馬石楠 李忠耀 郭興榮

（1. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院 胚胎干細(xì)胞研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，十堰 442000；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，十堰 442000）

ANGPTL8調(diào)控糖代謝作用機(jī)制研究

馬石楠1李忠耀2郭興榮1

（1. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院 胚胎干細(xì)胞研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，十堰 442000；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，十堰 442000）

探討ANGPTL8在胰島素作用下對(duì)人肝細(xì)胞糖代謝影響及可能的作用機(jī)制。利用尾靜脈水動(dòng)力轉(zhuǎn)染證實(shí)在小鼠肝臟過(guò)表達(dá)ANGPTL8可提高進(jìn)食期糖耐受；在HepG2細(xì)胞中利用qPCR檢測(cè)進(jìn)食的主要調(diào)控因素胰島素、葡萄糖等對(duì)ANGPTL8表達(dá)影響，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的葡萄糖或胰島素對(duì)ANGPTL8表達(dá)影響不明顯，而葡萄糖和胰島素組合可顯著促進(jìn)ANGPTL8表達(dá)；利用Western blotting分析在ANGPTL8敲除（ANGPTL8-/-）和ANGPTL8穩(wěn)定過(guò)表達(dá)（ANGPTL8++）的HepG2細(xì)胞中胰島素介導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白及其蛋白磷酸化表達(dá)差異，結(jié)果顯示ANGPTL8可上調(diào)胰島素介導(dǎo)的AKT信號(hào)通路中AKT、GSK-3β、FoxO1 蛋白磷酸化；PAS染色分析ANGPTL8可促進(jìn)胰島素介導(dǎo)的糖原合成。

ANGPTL8；糖耐受；PI3K/AKT信號(hào)通路；糖原合成

血管生成素樣蛋白8（ANGPTL8）又名Betatrophin，是在胰島素抵抗2型糖尿病小鼠肝臟中最新發(fā)現(xiàn)的一種異常高表達(dá)的分泌性蛋白［1-3］。大量流行病統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示在2型糖尿病患者血漿中的ANGPTL8濃度明顯高于正常人群［4-7］，尤其在最新診斷的2型糖尿病患者體內(nèi)ANGPTL8濃度與胰島素含量、糖耐受等呈一定相關(guān)性［8］。Melton等［2］利用一種胰島素受體拮抗劑S961誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗模型時(shí)，發(fā)現(xiàn)ANGPTL8異常高表達(dá)并且可能是通過(guò)特異高效促進(jìn)胰腺β 細(xì)胞增殖，提高糖耐受改善胰島素抵抗。然而，2014 年Yang等［3］發(fā)現(xiàn)在小鼠肝臟過(guò)表達(dá)ANGPTL8，只引起小鼠胰腺或者移植在腎被膜下的小鼠β細(xì)胞增殖，對(duì)移植在腎被膜下人胰島β細(xì)胞無(wú)任何作用。最近Viktoria等［9］研究發(fā)現(xiàn)，ANGPTL8并非是β細(xì)胞發(fā)揮功能或增殖的必要條件。面對(duì)Viktoria的質(zhì)疑，Yi和Melton等［10］承認(rèn)之前實(shí)驗(yàn)存在疏漏，認(rèn)同Viktoria等的研究結(jié)果：ANGPTL8并不是通過(guò)高效特異促進(jìn)β細(xì)胞增殖來(lái)提高糖耐受。所以ANGPTL8改善糖耐受即其調(diào)控糖代謝作用機(jī)制目前還不清楚。本研究將利用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)在小鼠肝臟過(guò)表達(dá)ANGPTL8分析在進(jìn)食期該基因?qū)μ悄褪苡绊懀缓罄们捌跇?gòu)建的ANGPTL8-/-和ANGPTL8++HepG2細(xì)胞為細(xì)胞模型，探討其可能調(diào)控機(jī)制。所以對(duì)ANGPTL8調(diào)控糖代謝機(jī)制研究，將為進(jìn)一步研究ANGPTL8在胰島素抵抗時(shí)提高糖耐受作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為ANGPTL8臨床治療糖尿病的藥物開(kāi)發(fā)提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 HepG2購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。37℃，5%二氧化碳和飽和濕度條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清（FBS）的α-MEM或DMEM加有雙抗液（青霉素100 U/mL，鏈霉素 100 μg /mL）。

1.1.2 動(dòng)物 6-8周BALA/C雄鼠（購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。在湖北醫(yī)藥學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，有關(guān)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)操作得到了該中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的認(rèn)可和批準(zhǔn)。

1.1.3 試劑 ONETOUCH@ SursStep@血糖測(cè)定試紙購(gòu)自美國(guó)LIfe Scan公司；熒光素酶底物（D-luciferin）購(gòu)自美國(guó)Caliper Life Sciences公司；β-actin抗體購(gòu) 自 Abcam 公 司；AKT，Phospho-AKT（Ser473），GSK3-β，Phospho-GSK-3β（Ser9），F(xiàn)oxO1，Phospho-FoxO1（Thr24），Phospho-IRS1（Ser307），Phospho-IRS1（Ser302），IRS1，等抗體購(gòu)自Santa Cruz 公司；Flag抗體購(gòu)自sigma公司；堿性磷酸酶標(biāo)記（AP）羊抗兔，羊抗鼠二抗，彩色預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品、Western blotting及IP細(xì)胞裂解液、PMSF（100 mmol/L）、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、SDSPAGE電泳液、6×上樣緩沖液等均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所購(gòu)自碧云天生物科技公司；蛋白酶抑制劑，磷酸化蛋白酶抑制劑（PhosStop）購(gòu)自Roche公司；qPCR supermix-UDG with ROX kit購(gòu)自Invitrogen公司；胰島素、D-葡萄糖購(gòu)自Sigma公司；PAS糖原染色試劑盒購(gòu)自森貝伽公司。本實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù) 將待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒同生理鹽水稀釋至小鼠體重10%，如2 mL（20 μg質(zhì)粒）/20 g（小鼠體重）；用固定架把小鼠固定，75%酒精消毒尾巴，干棉球擦干，暴露尾靜脈；注射器吸取混勻的質(zhì)粒溶液，經(jīng)尾靜脈8-10 s快速注射入小鼠體內(nèi)，每組3-5只，對(duì)照組為 LUC（pGL4.51［luc2/CMV/Neo］）質(zhì)粒組；分別在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒0、24、48、72、96、120和168 h后，小鼠活體成像儀觀察對(duì)照組的熒光素酶表達(dá)情況，從而確定目的質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)表達(dá)最高時(shí)間點(diǎn)。

1.2.2 血糖的測(cè)定 采用剪尾測(cè)血糖法：將血糖儀調(diào)好，試紙插入血糖儀裝好；固定小鼠，用手術(shù)刀切除尾部1-0.5 mm，擠出一滴血，直接滴入血糖試紙，用紗布或者棉球給鼠尾壓迫止血；記錄血糖儀讀數(shù)。

1.2.3 測(cè)定 小鼠禁食過(guò)夜至少12 h，按1 mg（D-glucose）/g（小鼠體重）腹腔注射D-glucose 溶液，采用如前所述的剪尾測(cè)血糖法分別在注射0 min和60 min，120 min 和240 min檢測(cè)小鼠血糖變化。

1.2.4 引物設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)所用到引物，見(jiàn)表1。

表1 PCR引物和產(chǎn)物片段大小

1.2.5 熒光定量Real-time PCR Real-time PCR（qPCR）過(guò)程根據(jù)SYBR Green RT-PCR試劑盒與擴(kuò)增儀說(shuō)明，用β-actin基因上為內(nèi)參對(duì)照。加樣（每組樣品設(shè)2-3個(gè)復(fù)空），貼膜密封后使用StepOneTMReal-Time PCR Systems（Applied Biosystems） 進(jìn) 行PCR反應(yīng)。數(shù)據(jù)分析根據(jù)軟件默認(rèn)值自動(dòng)分析。得到精確的Ct值后導(dǎo)出數(shù)據(jù)，根據(jù)公式：2-ΔΔCt值確定目的基因與內(nèi)標(biāo)基因之間的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)，繪制圖表。獨(dú)立樣本T-test（兩個(gè)樣品間比較）來(lái)進(jìn)行處理間的差異比較分析。

1.2.6 Western blotting SDS-PAGE電泳后，取出凝膠，將膠浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中15 min，將濾紙、凝膠、NC膜等按一定次序放疊在一起后，放入轉(zhuǎn)膜儀器中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（15 V，30 min）。轉(zhuǎn)膜后，取NC膜于5%脫脂奶粉中封閉1h。封閉后，NC膜浸泡于1×TBST溶液中清洗3次，每次5 min。清洗后，置NC膜于一抗稀釋液（V/V=1∶1 000）中孵育1 h，隨后，取出NC膜用TBST洗滌3次，加入二抗稀釋液（V/V=1∶1 000）孵育1 h，取出NC膜洗滌完畢后即可顯色（注意避光），觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.7 PAS染色法檢測(cè)糖原合成 PAS染色（Periodic Acid-Schiff stain）按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作并稍加修改：將待檢測(cè)細(xì)胞去除培養(yǎng)基，ddH2O洗2-3次，加入細(xì)胞固定液室溫固定10 min；去除固定液，ddH2O洗2-3次，每次5 min，加入高碘酸酒精溶液室溫（17-20℃的室溫為最佳）孵育10 min；用ddH2O充分洗，吸水紙吸干水；Schiff氏試劑避光染色10-15 min；流動(dòng)自來(lái)水沖洗10 min；顯微鏡下觀察并照相。

1.2.8 細(xì)胞處理 （1）ANGPTL8表達(dá)檢測(cè)：將HepG2細(xì)胞用無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓處理24 h 后，分別向培養(yǎng)基中添加胰島素、葡萄糖及兩者組合培養(yǎng)12 h，收取細(xì)胞提取RNA，用于RT-PCR。

（2）胰島素磷酸蛋白檢測(cè)方法：參考Zhou 等［11］方法，分別把前期構(gòu)建的ANGPTL8++、ANGPTL8-/-和野生型HepG2 三種細(xì)胞各分為兩組，一組正常培養(yǎng)，一組向培養(yǎng)基中添加100 nmol/L 的胰島素，培養(yǎng) 20 min，Western blotting 分別檢測(cè) AKT 與 pAKT（磷酸化AKT 蛋白）表達(dá)變化。

2 結(jié)果

2.1 肝臟過(guò)表達(dá)ANGPTL8對(duì)小鼠血糖影響

作為新基因ANGPTL8的功能還存在很多爭(zhēng)議，為了確定ANGPTL8是否影響糖代謝，將在小鼠體內(nèi)重復(fù)Melton利用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染方法的實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)在肝臟過(guò)表達(dá)ANGPTL8后對(duì)糖耐受影響。利用活體成像儀器觀察水動(dòng)力轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒pGL4.51-LUC在小鼠肝臟轉(zhuǎn)染前0 h和轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)熒光素酶（LUC）表達(dá)情況，如圖1-A所示，對(duì)照質(zhì)?？沙掷m(xù)在小鼠體內(nèi)表達(dá)至少7 d，在轉(zhuǎn)染后48 h表達(dá)最高。根據(jù)對(duì)照質(zhì)粒LUC在小鼠表達(dá)情況，選取在轉(zhuǎn)染人ANGPTL8-Flag和鼠ANGPTL8-Flag質(zhì)粒（前期工作已構(gòu)建）后0、48、72和168 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)提取小鼠肝臟組織蛋白，Western blotting檢測(cè)hANGPTL8-Flag和mANGPTL8-Flag表達(dá)情況。如圖1-B所示，hANGPTL8和mANGPTL8質(zhì)粒在小鼠肝臟的表達(dá)趨勢(shì)基本和對(duì)照質(zhì)粒一致。根據(jù)以上結(jié)果在轉(zhuǎn)染目的基因48 h后，小鼠禁食過(guò)夜（≤12 h）后，按1 mg（D-glucose）/g（小鼠體重）腹腔注射D-glucose 溶液，進(jìn)行血糖測(cè)定實(shí)驗(yàn)。如圖1-B所示，在禁食過(guò)夜后轉(zhuǎn)染人和鼠ANGPTL8質(zhì)粒與對(duì)照組小鼠血糖無(wú)明顯差異，腹腔注射葡萄糖1-2 h注射人和鼠ANGPTL8質(zhì)粒組血糖明顯低于對(duì)照組，而注射葡萄糖4 h后人ANGPTL8和鼠ANGPTL8質(zhì)粒組的血糖又恢復(fù)到與對(duì)照組基本一致。結(jié)果顯示ANGPTL8在小鼠的進(jìn)食期發(fā)揮重要作用，可提高糖耐受。

2.2 不同因素對(duì)ANGPTL8 mRNA表達(dá)影響

用胰島素、葡萄糖及兩者組合處理HepG2細(xì)胞后，RT-PCR和qPCR結(jié)果（圖2-A）表明單獨(dú)添加葡萄糖、胰島素都不會(huì)引起ANGPTL8表達(dá)升高，而兩者組合能顯著提ANGPTL8表達(dá)。為進(jìn)一步分析在HepG2細(xì)胞中ANGPTL8的表達(dá)是否與胰島素劑量和作用時(shí)間相關(guān)，我們分別用100 nmol/L胰島素培養(yǎng)基（含5.5 mmol/L葡萄糖）處理0、1、4、16、36和48 h，如圖2-B顯示，隨著胰島素作用時(shí)間的延長(zhǎng)，ANGPTL8的表達(dá)逐漸升高；當(dāng)用不同濃度胰島素處理的結(jié)果（圖1-C）顯示隨著胰島素濃度的增加ANGPTL8的表達(dá)也逐漸升高。所以以上結(jié)果解釋為什么在進(jìn)食期和胰島素抵抗時(shí)ANGPTL8表達(dá)顯著上調(diào)，因?yàn)檫@兩個(gè)時(shí)期機(jī)體都會(huì)出現(xiàn)高血糖和胰島素尤其在胰島素抵抗初期。

2.3 ANGPTL8調(diào)控糖代謝作用機(jī)制研究

圖1 ANGPTL8在小鼠肝臟過(guò)表達(dá)對(duì)血糖影響

Western blot結(jié)果（圖3）顯示，當(dāng)有胰島素存在時(shí)，ANGPTL8++、ANGPTL8-/-和野生型HepG2三種細(xì)胞的AKT蛋白磷酸化顯著上調(diào)，并且ANGPTL8++細(xì)胞株中AKT蛋白磷酸化程度明顯高于野生型和ANGPTL8-/-細(xì)胞株，而野生型和ANGPTL8-/-細(xì)胞株中AKT蛋白磷酸化水平?jīng)]有明顯區(qū)別。以上結(jié)果說(shuō)明ANGPTL8可促進(jìn)由胰島素介導(dǎo)的AKT蛋白磷酸化。

為了檢測(cè)ANGPTL8是否通過(guò)影響PI3K/AKT信號(hào)通路中AKT上游蛋白磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)AKT磷酸化，我們分別檢測(cè)了其上游關(guān)鍵蛋白IRS-1、JNK及其磷酸化變化。結(jié)果（圖4）顯示，無(wú)論有無(wú)胰島素存在，IRS-1、JNK、pIRS-1（ser307）、pIRS-1（ser302）和pJNK在三組細(xì)胞中表達(dá)均無(wú)明顯差異。以上結(jié)果說(shuō)明ANGPTL8可能不是通過(guò)對(duì)IRS-1和JNK蛋白直接磷酸化來(lái)調(diào)控影響AKT蛋白磷酸化。

進(jìn)一步分析ANGPTL8通過(guò)對(duì)AKT蛋白磷酸化后對(duì)其下游GSK-3β、FoxO1 和mTOR 蛋白磷酸影響。如圖5結(jié)果所示，無(wú)論有無(wú)胰島素ANGPTL8對(duì)GSK-3β、FoxO1和mTOR總蛋白表達(dá)沒(méi)有影響，在胰島素作用下GSK-3β、FoxO1和mTOR蛋白磷酸化表達(dá)明顯上調(diào)，但ANGPTL8++細(xì)胞株中pGSK-3β和pFoxO1蛋白表達(dá)明顯高于野生型和ANGPTL8-/-細(xì)胞株，然而pmTOR在3組細(xì)胞中無(wú)明顯差異。以上結(jié)果說(shuō)明ANGPTL8可調(diào)控由胰島素介導(dǎo)的AKT/FoxO1 or GSK-3β信號(hào)通路，但不影響AKT/mTOR通路。

2.4 ANGPTL8對(duì)糖原合成影響

利用PAS染色檢測(cè)ANGPTL8對(duì)糖原合成影響，結(jié)果（圖6）顯示，經(jīng)過(guò)不同處理后對(duì)照組（培養(yǎng)基只含0.5% BSA）中3種細(xì)胞的糖原含量基本無(wú)明顯差異；0.5% BSA+glucose和0.5%BSA+glucose+insulin處理組中ANGPTL8++細(xì)胞中糖原含量明顯高于與對(duì)照和ANGPTL8-/-細(xì)胞，隨著胰島素的加入ANGPTL8促進(jìn)糖原合成更加明顯，然而對(duì)照與ANGPTL8-/-細(xì)胞在這兩個(gè)處理組中的糖原含量無(wú)明顯差異。

以上結(jié)果表明在HepG2細(xì)胞中，ANGPTL8可提高胰島素敏感，促進(jìn)胰島素對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的FoxO1和GSK-3β蛋白磷酸化，從而促進(jìn)糖原合成，提高糖耐受。

圖2 不同因素對(duì)ANGPTL8 mRNA表達(dá)影響

圖3 Western blotting檢測(cè)在HepG2細(xì)胞中ANGPTL8對(duì)AKT和pAKT蛋白表達(dá)影響

圖4 Western blotting檢測(cè)在HepG2細(xì)胞中ANGPTL8對(duì)IRS-1和JNK蛋白及其磷酸化蛋白表達(dá)影響

3 討論

pI磷

圖5 Western blotting檢測(cè)在HepG2細(xì)胞中ANGPTL8對(duì)GSK-3β、FoxO1和mTOR蛋白及其磷酸化表達(dá)影響

PI3K/AKT信號(hào)通路是胰島素的主要下游調(diào)控分子通路。當(dāng)人或動(dòng)物進(jìn)食后，由血糖升高的刺激胰腺胰島β細(xì)胞分泌產(chǎn)生的胰島素，胰島素入血后作用于肝細(xì)胞膜表面的胰島素受體，使其位于細(xì)胞內(nèi)的β 亞基的酪氨酸位點(diǎn)自磷酸化激活。激活的胰島素受體可通過(guò)磷酸化胰島素受體底物-1/2（IRS-1/2）酪氨酸位點(diǎn)而激活I(lǐng)RS-1/2，進(jìn)而激活PI3K［12-13］?；罨腜I3K可以催化4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）變成PIP3。PIP3是AKT第二信使，可激活A(yù)KT，后者可以通過(guò)調(diào)節(jié)GSK3β等一系列下游分子的活性增加糖原合成［14-16］，同時(shí)可磷酸化FoxO1使其出核失活，從而降低葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶等糖異生基因的表達(dá)，抑制糖異生，最終發(fā)揮降低血糖的作用［17］。PI3K-AKT信號(hào)通路的調(diào)節(jié)已是多種疾病包括糖尿病在內(nèi)的潛在干預(yù)靶點(diǎn)。

作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的基因，ANGPTL8的功能還存在很多爭(zhēng)議，為了明確其對(duì)糖代謝影響，我們首先在小鼠肝臟過(guò)表達(dá)ANGPTL8，發(fā)現(xiàn)人和鼠ANGPTL8基因都可以改善糖耐受。在小鼠體內(nèi)ANGPTL8 mRNA 表達(dá)明顯受到進(jìn)食和禁食的調(diào)節(jié)，它在進(jìn)食期表達(dá)明顯升高，禁食期表達(dá)降低［18-19］。Ren等［20］和我們分別在3T3-L1 和HepG2細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)ANGPTL8 mRNA 表達(dá)受胰島素和葡萄糖的共同調(diào)控，然而單獨(dú)的胰島素或葡萄糖不會(huì)上調(diào)ANGPTL8 mRNA 的表達(dá)。這些研究結(jié)果提示ANGPTL8可能通過(guò)調(diào)控胰島素信號(hào)通路影響糖耐受。為進(jìn)一步研究其改善糖耐受作用機(jī)制，我們以前期已構(gòu)建的ANGPTL8++和ANGPTL8-/-的 HepG2細(xì)胞［21］為研究對(duì)象，分析ANGPTL8調(diào)控糖代謝的可能分子作用機(jī)制。通過(guò)RT-PCR、qPCR、Western blotting、PAS染色等檢測(cè)方法，我們發(fā)現(xiàn)胰島素可促進(jìn)ANGPTL8表達(dá)，而高表達(dá)的ANGPTL8又可通過(guò)提高胰島素介導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)通路中AKT，F(xiàn)oxO1，GSK-3β蛋白磷酸化，提高HepG2細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性，促進(jìn)糖原合成，改善糖耐受；而ANGPTL8的低表達(dá)或缺失并不影響胰島素對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白磷酸化。所以以上結(jié)果提示ANGPTL8可能是通過(guò)胰島素介導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控肝臟糖代謝，改善肝細(xì)胞糖耐受。然而ANGPTL8調(diào)控PI3K-AKT信號(hào)通路的作用方式即ANGPTL8可能直接作用于此信號(hào)通路中哪個(gè)蛋白的磷酸化尚不清楚，還需要后期深入研究。

4 結(jié)論

本研究利用前期工作已構(gòu)建的ANGPTL8++和ANGPTL8-/-的HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，首次從分子水平分析新基因ANGPTL8在肝細(xì)胞中調(diào)控糖代謝的可能作用機(jī)制。

［1］Gusarova V, Alexa CA, Na E, et al. ANGPTL8/betatrophin does not control pancreatic beta cell expansion［J］. Cell, 2014, 159（3）：691-696.

［2］Yi P, Park JS, Melton DA. Betatrophin：A hormone that controls pancreatic beta cell proliferation［J］. Cell, 2013, 153（4）：747-758.

［3］Jiao Y, Le L, Yu M, et al. Elevated mouse hepatic ANGPTL8 expression does not increase human beta-cell replication in the transplant setting［J］. Diabetes, 2014, 63（4）：1283-1288.

［4］Fu Z, Berhane F, Fite A, et al. Elevated circulating lipasin/betatrophin in human type 2 diabetes and obesity［J］. Scientific Reports, 2014, 4（11）：5013.

［5］Daniel MM, Per OC. Increased circulating betatrophin concentrations in patients with type 2 diabetes［J］. Int J Endocrinol, 2014, 10（5）：323407-323413.

［6］Tokumoto HY, Fujimoto K, Yamaguchi E, et al. Correlation of circulating betatrophin concentrations with insulin secretion capacity, evaluated by glucagon stimulation tests［J］. J Clin Endocr Metab, 2015, 19（1）：111-119.

［7］Chen X, Lu P, He W, et al. Circulating betatrophin levels are increased in patients with type 2 diabetes and associated with insulin resistance［J］. J Clin Endocrinol Metab, 2015, 100（1）：E96-E100.

［8］Hu H, Sun W, et al. Increased circulating levels of betatrophin in newly diagnosed type 2 diabetic patients［J］. Diabetes Care, 2014,37（10）：2718-2722.

［9］Viktoria G, Erqian Na, Panayiotis E, et al. ANGPTL8/betatrophin does not control pancreatic beta cell expansion［J］. Cell, 2014,159：691-696.

［10］Yi P, Park JS, Melton DA. Perspectives on the activities of ANGPTL8/betatrophin［J］. Cell, 2014, 159（3）：467-468.

［11］ Zhou L, Sell H, Eckardt K, et al. Conditioned medium obtained from in vitro differentiated adipocytes and resistin induce insulin resistance in human hepatocytes［J］. Febs Letters, 2007, 581（22）：4303-4308.

［12］Neri LM, Borgatti P, Capitani S, et al. The nuclear phosphoinositide 3-kinase/AKT pathway：a new second messenger system［J］.Biochimica et Biophysica Acta, 2002, 1584（23）：73-80.

［13］Cantley LC. The phosphoinositide 3-kinase pathway［J］. Science,2002, 296（5573）：1655-1657.

［14］Liu P, Cheng H, Roberts TM, et al. Targeting the phosphoinositide 3-kinase pathway in cance［rJ］. Nat Rev Drug Discov, 2009, 8（8）：627-644.

［15］Lochhead PA, Coghlan M, Rice SQ, et al. Inhibition of GSK-3 selectively reduces glucose-6-phosphatase and phosphatase and phosphoenolypyruvate carboxykinase gene expression［J］.Diabetes, 2001, 50（5）：937-946.

［16］Ishikawa M, Yoshida K, Okamura H, et al. Oral porphyromonas gingivalis translocates to the liver and regulates hepatic glycogen synthesis through the AKT/GSK-3beta signaling pathway［J］.Biochimica et Biophysica Acta, 2013, 1832（12）：2035-2043.

［17］Banks MJ, Mastracci TL, Kofler NM, et al. Dissociation of the glucose and lipid regulatory functions of FoxO1 by targeted knock in of acetylation-defective alleles in mice［J］. Cell Metab, 2011,14（5）：587-597.

［18］Zhang R. Lipasin, a novel nutritionally-regulated liver-enriched factor that regulates serum triglyceride levels［J］. Biochem Bioph Res Co, 2012, 424（4）：786-792.

［19］Fu ZY, Yao FY, Abou-Samra AB, et al. Lipasin, thermoregulated in brown fat, is a novel but atypical member of the angiopoietinlike protein family［J］. Biochem Bioph Res Co, 2013, 430（3）：1126-1131.

［20］Ren G, Kim JY, Smas CM. Identification of RIFL, a novel adipocyte-enriched insulin target gene with a role in lipid metabolism［J］. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2012, 303（3）：E334-351.

［21］郭興榮, 陳云, 李東升. TALEN介導(dǎo)的Betatrophin敲除HepG2細(xì)胞株的建立［J］. 湖北醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào), 2015, 10（5）：427-431.

Study on the Molecular Mechanism of ANGPTL8 in Regulating the Glucose Metabolism

MA Shi-nan1LI Zhong-yao2GUO Xing-rong1
（1.Hubei Key Laboratory of Embryonic Stem Cell Research，Taihe Hospital，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000 ；2. School of Biomedical Engineering，Hubei University of Medicine，Shiyan 442000）

This work aims to study the effect and molecular mechanism of ANGPTL8 on glucose metabolism by insulin. By tail vein hydrodynamic transfection we confirmed that over-expression of ANGPTL8 in the liver of mice improved glucose tolerance in feeding period.Detecting insulin and glucose effect on ANGPTL8 expression by qPCR in HepG2 cell，we found that ANGPTL8 was dramatically up-regulated only when insulin was added together with glucose into the medium；neither of these two reagents alone affected ANGPTL8 expression. Western blotting was employed to analyze the total proteins and their phosphorylation expressions of insulin-mediated PI3K/AKT signaling pathways in ANGPTL8 knockout（ANGPTL8-/-）and ANGPTL8 over-expression（ANGPTL8++）HepG2 cells. The results demonstrated that the overexpressed ANGPTL8 promoted insulin-mediated AKT，GSK3β or FoxO1 phosphorylation in PI3K/AKT signaling pathway in HepG2 cells. PAS staining results suggested that ANGPTL8 promoted glycogen synthesis.

ANGPTL8；glucose tolerance；PI3K/AKT signaling pathway；glycogen synthesis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0353

2017-05-03

國(guó)家自然科學(xué)基金應(yīng)急管理項(xiàng)目（81641028），湖北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2016CFB408），十堰市太和醫(yī)院與上海寶藤生物醫(yī)藥科技股份有限“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究”青年項(xiàng)目（2016JZ21），湖北醫(yī)藥學(xué)院博士啟動(dòng)金項(xiàng)目（2016QDJR02）

馬石楠，女，碩士，研究方向：糖尿病預(yù)防與治療；E-mail：815513350@qq.com

郭興榮，女，博士，副教授，研究方向：糖尿病預(yù)防與治療；E-mail：gxrdl@126.com

（責(zé)任編輯 李楠）