 ELISA檢測鼠抗人GPC3多抗效價

免疫前鼠血清與抗原無免疫反應，第3次加強免疫后已有明顯的免疫反應，抗體效價可達1∶51 200（圖 7）。

圖7 GPC3多克隆抗體的效價檢測

2.6 Western Blot檢測鼠抗人GPC3多抗特異性

以純化的GPC3蛋白作為抗原，將鼠抗人GPC3多克隆抗體作為一抗進行檢測（圖8），表明免疫前血清與抗原無反應，免疫后血清與抗原能夠進行特異性的結(jié)合。

圖8 Western Blot檢測多抗特異性

3 討論

肝細胞癌（HCC）是一種常見的消化系統(tǒng)疾病，其已成為第3種最常見的惡性腫瘤，僅次于胃癌和食道癌［8］。與其它惡性腫瘤一樣，肝癌的發(fā)病機制尚不清楚。然而，人們普遍認為肝癌與肝硬化、病毒性肝炎以及化學致癌物密切相關(guān)。雖然已在肝癌治療，包括微創(chuàng)外科、介入栓塞化療和肝臟移植等進步很大，但是仍然不能夠防止腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移。研究表明肝細胞癌早期診斷治療可大大提高肝癌的治療率和延長患者的生命［9］。

肝癌診斷中廣泛使用的生物標志物是血清α甲胎蛋白（AFP）。甲胎蛋白（AFP）在人類胚胎發(fā)育過程中大量表達，出生后停止表達。然而，當肝細胞發(fā)生癌變時，AFP的合成被恢復。已有研究表明AFP在肝癌患者血清中占70%-80%。因此，檢測肝癌患者血清中的AFP水平被廣泛認可［10］。然而，仍有30%-40%的肝癌患者呈陰性且血清中AFP濃度較低［11］。此外，由于其靈敏度相對較低，因此它的臨床價值具有局限性。其他的生物標志物，如脫-γ-羧基凝血酶原（DCP）和晶狀扁豆凝集素活性部分AFP（AFP-L3），均可作為AFP補充物，但其敏感性有限。此外，成像技術(shù)的結(jié)果易受檢驗方法以及成像設備質(zhì)量等因素影響。因此，未來如何有效的鑒定和診斷HCC生物標志物至關(guān)重要［12］。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）是磷酸乙酰肝素糖蛋白家族中的一員，它參與調(diào)控細胞增殖、調(diào)控、粘附和遷移等過程［13］。目前，GPC3被用作診斷肝細胞癌特異性標志物，通過計算機斷層顯像儀發(fā)射正電子探針來檢測肝癌和正常肝組織中肝良性病變［14］。GPC3靶向治療，包括GC33、HN3和YP7可能為治療肝癌提供新的治療手段［14］。GPC3主要通過激活Wnt等信號通路促進肝癌生長和轉(zhuǎn)移。此外，GPC3在人類肝細胞癌的高表達已被證明，通過cDNA微陣列技術(shù)檢測肝細胞癌患者血清發(fā)現(xiàn)，含有40%的GPC3蛋白，而在肝硬化患者、慢性肝炎患者和健康獻血者的血清中不存在該蛋白。因此，GPC3被提議作為一個有用的腫瘤標志物用于肝癌的診斷［15］。

使用Trizol法提取人肝癌細胞HepG2總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA并以其為模板擴增出來所需要的目的片段。本實驗借助較為常用的大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，該表達系統(tǒng)是發(fā)展最早也是最成熟，它能將外源基因借助原核乳糖操縱子結(jié)構(gòu)原理誘導蛋白表達。構(gòu)建原核表達載體，理論上最好使得融合蛋白在胞內(nèi)表達，由于通過網(wǎng)絡在線工具SignalP-4.1對GPC3所編碼的氨基酸序列進行信號肽預測，該蛋白存在信號肽故設計引物時將信號肽切除。通過基因工程方法將去信號肽目的基因與pET28a進行連接，通過菌液PCR及雙酶切，測序驗證得出成功構(gòu)建原核表達載體，經(jīng)誘導得出融合蛋白在上清和沉淀中都有。雖然GPC3重組蛋白在沉淀中的表達量明顯高于上清中表達量，但是包涵體的純化需要用尿素溶解變性，即使先變性后利用透析復性最后上柱純化，可能會殘留的一些尿素，而尿素對柱料的使用壽命會降低。本實驗純化上清中的目的蛋白不僅降低對柱料損害，而且可以保證蛋白的具有活性。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican 3，GPC3）可作為識別原發(fā)性肝癌組織（HCC）特異性腫瘤標志物，經(jīng)GPC3融合蛋白免疫小鼠獲得的抗血清，通過間接ELISA對3次免疫進行抗血清效價檢測，發(fā)現(xiàn)隨著免疫次數(shù)的增加，小鼠的抗血清效價呈現(xiàn)遞增的趨勢，更好地展現(xiàn)重組GPC3蛋白作為抗原激起了小鼠體內(nèi)免疫應答反應，達到預期實驗效果Western Blot分析表明，制備的鼠抗人GPC3多克隆抗體可特異識別重組GPC3蛋白。此外，獲得的抗GPC3蛋白的多抗具有實驗操作簡單，實驗所需周期短，成本相對較低的優(yōu)勢。

4 結(jié)論

本研究中，將人肝癌細胞HepG2 總RNA反轉(zhuǎn)成的cDNA，通過PCR技術(shù)擴增出目的條帶，并成功構(gòu)建人GPC3融合基因pET28a重組載體，誘導表達了His-GPC3融合蛋白（約70 kD），將其作為免疫原，免疫Balb/c小鼠，成功制備了鼠抗GPC3血清，并對其進行效價檢測，ELISA實驗結(jié)果顯示免疫鼠產(chǎn)生的抗血清效價可達到1∶51 200。經(jīng)Western Blot檢查特異性良好。原核表達的重組人GPC3蛋白具有較好的免疫原性。

［1］Forner A, Llovet J, Bruix J. Hepatocellular carcinoma［J］. Lancet,2012, 379（9822）：1245-1255.

［2］Cao H, Phan H, Yang L. Improved chemotherapy for hepatocellular carcinoma［J］. Anticancer Res, 2012, 32（4）：1379-1386.

［3］Sersté T, Barrau V, Ozenne V, et al. Accuracy and disagreement of computed tomography and magnetic resonance imaging for the diagnosis of small hepatocellular carcinoma and dysplastic nodules：role of biopsy［J］. Hepatology, 2012, 55（3）：800-806.

［4］Haruyama Y, Kataoka H. Glypican-3 is a prognostic factor and an immunotherapeutic target in hepatocellular carcinoma［J］. World J Gastroenterol, 2016, 22（1）：275-283.

［5］Tsuchiya N, Sawada Y, Nakatsura T. Biomarkers for the early diagnosis of hepatocellular carcinoma［J］. World Journal of Gastroenterology, 2015, 21（37）：10573-10583.

［6］Sung YK, Hwang SY, Park MK, et al. Glypican-3 is overexpressed in human hepatocellular carcinoma［J］. Cancer Sci, 2003, 94：259-262.

［7］Hippo Y, Watanabe K, Watanabe A, et al. Identification of soluble NH2-terminal fragment of glypican-3 as a serological marker for early-stage hepatocellular carcinoma［J］. Cancer Res, 2004, 64 ：2418-2423.

［8］Qin ZN, Wang J, Wang Y, et al. Identifcation of a glypican-3-binding peptide for in vivo non-invasive human hepatocellular carcinoma detection［J］. Macromolecular Bioscience, 2017. doi:10.1002/mabi.201600335.

［9］Luo L, Wang YZ, Huang Z, et al. Signifcance of Glypican-3（GPC3）expression in hepatocellular cancer diagnosis［J］. Med Sci Monit,2017, 23：850-855.

［10］Zhang JW, Li Y, Zeng XC, et al. miR-630 overexpression in hepatocellular carcinoma tissues is positively correlated with alphafetoprotein［J］. Med Sci Monit, 2015, 21：667-673.

［11］Cai L, Rao XH, Qi SU, et al. Diagnostic value of Joint Detection of GP73 and AFP-L3 in primary hepatic carcinoma with low concentration of AFP［J］. Journal of International Translational Medicine, 2015, 3：28-32.

［12］Attallah AM, El-Far M, Omran MM, et al. GPC-HCC model：a combination of glybican-3 with other routine parameters improves the diagnostic efficacy in hepatocellular carcinoma［J］. Tumor Biol, 2016, 37：12571-12577.

［13］Kim H, Xu GL, Borczuk AC, et al. The heparan sulfate proteoglycan GPC3 is a potential lung tumor suppressor［J］. American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology, 2003, 29（6）：694-701.

［14］Wu YL, Liu H, Ding HG. GPC3 in hepatocellular carcinoma：current perspectives［J］. Journal of Hepatocellular Carcinoma,2016, 3：63-67.

［15］Chen CL, Huang XM, Chen CS, et al. Can glypican-3 be a diseasespecifcbiomarker？［J］. Clin Trans Med, 2017, 6（18）：1-6.

［16］J. 薩姆布魯克, D. W拉塞爾, 黃培堂等譯. 分子克隆實驗指南［M］. 第3版. 科學出版社, 2002.

Prokaryotic Expression of Human GPC3 and Preparation of Polyclonal Antibody

TENG Qiao XIA Li-jie ZHANG Fu-chun
（Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046）

This work aims to construct the prokaryotic protein of glypican3（GPC3）and to prepare its anti-serum to mouse. The complete open reading frame（ORF）of human GPC3’s cDNA was amplified by PCR，and then cloned into prokaryotic expression vector of pET28a. Further，the GPC3 fusion protein was expressed in Escherichia coli BL21，the fusion his-protein was purified by affinity chromatography and the fusion protein of purity was measured by SDS-PAGE electrophoresis. Finally，the protein content was also measured.The Balb/c mice were immunized by the purified protein for preparing the anti-serum，and the anti-serum was identified with ELISA analysis.Results showed that the polyclonal antibody against GPC3 protein was successfully prepared and the titer of antisera was 1：51200；moreover，the specificity was validated to be fine by Western blot. Conclusively，recombinant human GPC3 protein expressed in the prokaryotic system has strong immunogenicity.

glypican3；fusion protein；polyclonal antibody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0379

2017-05-12

國家自然科學基金資助項目（31500752），新疆大學博士啟動基金資助項目（BS150241）

騰橋，女，碩士研究生，研究方向：分子免疫學；E-mail：851566931@qq.com

夏麗潔，女，博士，講師，研究方向：分子免疫學；E-mail：xialijie1219@163.com

張富春，男，博士，教授，研究方向：分子免疫學；E-mail：zfcxju@xju.edu.cn

（責任編輯 李楠）