李巖　姚燕

【摘要】 目的：探討在超聲微創(chuàng)外科技術(shù)加速大鼠牙移動過程中組織蛋白酶K以及相關(guān)microRNA的表達改變。方法：將2月齡Wistar雄性大鼠60只按照隨機分為空白對照組（對照組）、常規(guī)正畸治療組（正畸組）和超聲微創(chuàng)外科手術(shù)聯(lián)合正畸治療組（微創(chuàng)組）三組，每組20只。在正畸組中，大鼠上頜左側(cè)第一磨牙與上切牙之間安裝正畸裝置，將磨牙以力值30 g的力量拉向近中移動；而微創(chuàng)組則為在正畸治療的同時，在第一磨牙的近遠中用超聲骨刀切開骨皮質(zhì)至骨髓質(zhì)。每組于建立模型加力7 d時將大鼠處死，通過HE染色觀察牙周組織的形態(tài)學變化并計數(shù)壓力側(cè)破骨細胞數(shù)目；通過Western blot檢測牙周組織中組織蛋白酶K的表達改變；并通過實時定量PCR（Quantitative real time PCR，qRT-PCR）檢測牙周組織中維持高表達的microRNA（miR-17，miR-21，miR-126，miR-32，miR-147，miR-155）的表達改變。結(jié)果：HE染色結(jié)果顯示，與對照組相比，正畸組中牙周組織的形態(tài)發(fā)生明顯病理學變化，并且大鼠壓力側(cè)破骨細胞數(shù)量明顯高于對照組（P<0.05）。此外，正畸組中組織蛋白酶K的表達也出現(xiàn)明顯上調(diào)，并伴隨有牙周組織中miR-17、miR-21、miR-126、miR-32、miR-147、miR-155的表達紊亂（P<0.05）。但是在微創(chuàng)組中，牙周組織的形態(tài)、大鼠壓力側(cè)破骨細胞數(shù)量、組織蛋白酶K的表達及microRNA的表達紊亂均得到了改善（P<0.05）。結(jié)論：超聲微創(chuàng)外科技術(shù)創(chuàng)傷小，術(shù)后腫痛輕，對牙周組織的影響小，能夠加速正畸牙移動，適用于臨床正畸治療。

【關(guān)鍵詞】 超聲微創(chuàng)外科技術(shù)； 正畸治療； 組織蛋白酶K； MicroRNA

Expression of MicroRNA and Cathepsin K in the Process of Accelerating Orthodontic Tooth Movement Through Ultrasonic Minimally Invasive Surgical Techniques in Rats/LI Yan，YAO Yan.//Medical Innovation of China，2017，14（26）：016-020

【Abstract】 Objective：To explore the expression of cathepsin K and relevant microRNA in the process of accelerating orthodontic tooth movement through ultrasonic minimally invasive surgical techniques in rats.Method：A total of 60 Wistar male 2-month-old rats were divided into normal control group（the control group），orthodontic device group（the orthodontic group） and ultrasonic minimally invasive surgical techniques combined orthodontic treatment group（the minimally invasive group） according to random number table method，20 cases in each group.In the orthodontic group，the rats were installed orthodontic device between the left maxillary first molars and incisors，molars were pulled to the middle with the power of the force value 30 g.The minimally invasive group and the orthodontic group at the same operation，the cortical bone was penetrated to a depth of 0.5 mm mesially and distally in the first molar.The rats of each group were killedon the seventh day.The morphological changes of periodontal tissuewere observedvia HE staining and osteoclast number of the pressure side was counted.The expression of cathepsin K change of periodontal tissue was detected by Western blot and expression changes of high expression microRNA in periodontal tissue were detected through real-time Quantitative PCR，such as miR-17，miR-21，miR-126，miR-32，miR-147，miR-155.Result：Compared with the control group，HE staining results showed that periodontal tissue morphogenesis of the orthodontic group had obvious pathology change，and the osteoclast number of the pressure side was significantly higher than that of the control group（P<0.05）.In addition，the orthodontic group also showed obviously up-regulated the expression of cathepsin K，and was accompanied by expression turbulence of miR-17，miR-21，miR-126，miR-32，miR-147，miR-155 in the periodontal tissue（P<0.05）.While in the minimally invasive group，the configuration of periodontal tissue，osteoclast number of pressure side，the expression of cathepsin K and microRNA expression disorders were improved（P<0.05）.Conclusion：Compared with conventional orthodontic method，ultrasonic minimally invasive surgical techniques wound is small，light postoperative sore，small impact on periodontal tissue，it can accelerate orthodontic tooth movement，so it may be suitable for clinical orthodontic treatment on the teeth.endprint

【Key words】 Ultrasound minimally invasive surgical techniques； Orthodontic treatment； Cathepsin K；MicroRNA

First-authors address：Liaocheng Peoples Hospital，Liaocheng 252000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.26.005

口腔正畸治療中牙齒的移動是一個牙周組織改建的過程，其受激素、生長因子、系統(tǒng)因素好的機械力等多種因素影響，是一個非常復雜的過程，其具體的分子生物學機制仍不清楚。并且如何加速正畸牙齒的移動，縮短治療過程和保持正畸治療后牙齒的穩(wěn)定而理想的位置是治療的關(guān)注重點。目前，超聲微創(chuàng)外科技術(shù)治療成為研究熱點，該技術(shù)具有能夠軟硬組織識別、創(chuàng)傷小、恢復快等優(yōu)點，能夠有效的保護牙周膜細胞。

組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）主要存在于破骨細胞中，是一種半胱氨酸蛋白酶，其作用主要表現(xiàn)為降解骨連接素、膠原纖維等多種骨基質(zhì)蛋白[1-2]。目前研究表明CTSK在破骨細胞中呈現(xiàn)高表達，與NF-κB受體活化劑配體，活化T細胞核因子，線粒體翻譯起始因子等信號通路相互作用，增強破骨細胞形成和骨吸收[3-4]。此外，microRNA的研究是當前生物科學領(lǐng)域研究的熱點之一，筆者選擇牙周組織中高表達的六個microRNA、miR-17、miR-21、miR-126、miR-32、miR-147、miR-155等為研究對象，檢測正畸治療過程中牙周組織中microRNA的表達改變情況。

本文觀察超聲微創(chuàng)外科手術(shù)加速大鼠正畸牙移動以縮短治療過程，并檢測牙移動過程中組織蛋白酶K以及microRNA表達的改變，旨在探討超聲微創(chuàng)外科手術(shù)對牙周組織改建的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立 選取60只2月齡SPF級的Wistar雄性大鼠，體重200～220 g/只，并且通過口腔檢測觀察大鼠均牙列完整。大鼠均行10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）腹腔注射麻醉，將麻醉后的大鼠仰臥固定。選取左側(cè)上頜為實驗側(cè)，以左上切牙為支抗，拉第一磨牙近中移動。使用牙科專用高速渦輪車針處理大鼠雙側(cè)上頜切牙，在其第一磨牙齦緣處構(gòu)建固位溝，并同時準備0.25 mm的正畸專用不銹鋼結(jié)扎絲，上頜切牙與第一磨牙之間將螺旋彈簧結(jié)扎，在第一磨牙的近遠中用超聲骨刀切開骨皮質(zhì)至骨髓質(zhì)，牽引左側(cè)上頜第一磨牙向近中移動，力約30 g，持續(xù)7 d。

1.2 HE染色 于第7天時處死大鼠，解剖上頜骨并取得上頜第一磨牙以及牙周組織作為標本，用4%的多聚甲醛溶液固定24 h，再用pH值為7.4的10%EDTA溶液脫鈣50 d，用流水洗凈脫鈣液后使用不同濃度的乙醇溶液進行梯度脫水，再用二甲苯溶液進行組織的透明處理，最后使用石蠟包埋，送往醫(yī)院病理科進行組織塊的切片。對所得樣本進行蘇木素-伊紅（HE）染色：首先，分別用二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ）、二甲苯（Ⅲ）處理切片5 min，再用100%乙醇、90%乙醇、80%乙醇以及70%乙醇各處理2 min，用流水沖洗5 min后，放入蘇木精液中染色5 min，用流水沖洗去蘇木精液，再放入1%的鹽酸乙醇中快速處理3 s，用流水沖洗至切片返藍，再用0.5%伊紅液染色3 min，再用蒸餾水稍洗，再用80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇快速處理各2 s，再用二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ）和二甲苯（Ⅲ）各處理2 min，最后用中性樹膠封固，置于光學顯微鏡下觀察。

1.3 microRNA的表達檢測 使用Qiagen公司生產(chǎn)的miRNeasy Mini Kit試劑盒進行microRNA的提取，嚴格按照的產(chǎn)品說明書進行microRNA的富集。對所得到的microRNA進行反轉(zhuǎn)錄處理，反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中包括反轉(zhuǎn)錄Buffer、RNA樣本、MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、反轉(zhuǎn)錄引物以及RNA酶抑制劑，用DEPC水補齊至25 μL體系。反轉(zhuǎn)錄過程為為42 ℃ 50 min，70 ℃ 10 min，最后置于4 ℃。以cDNA為模板，進行實時定量PCR檢測，所用的試劑盒購自北京全式金生物科技公司，嚴格按照說明書進行操作，最后在LightCycler Real Time PCR擴增儀進行檢測。

1.4 Western blot檢測PTEN的表達 先將牙周組織用組織勻漿機磨碎，再加入預冷的RIPA裂解液，震蕩使其充分裂解后，加入上樣緩沖液煮沸。進行SDS-PAGE電泳，待溴酚藍染料遷移至底部時關(guān)閉電源，小心的將凝膠取出，并進行電轉(zhuǎn)，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，后將硝酸纖維膜置于脫脂牛奶封閉液中封閉1 h。再加入一抗（抗CTSK單克隆一抗購自Santa Cruz公司，貨號：sc-48353），于4 ℃孵育過夜，用緩沖液沖洗硝酸纖維膜3遍后，然后在加入相應的二抗孵育1 h，用緩沖液沖洗硝酸纖維膜3遍后進行曝光檢測。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用ANOVA單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠牙周組織形態(tài)及壓力側(cè)破骨細胞數(shù)量的變化 由HE染色結(jié)果可見，與對照組相比，正畸組中牙周組織形態(tài)（圖1）發(fā)生明顯改變，破骨細胞數(shù)量（圖2）較多，并且體積稍大。然而在微創(chuàng)組中，牙周組織形態(tài)更偏向于對照組，并且破骨細胞數(shù)量較少，體積也略有減小。這說明微創(chuàng)外科技術(shù)對大鼠牙周組織形態(tài)改變較小，并且能夠減少壓力側(cè)破骨細胞數(shù)量，提示微創(chuàng)外科技術(shù)正畸治療療效可能更好。

*與對照組比較，P<0.05

2.2 組織蛋白酶K表達的變化 通過免疫組織化學的方法檢測牙周組織中組織蛋白酶K的表達豐度，與對照組相比，正畸組中組織蛋白酶K的表達明顯升高；微創(chuàng)組組織蛋白酶K的水平較正畸組明顯降低，見圖3。為了確保實驗數(shù)據(jù)的準確性，筆者使用組織勻漿器將牙周組織磨碎，每組中挑選任意兩個樣本，通過Western blot技術(shù)檢測組織蛋白酶K的表達量，結(jié)果與免疫組化的結(jié)果一致，即正畸組中組織蛋白酶K表達較對照組高，而微創(chuàng)組中組織蛋白酶K表達較正畸組低，見圖4。endprint

2.3 牙周組織中microRNA表達紊亂 本研究結(jié)果顯示：與對照組相比，正畸組中幾乎所有的microRNA表達均出現(xiàn)改變，其中miR-21和miR-126表達上調(diào)，上調(diào)最明顯的是miR-21；miR-32和

miR-147的表達則未見明顯改變（P>0.05）；另外兩種microRNA，即miR-17和miR-155表達明顯下調(diào)，其中miR-17的下降趨勢最明顯。然而在微創(chuàng)組中，幾種microRNAs的表達趨勢較正畸組有很大不同，但是有趣的一點是，幾種microRNAs的表達譜與對照組有相似之處，比如微創(chuàng)組中miR-21的表達量較正畸組明顯降低，回到對照組的表達水平；盡管微創(chuàng)組中miR-17的表達水平仍維持在較低的狀態(tài)，但是與正畸組相比已經(jīng)有了明顯的升高。見圖5。

圖5 牙周組織中microRNA表達紊亂

2.4 生物信息學分析 眾所周知，microRNA主要是通過與靶基因mRNA的3UTR區(qū)進行堿基互補配對，起到轉(zhuǎn)錄后的抑制作用。2.3已經(jīng)介紹很多microRNAs的表達發(fā)生改變，但是它們的表達改變與組織蛋白酶K是否相關(guān)呢？筆者通過生物信息學分析，發(fā)生miR-17可能能夠直接調(diào)控組織蛋白酶K。再結(jié)合以上兩部分介紹，正畸組中組織蛋白酶K高表達伴隨有miR-17的低表達，而微創(chuàng)組中組織蛋白酶K表達水平較正畸組降低，同時伴隨有miR-17的表達升高。這都提示miR-17可能通過直接調(diào)控組織蛋白酶K來發(fā)揮對牙周細胞的生物學功能。

3 討論

組織蛋白酶K是由前多肽原的復合體經(jīng)加工后形成的一種成熟形式的單體蛋白質(zhì)，骨吸收腔隙中的酸性環(huán)境有利于組織蛋白酶K的激活[5]。組織蛋白酶K是破骨細胞中高表達量的具有很強溶骨活性的半胱氨酸蛋白酶，能降解骨基質(zhì)中的骨連接素和骨橋接素，是在骨吸收過程中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵酶[6]。

組織蛋白酶K在哺乳類動物的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，該基因敲除小鼠中骨吸收功能缺陷，出現(xiàn)骨基質(zhì)降解障礙的特征，導致骨硬化癥等疾病。相反，組織蛋白酶K持續(xù)性高表達則會加速小鼠干骺端骨小梁的轉(zhuǎn)換，引發(fā)骨質(zhì)疏松癥等疾病[7]。此外，血清中蛋白酶K水平與骨密度表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，可以使用血清中蛋白酶K水平作為預測骨折風險的標志物[8-10]。很多證據(jù)都證明，組織蛋白酶K可以作為治療骨吸收疾病的一個重要靶點。

最近研究證實，織織蛋白酶K在口腔臨床中也有重要生物學作用，比如，組織蛋白酶K在乳恒牙的替換中發(fā)揮了重要作用。破骨和破牙細胞中，組織蛋白酶K能夠發(fā)揮蛋白水解酶的功能，水解Ⅰ型膠原等骨基質(zhì)蛋白，在破骨細胞以及破牙細胞的形成過程中發(fā)揮重要作用[11]。此外，根吸收現(xiàn)象，尤其是上前牙根吸收現(xiàn)象在幾乎所有的正畸患者中普遍存在，牙根吸收會引起牙冠根比減小，降低穩(wěn)定性，嚴重的甚至會引起牙齒松動脫落。正畸牙移動主要包括溶解礦化物和降解膠原纖維兩個過程，而組織蛋白酶K主要發(fā)揮降解膠原纖維的作用，因此組織蛋白酶K在此過程中作用尤為重要[12]。本文發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶K在正畸組和微創(chuàng)組中表達有差別，提示可能微創(chuàng)組對牙周組織的作用可能稍微小一些，這可能與治療過程中破骨細胞和破牙細胞的數(shù)量等相關(guān)。

近年來，關(guān)于microRNA在生理以及病理狀態(tài)中的功能研究越來越成為生命科學領(lǐng)域研究的熱點。在成骨分化發(fā)生的第3、7、14天，miR-17的表達與在對照組出現(xiàn)明顯降低[13-15]；miR-21則能夠在拉力牽張介導的人牙周膜干細胞成骨誘導分化過程中發(fā)揮重要功能[16]；miR-155則在牙髓，牙齦和體外牙周膜細胞中呈現(xiàn)出組織依賴性的高表達[9，17-18]；在人患病牙周組織和健康的牙周組織中，miR-126，miR-32，miR-147和miR-155出現(xiàn)表達紊亂[19-20]。這提示microRNA可能參與了正畸治療牙移動過程。通過qRT-PCR對幾種microRNA表達改變的影響，肯定了miR-17和miR-21可能參與了該過程，并且生物學預測也顯示miR-17可能參與了對組織蛋白酶K的調(diào)節(jié)。

本研究結(jié)果初步顯示，與常規(guī)正畸方法相比，微創(chuàng)組中組織蛋白酶K表達水平較正畸組降低，同時伴隨有miR-17的表達升高，這表明超聲微創(chuàng)外科技術(shù)能夠促進牙周組織改建，縮短牙周組織損傷的修復過程。其促進牙周組織改建的相關(guān)因子級聯(lián)效應，有待于進一步探究。

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（收稿日期：2017-06-28） （本文編輯：鄧朝陽）endprint