韋毅銘，何 舟*，田海芬，王 警，吳妮妮，黃 靜，楊艷芳，李雪華,*，農(nóng)真真，魏 梅，潘 欣，李 果

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021；2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，廣西 南寧 530021；3.百色市人民醫(yī)院，廣西 百色 533000）

羧甲基化龍眼肉多糖制備工藝優(yōu)化及其抗氧化、免疫活性

韋毅銘1，何 舟2,*，田海芬3，王 警1，吳妮妮1，黃 靜1，楊艷芳1，李雪華1,*，農(nóng)真真1，魏 梅1，潘 欣1，李 果1

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021；2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，廣西 南寧 530021；3.百色市人民醫(yī)院，廣西 百色 533000）

利用響應(yīng)面法優(yōu)化羧甲基化龍眼肉多糖制備工藝，并測(cè)定其體外抗氧化活性，同時(shí)建立小鼠免疫低下模型，對(duì)所得多糖進(jìn)行體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)活性研究。以羧甲基取代度為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)一氯乙酸（monochloroacetic acid，MCA）濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行分析，得到羧甲基化龍眼肉多糖最佳制備條件為MCA濃度1.2 mol/L、反應(yīng)溫度73 ℃、反應(yīng)時(shí)間3.2 h，取代度可達(dá)1.053?？寡趸钚匝芯勘砻?，在質(zhì)量濃度為200～3 200 μg/m L范圍內(nèi)，龍眼肉多糖（polysaccharide from Dimocarpus longan pulp，LYP）、羧甲基化龍眼肉多糖（crboxymethylated polysaccharide from Dimocarpus longan pulp，CM-LYP）的抗氧化能力與質(zhì)量濃度呈劑量依賴關(guān)系，當(dāng)劑量質(zhì)量濃度達(dá)3 200 μg/m L時(shí)，LYP、CM-LYP對(duì)羥自由基清除率分別為（42.35±5.67）%、（84.39±4.47）%，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率分別為（51.91±5.34）%、（87.91±7.32）%，對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率分別為（67.91±5.72）%、（79.85±2.92）%、對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血的抑制率分別為（47.23±3.5）%、（54.66±2.83）%，表明羧甲基的引入增強(qiáng)了龍眼肉多糖的抗氧化活性；體內(nèi)免疫活性實(shí)驗(yàn)表明，羧甲基化龍眼肉多糖可提高免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)、促進(jìn)血清溶血素形成、提高血清和脾臟中溶菌酶含量及調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，與修飾前龍眼肉多糖相比，羧甲基化龍眼肉多糖具有更好的免疫調(diào)節(jié)作用。

龍眼肉多糖；羧甲基化；響應(yīng)面法；抗氧化活性；體內(nèi)免疫活性

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）亦稱“桂圓”，屬無(wú)患子科龍眼屬植物，最早被記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，盛產(chǎn)于我國(guó)華南地區(qū)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，龍眼具有壯陽(yáng)益氣，補(bǔ)心益脾，潤(rùn)膚美容，延年益壽等功效，可以治療或改善貧血，心悸，神經(jīng)衰弱等癥狀[1]。龍眼肉多糖（polysaccharide from Dimocarpus longan pulp，LYP）是龍眼肉中主要的活性成分之一，課題組前期研究顯示，其毒副作用低，具有良好的生物活性、免疫調(diào)節(jié)功能及抗腫瘤活性[2-5]。

多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)息息相關(guān)，對(duì)多糖進(jìn)行修飾，可得到新的具有不同活性的多糖衍生物?；瘜W(xué)、生物和物理方法是常見的修飾方法，其中化學(xué)修飾是開發(fā)多糖類藥物的一種重要方法，如針對(duì)多糖的構(gòu)效關(guān)系，對(duì)其空間結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量、活性基團(tuán)種類等進(jìn)行修飾，可改善其生物活性，甚至賦予新的生物活性[6-8]。多糖修飾的方法有很多，如硫酸化、磷酸化、乙?；⑼榛?、磺?；Ⅳ燃谆萚9-15]。其中羧甲基化由于其反應(yīng)過(guò)程具有易于控制，成本低廉，反應(yīng)產(chǎn)物無(wú)毒性等優(yōu)點(diǎn)，在多糖的結(jié)構(gòu)修飾研究中得到了廣大研究者的關(guān)注[16]。

羧甲基化修飾主要是在多糖的支鏈上引入羧甲基基團(tuán)，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，羧甲基的引入可改善多糖的生物活性[17-19]?；诖耍緦?shí)驗(yàn)對(duì)龍眼肉多糖進(jìn)行了羧甲基化修飾，并優(yōu)化其制備工藝，并對(duì)龍眼肉多糖修飾產(chǎn)物的分子質(zhì)量、抗氧化活性、體內(nèi)免疫活性等進(jìn)行測(cè)定，以期對(duì)羧甲基化龍眼肉多糖（crboxymethylated polysaccharide from Dimocarpus longan pulp，CM-LYP）理化性質(zhì)和活性的影響有初步的了解，為龍眼肉多糖的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍眼干果購(gòu)自廣西南寧交易市場(chǎng)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究所嚴(yán)克儉檢驗(yàn)員鑒定為石硤龍眼（Dimocarpus longan Lour.）。

注射用環(huán)磷酰胺（cyclophospham ide，CY） 山西普德藥業(yè)股份有限公司；紅細(xì)胞保存液、培養(yǎng)基、豚鼠血清、溶菌酶試劑盒、IFN-γ試劑盒、IL-4試劑盒 上海源葉生物科技有限公司；三氯乙酸、硫代巴比妥酸、VC、一氯乙酸（monochloroacetic acid，MCA）、鹽酸羥胺、三氯化鐵、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、30%過(guò)氧化氫溶液、木瓜蛋白酶、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、鹽酸、羥基乙酸（乙醇酸）、變色酸等均為分析純。

SPF級(jí)昆明小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，周齡6～8 周，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 儀器與設(shè)備

Lambda650型紫外-可見光分光光度計(jì)、Spectrum100型傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Perkin Elmer儀器有限公司；TDL-5A型低速臺(tái)式離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；G1362A型高效液相色譜 美國(guó)Agilent公司；A L 20 4型電子天平、X S 20 5DU十萬(wàn)分之一電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；FD-1D-50型真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；M ultiskan MK3酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 美國(guó)Thermo公司；BP190S電子分析天平 德國(guó)Startorius公司。

1.3 方法

1.3.1 LYP、CM-LYP的制備

LYP的制備按參考文獻(xiàn)[20]方法進(jìn)行。

CM-LY P的制備：取LY P 0.20 0 0 g，加入10 m L 3.0 mol/L氫氧化鈉溶液，攪拌溶解后，緩慢加入MCA，60 ℃反應(yīng)3 h后，冰乙酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 7，過(guò)濾，濾液經(jīng)透析后冷凍干燥得CM-LYP。

1.3.2 CM-LYP的多糖含量、取代度測(cè)定及結(jié)構(gòu)鑒定

LYP、CM-LYP中多糖含量測(cè)定：采用苯酚-硫酸法[21]；LYP、CM-LYP結(jié)構(gòu)測(cè)定：采用傅里葉變換紅外光譜儀[22]；LYP、CM-LYP的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定：采用高效凝膠滲透色譜法[23]；CM-LYP羧基化取代度[24]測(cè)定：采用紫外分光光度法。

1.3.3 CM-LYP制備單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn)

1.3.3.1 CM-LYP制備單因素試驗(yàn)

固定反應(yīng)溫度60 ℃，反應(yīng)時(shí)間3.0 h，測(cè)定不同MCA濃度（0.5、1、1.5、2、2.5 mol/L）對(duì)羧甲基化取代度的影響得出最佳MCA濃度；其次固定反應(yīng)時(shí)間為3.0 h，MCA濃度為1.5 mol/L，測(cè)定不同反應(yīng)溫度（40、50、60、70、80 ℃）對(duì)羧甲基化取代度的影響，得出最佳反應(yīng)溫度；最后固定溫度為70 ℃，MCA濃度為1.5 mol/L，測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間（2、2.5、3、3.5、4 h）對(duì)羧甲基化取代度的影響，得出最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.3.3.2 CM-LYP制備的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Tab le 1 Code and level of independent variables used in response surface analysis

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示，按照Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上，以羧甲基化取代度為響應(yīng)值，選取MCA濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間3 個(gè)單因素為自變量，優(yōu)化龍眼肉多糖羧甲基化的制備工藝。

1.3.4 LYP、CM-LYP的抗氧化活性測(cè)定

1.3.4.1 LYP、CM-LYP對(duì)羥自由基的清除

分別配制3 組不同濃度的樣品溶液，陽(yáng)性對(duì)照VC組溶液質(zhì)量濃度為20、40、80、160、320 μg/m L；LYP實(shí)驗(yàn)組溶液質(zhì)量濃度為200、400、800、1 600、3 200 μg/m L；CM-LYP實(shí)驗(yàn)組溶液質(zhì)量濃度為200、400、800、1 600、3 200 μg/m L。分別取1 m L樣品溶液，依次加入1 m L 9 mmol/L FeSO4溶液、1 m L 9 mmol/L水楊酸的乙醇溶液、6 m L蒸餾水，搖勻。以等體積的蒸餾水代替樣品溶液作空白對(duì)照組，以蒸餾水代替水楊酸測(cè)得吸光度（Ac）。最后加入1 m L 8.82 mmol/L H2O2溶液，37 ℃恒溫水浴反應(yīng)1 h后，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（Ax）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用清除率（I）表示，見公式（1）。以I為縱坐標(biāo)，多糖或VC質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，建立回歸方程，計(jì)算IC50。

式中：Ac為本底組（蒸餾水代替水楊酸）的吸光度； Ax為樣品組的吸光度；A0為對(duì)照組（用蒸餾水代替多糖）的吸光度。

1.3.4.2 LYP、CM-LYP對(duì)超氧陰離子自由基的清除

樣品溶液的配制同1.3.4.1節(jié)。取4.6 m L 50 mmol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液于試管中，置于25 ℃水浴中預(yù)熱20 m in后，分別加入1 m L各樣品溶液，再加入0.4 m L 10 mmol/L鄰苯三酚溶液，搖勻后，置于25℃恒溫水浴中反應(yīng)4 m in，然后加入0.1 m L 8 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，在325 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（Bx），用蒸餾水1 m L代替樣品溶液測(cè)定吸光度（B0），用蒸餾水0.4 m L代替10 mmol/L鄰苯三酚溶液測(cè)定吸光度（Bc）。清除率（E）的計(jì)算見公式（2）。

式中：Bc為本底組（蒸餾水代替鄰苯三酚）的吸光度；Bx為樣品組的吸光度；B0為對(duì)照組（蒸餾水代替樣品溶液）的吸光度。

1.3.4.3 LYP、CM-LYP對(duì)小鼠肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

分別配制3 組不同質(zhì)量濃度的樣品溶液：陽(yáng)性對(duì)照VC組溶液質(zhì)量濃度為125、250、500、1 000、2 000 μg/m L；LYP實(shí)驗(yàn)組溶液質(zhì)量濃度為250、500、1 000、2 000、4 000 μg/m L；CM-LYP實(shí)驗(yàn)組溶液質(zhì)量濃度為250、500、1 000、2 000、4 000 μg/m L。

將昆明小鼠斷頸處死后，快速取出肝臟，用冰冷生理鹽水洗凈，濾紙吸干水分后稱質(zhì)量，在冰水浴中將其研磨制成10 g/100 m L組織勻漿，高速離心后吸取上清液備用。分別移取上清液1.0 m L置于數(shù)支試管中，精密加入1.0 m L不同質(zhì)量濃度的預(yù)先配制的樣品溶液，充分搖勻，37 ℃恒溫溫孵1.5 h后，依次加入2 m L體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液，2 m L體積分?jǐn)?shù)0.67% 2-硫代巴比妥酸溶液，充分混勻后置于98 ℃水浴中反應(yīng)15 m in，離心，取上清液，在532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（Hx）。以1m L生理鹽水代替樣品溶液測(cè)定吸光度（H0）。以1 m L生理鹽水代替質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%肝勻漿測(cè)定吸光度（Hc）。每個(gè)濃度組平行測(cè)定5 份。測(cè)定結(jié)果以脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率（F）表示，抑制率的計(jì)算見公式（3）。

式中：Hc為本底組（生理鹽水代替肝勻漿）的吸光度；Hx為樣品組的吸光度；H0為對(duì)照組（生理鹽水代替樣品溶液）的吸光度。

1.3.4.4 LYP、CM-LYP對(duì)H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞溶血的影響

分別配制3 組不同質(zhì)量濃度的樣品溶液：陽(yáng)性對(duì)照VC組溶液質(zhì)量濃度為28.6、57.1、114.3、228.6、457.1 μg/m L；LYP實(shí)驗(yàn)組溶液質(zhì)量濃度為28.6、57.1、114.3、228.6、457.1 μg/m L；CM-LYP實(shí)驗(yàn)組溶液質(zhì)量濃度為28.6、57.1、114.3、228.6、457.1 μg/m L。

昆明小鼠摘除眼球后收集全血，離心，棄上清液得紅細(xì)胞，采用生理鹽水清洗，離心，用生理鹽水制成體積分?jǐn)?shù)0.5%的紅細(xì)胞懸液。取1 m L紅細(xì)胞懸液，加入1 m L不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，再加入0.2 m L 50 mmol/L H2O2溶液，37 ℃水浴溫孵1 h后，加5 m L生理鹽水稀釋，離心，取上清液，以生理鹽水為空白，在415 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（Kx）。以生理鹽水1 m L代替樣品溶液測(cè)定吸光度（K0），用生理鹽水1 m L代替0.5%紅細(xì)胞懸浮液測(cè)定吸光度（Kc）。每個(gè)質(zhì)量濃度組平行測(cè)定5 次。抑制率的計(jì)算見公式（4），并計(jì)算半數(shù)抑制溶血濃度IC50。

式中：Kc為空白對(duì)照組測(cè)定的吸光度；Kx為實(shí)驗(yàn)組測(cè)定的吸光度；K0為陽(yáng)性對(duì)照組測(cè)定的吸光度。

1.3.5 LYP、CM-LYP對(duì)小鼠體內(nèi)免疫活性測(cè)定

1.3.5.1 實(shí)驗(yàn)分組與實(shí)驗(yàn)方法

將110 只昆明小鼠（（20±2）g，雌雄各半）按體質(zhì)量隨機(jī)分為11 組，每組10 只。正常對(duì)照組：每天腹腔注射生理鹽水0.2 m L；環(huán)磷酰胺模型組（CY組）：每隔3 d腹腔注射20 mg/kg環(huán)磷酰胺一次；陽(yáng)性對(duì)照香菇多糖組：每隔3 d腹腔注射環(huán)磷酰胺一次，每天灌胃香菇多糖40 mg/kg；CM-LYP組：每隔3 d腹腔注射環(huán)磷酰胺一次，每天灌胃CM-LYP一次，分為160、80、40、20 mg/kg 4 個(gè)劑量組；LYP組：每隔3 d腹腔注射環(huán)磷酰胺一次，每天灌胃LYP一次，分為160、80、40、20 mg/kg 4 個(gè)劑量組。實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行21 d。最后一天給藥后24 h，眼球采血，將所有小鼠處死，分別測(cè)定其脾臟指數(shù)、溶菌酶、溶血素、IFN-γ和IL-4含量。

1.3.5.2 LYP、CM-LYP對(duì)免疫抑制小鼠脾臟指數(shù)的影響

將小鼠斷頸處死后摘取脾臟，將脾臟周圍的結(jié)締組織剔除干凈，用生理鹽水洗去殘留在脾臟上的血漬，用濾紙吸干脾臟表面的水分后稱質(zhì)量，并立即置于冰上，待后期處理。脾臟指數(shù)計(jì)算方法見公式（5）：

式中：m1為小鼠體質(zhì)量/g；m0為脾臟質(zhì)量/mg。

1.3.5.3 LYP、CM-LYP對(duì)免疫抑制小鼠血清中溶血素的影響

小鼠連續(xù)飼養(yǎng)至第15天后，對(duì)小鼠腹腔注射體積分?jǐn)?shù)2%綿羊紅細(xì)胞（sheep red blood cell，SRBC）溶液0.2 m L使致敏，1 h后眼球取血，2 000 r/m in離心10 m in，取血清0.2 m L，用生理鹽水稀釋50倍，置于管中，再加入3.75 m L 的體積分?jǐn)?shù)3% SRBC溶液和體積分?jǐn)?shù)10%的豚鼠血清稀釋液0.2 m L，空白組以生理鹽水作對(duì)照，然后置于25 ℃溫箱保溫1 h后，取出放入冰浴中終止反應(yīng)，1 000 r/m in離心2 m in，取上清液，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。精密吸取體積分?jǐn)?shù)2% SRBC溶液0.5 m L溶于1.5 m L蒸餾水中為100%溶血管，用生理鹽水等體積稀釋后作為50%溶血管，用酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm波長(zhǎng)處的吸光度，即得SRBC半數(shù)溶血時(shí)的OD值。樣品的半數(shù)溶血值（HC50）計(jì)算見公式（6）[25]：

1.3.5.4 LYP、CM-LYP對(duì)免疫抑制小鼠脾臟和血清中溶菌酶含量的影響

按1.3.5.2節(jié)取脾臟，與生理鹽水按料液比為1∶9（g/m L），在冰水浴中制備10%組織勻漿，5 000 r/m in離心10 m in，取沉淀，分裝后置于-20 ℃冰箱備用。用溶菌酶試劑盒測(cè)定脾臟組織和血清中溶菌酶（lysozyme，LZM）含量。

1.3.5.5 LYP、CM-LYP對(duì)免疫抑制小鼠血清中IFN-γ和IL-4含量的影響

小鼠連續(xù)飼養(yǎng)至第21天后，摘除眼球收集全血，離心，取上清液得血清。分別采用IFN-γ、IL-4試劑盒測(cè)定小鼠血清中IFN-γ和IL-4含量，操作方法按照說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 龍眼肉多糖羧甲基化修飾前后紅外光譜分析Fig. 1 FTIR spectra of LYP and CM-LYP

由圖1可以看出，CM-LYP在1 603.43、1 420.15、1 326.22 cm-1波數(shù)處出現(xiàn)了—CH2COOH的特征吸收峰，其中，1 603.43 cm-1波數(shù)處吸收峰為強(qiáng)峰，屬C—O鍵非對(duì)稱伸縮振動(dòng)；在1 420.15、1 326.22 cm-1波數(shù)處2 個(gè)峰為中強(qiáng)峰，屬羰基C＝O的對(duì)稱伸縮振動(dòng)和—CH—的變角振動(dòng)峰。說(shuō)明了羧甲基已成功引入到龍眼肉多糖的分子結(jié)構(gòu)中。

圖2 LYP、CM-LYP的高效凝膠色譜圖Fig. 2 HPGPC profi les of LYP and CM-LYP

如圖2所示，經(jīng)測(cè)定，龍眼肉多糖羧甲基化修飾前后的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為95.8%和95.2%，分子質(zhì)量分別為1.51×105D和1.29×105D。

2.2 CM-LYP制備工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 MCA濃度對(duì)羧甲基化取代度的影響

圖3 MCA濃度對(duì)取代度的影響Fig. 3 Effect of MCA concentration on degree of substitution

如圖3所示，隨著MCA濃度的逐漸升高，取代度逐漸增大，當(dāng)MCA濃度超過(guò)1.5 mol/L后，取代度下降。因此確定最優(yōu)的MCA濃度為1.5 mol/L。

2.2.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)羧甲基化取代度的影響

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)取代度的影響Fig. 4 Effect of reaction tem perature on degree of substitution

如圖4所示，在40～70 ℃范圍內(nèi)，伴隨反應(yīng)溫度的升高，取代度逐漸增大，隨著溫度的進(jìn)一步提高，取代度開始下降，因此最佳反應(yīng)溫度應(yīng)為70 ℃。

2.2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)羧甲基化取代度的影響

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)取代度的影響Fig. 5 Effect of reaction time on degree of substitution

如圖5所示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2.0～3.0 h時(shí)，取代度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，3.0 h時(shí)取代度最高，超過(guò)3.0 h時(shí)，取代度出現(xiàn)下降，因此確定最優(yōu)的反應(yīng)時(shí)間為3.0 h。

2.2.2 羧甲基化龍眼肉多糖工藝優(yōu)化

選取反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和MCA濃度為研究因素，以羧甲基化取代度為指標(biāo)，使用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.05建立三因素三水平共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn)，以優(yōu)化羧甲基化龍眼肉多糖合成條件，響應(yīng)面試驗(yàn)及方差分析結(jié)果如表2和表3所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for RSM

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果見表2，采用Design-Expert 8.06軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次方程擬合，得到以下方程：Y=1.02-0.014X1+0.10X2+0.057X3-0.10X1X2-0.042X1X3-9.750×10-3X2X3-0.052X12-0.25X22-0.11X32。

從表3可以看出，模型的顯著水平P＜0.000 1，因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著（r=0.52/0.53=0.981）。失擬項(xiàng)不顯著（P=0.708 2），說(shuō)明其他因素對(duì)取代度干擾很小，回歸模型與實(shí)際情況相符合。影響取代度大小的因素主次順序依次為反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和MCA濃度。相互影響因素中，MCA濃度與反應(yīng)溫度相互影響最為顯著。

圖6 各因素交互作用對(duì)羧甲基化取代度的影響Fig. 6 Response surface plots showing the interactive effects of reaction conditions on degree of substitution

如圖6所示，對(duì)響應(yīng)面圖進(jìn)行分析，得出最佳工藝條件為MCA濃度1.2 mol/L、反應(yīng)溫度73 ℃、反應(yīng)時(shí)間3.2 h，此時(shí)CM-LYP的羧甲基取代度達(dá)到1.057。

2.2.3 模型驗(yàn)證

為了驗(yàn)證模型的穩(wěn)定性、可行性，本實(shí)驗(yàn)固定合成工藝條件為MCA濃度1.2 mol/L、反應(yīng)溫度73℃、反應(yīng)時(shí)間3.2 h。在該工藝條件下，平行3 次對(duì)龍眼肉多糖進(jìn)行羧甲基化修飾，結(jié)果如表4所示，實(shí)際獲得的羧甲基的取代度與理論值相近，表明所建立的回歸曲線數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性較好，也證實(shí)響應(yīng)面法優(yōu)選龍眼肉多糖羧甲基化工藝結(jié)果穩(wěn)定、可行。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 4 Validation of the optim ized conditions

2.3 LYP、CM-LYP體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.3.1 LYP、CM-LYP清除羥自由基能力

如表5所示，LYP、CM-LYP均具有清除羥自由基的能力，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。從物質(zhì)的量濃度考慮，LYP、CM-LYP、VC的IC50分別為4.67×10-5、3.44×10-6、4.80×10-4mol/L，說(shuō)明羧甲基的引入可以提高LYP對(duì)羥自由基的清除能力，且優(yōu)于VC，這可能與修飾后的多糖的結(jié)構(gòu)以及羥基基團(tuán)的含量有關(guān)。

表5 LYP和CM-LYP對(duì)羥自由基的清除率（x ±s，n=5）Table 5 Percentage scavenging of hydroxyl radical by LYP and CM-LYP (x s, n= 5)

表5 LYP和CM-LYP對(duì)羥自由基的清除率（x ±s，n=5）Table 5 Percentage scavenging of hydroxyl radical by LYP and CM-LYP (x s, n= 5)

樣品 質(zhì)量濃度/（μg/m L） I/% IC50/（mol/L）200 10.42±2.64 LYP 400 21.77±5.29 800 28.63±3.76 1 600 36.90±3.97 3 200 42.35±5.67 4.67×10-5 200 31.14±5.54 CM-LYP 400 42.67±3.27 800 58.44±7.02 1 600 77.36±5.29 3 200 84.39±4.47 3.44×10-6 20 12.78±2.78 VC 40 26.65±3.02 80 48.85±3.94 160 72.23±5.66 320 82.18±3.13 4.80×10-4

2.3.2 LYP、CM-LYP清除超氧陰離子自由基能力

表6 LYP和CM-LYP對(duì)超氧陰離子自由基的清除率（x ±s，n=5）Table 6 Percentage scavenging of superoxide anion radical by LYP and CM-LYP (x s, n= 5)

表6 LYP和CM-LYP對(duì)超氧陰離子自由基的清除率（x ±s，n=5）Table 6 Percentage scavenging of superoxide anion radical by LYP and CM-LYP (x s, n= 5)

樣品 質(zhì)量濃度/（μg/m L） E/% IC50/（mol/L）200 23.76±4.14 LYP 400 34.57±3.59 800 41.78±2.77 1 600 47.23±2.87 3 200 51.91±5.34 1.88×10-5 200 33.98±6.10 CM-LYP 400 45.40±4.73 800 55.68±3.87 1 600 76.09± 5.17 3 200 87.91±7.32 3.24×10-6 20 16.44±1.85 VC 40 29.56±4.72 80 45.68±2.69 160 66.09±4.30 320 73.91±5.45 5.37×10-4

如表6所示，LYP、CM-LYP對(duì)超氧陰離子自由基的清除率與質(zhì)量濃度呈劑量相關(guān)。從物質(zhì)的量濃度考慮，LYP、CM-LYP、VC的IC50分別為1.88×10-5、3.24×10-6、5.37×10-4m o l/L，說(shuō)明羧甲基的引入可以增強(qiáng)LYP對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力，且優(yōu)于VC。

2.3.3 LYP、CM-LYP對(duì)小鼠肝勻漿脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

表7 LYP和CM-LYP對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的影響（x ±s，n=5）Tab le 7 Inhibitory effects of LYP and CM-LYP on lipid peroxidation(x s, n= 5)

表7 LYP和CM-LYP對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的影響（x ±s，n=5）Tab le 7 Inhibitory effects of LYP and CM-LYP on lipid peroxidation(x s, n= 5)

樣品 質(zhì)量濃度/（μg/m L） F/% IC50/（mol/L）250 28.98±2.91 500 44.27±3.34 LYP 1 000 51.46±4.08 7.78×10-6 2 000 63.37±3.97 4 000 67.91±5.72 250 35.81±1.86 500 50.38±3.64 CM-LYP 1 000 60.62±2.13 3.60×10-6 2 000 71.09±4.18 4 000 79.85±2.92 125 35.40±3.99 250 52.44±2.86 VC 500 67.57±6.03 1.34×10-3 1 000 76.53±5.59 2 000 88.72±5.38

如表7所示，在一定范圍內(nèi)，LYP、CM-LYP、VC均可有效抑制小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，且與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。從物質(zhì)的量濃度考慮，LYP、CM-LYP、VC的半數(shù)抑制濃度分別為7.78×10-6、3.60×10-6、1.34×10-3mol/L，表明羧甲基的引入，可增強(qiáng)LYP抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力，且優(yōu)于VC。2.3.4 LYP、CM-LYP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血的影響

表8 LYP和CM-LYP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血的影響（x±s，n=5）Table 8 Inhibitory effects of LYP and CM-LYP) on red cell hemolysis induced by H 2O2 (x s, n= 5)

表8 LYP和CM-LYP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血的影響（x±s，n=5）Table 8 Inhibitory effects of LYP and CM-LYP) on red cell hemolysis induced by H 2O2 (x s, n= 5)

樣品 質(zhì)量濃度/（μg/m L） H/% IC50/（mol/L）28.6 17.74±1.46 57.1 21.62±4.19 LYP 114.3 31.37±3.05 228.6 38.9±4.37 5.26×10-6 457.1 47.23±3.59 28.6 28.38±2.21 57.1 33.81±4.73 CM-LYP 114.3 44.35±5.17 1.74×10-6 228.6 48.45±3.55 457.1 54.66±2.83 28.6 26.05±3.83 57.1 34.15±4.05 VC 114.3 41.69±5.87 9.61×10-4 228.6 52.44±3.29 457.1 67.18±5.02

如表8所示，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，溶血抑制率逐漸升高，表明LYP、CM-LYP、VC均能抑制H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血，且其抑制能力與樣品質(zhì)量濃度呈現(xiàn)一定劑量效應(yīng)。VC、LYP、CM-LYP的IC50分別為9.61×10-4、5.26×10-6、1.74×10-6mol/L，表明羧甲基的引入增強(qiáng)了LYP的抗溶血能力，且優(yōu)于VC。

2.4 體外免疫活性

2.4.1 LYP、CM-LYP對(duì)免疫抑制小鼠脾臟指數(shù)的影響脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器官，含有大量由骨髓干細(xì)胞發(fā)育而來(lái)的B淋巴細(xì)胞，另外還有大量T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，因此脾臟參與細(xì)胞免疫、體液免疫及非特異性免疫[25]。脾臟指數(shù)能反映免疫器官的發(fā)育和免疫細(xì)胞的功能狀況，脾臟指數(shù)的高低能夠較為客觀地反映機(jī)體非特異性免疫能力[26]。

表9 LYP和CM-LYP對(duì)免疫抑制小鼠脾臟指數(shù)的影響（x ±s，n=10）Tab le 9 Effects of LYP and CM-LYP on sp leen index in immunosuppressed m ice (x s, n= 10)

表9 LYP和CM-LYP對(duì)免疫抑制小鼠脾臟指數(shù)的影響（x ±s，n=10）Tab le 9 Effects of LYP and CM-LYP on sp leen index in immunosuppressed m ice (x s, n= 10)

注：*. P＜0.05，實(shí)驗(yàn)組與CY組具有顯著差異；#. P＜0.05，實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組具有顯著差異。下表同。

組別 給藥量/（mg/kg） 脾臟指數(shù)/（mg/g）CY組 0 1.17±0.33對(duì)照組 0 2.32±0.42*香菇多糖組 40 3.19±0.37#LYP組20 1.22±0.16 40 1.48±0.25 80 2.07±0.44*160 2.46±0.21*20 1.42±0.17 40 1.85±0.23*80 2.57±0.38*160 3.10±0.42#CM-LYP組

從表9可以看出，與正常對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺模型組脾臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明本研究成功建立了環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠模型。與環(huán)磷酰胺模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照香菇多糖和不同劑量的LYP、CM-LYP均能顯著的提高免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)（P＜0.05）。說(shuō)明LYP、CM-LYP均能夠降低環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)產(chǎn)生的脾臟指數(shù)，在一定程度上可提高機(jī)體免疫力。

2.4.2 LYP、CM-LYP對(duì)免疫抑制小鼠血清溶血素的影響

以SRBC作為抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體（溶血素，即SRBC抗體），并釋放至外周血?？乖贵w相互結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，暴露出補(bǔ)體（豚鼠血清）結(jié)合點(diǎn)，激活補(bǔ)體，導(dǎo)致SRBC產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，因此，可通過(guò)測(cè)定致敏動(dòng)物血清中溶血素含量得知藥物對(duì)體液免疫的影響。

由表10可以看出，與正常對(duì)照組相比，環(huán)磷酰胺組小鼠血清的半數(shù)溶血值（HC50）顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明本研究成功建立了環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠模型。陽(yáng)性對(duì)照香菇多糖組、LYP組和CM-LYP組均能提高免疫抑制小鼠血清中的溶血素含量（P＜0.05），且這種變化呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。以上結(jié)果說(shuō)明LYP在80～160 mg/kg范圍內(nèi)、CM-LYP在40～160 mg/kg范圍內(nèi)能改善免疫抑制小鼠的體液免疫功能。

表10 LYP和CM-LYP對(duì)免疫抑制小鼠溶血素的影響（x ±s，n=10）Table 10 Effects of LYP and CM-LYP on hemolysin in serum of immunosuppressed m ice (x s, n= 10)

表10 LYP和CM-LYP對(duì)免疫抑制小鼠溶血素的影響（x ±s，n=10）Table 10 Effects of LYP and CM-LYP on hemolysin in serum of immunosuppressed m ice (x s, n= 10)

組別 給藥量/（mg/kg） HC50 CY組 0 1.17±0.33正常對(duì)照組 0 2.32±0.42*香菇多糖組 40 3.19±0.37#20 1.22±0.16 LYP組40 1.48±0.25 80 2.07±0.44*160 2.46±0.21*20 1.42±0.17 CM-LYP組40 1.85±0.23*80 2.57±0.38*160 3.10±0.42#

2.4.3 LYP、CM-LYP對(duì)免疫抑制小鼠脾臟和血清中溶菌酶的影響

LZM又稱胞壁質(zhì)酶，是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶，具有抗菌、消炎、抗病毒和增強(qiáng)免疫力等作用，其水平或活性是先天性免疫力的一個(gè)重要指標(biāo)[27]。

表11 LYP、CM-LYP對(duì)免疫抑制小鼠血清和脾臟中LZM的影響（x ±s，n=10）Table 11 Effects of CM-LYP on LZM on lysozyme activity in serum and sp leen of immunosupp ressed m ice (x s, n= 10)

表11 LYP、CM-LYP對(duì)免疫抑制小鼠血清和脾臟中LZM的影響（x ±s，n=10）Table 11 Effects of CM-LYP on LZM on lysozyme activity in serum and sp leen of immunosupp ressed m ice (x s, n= 10)

溶菌酶含量/（U/m L)血清 脾臟CY組 0 314.9±53.7 126.4±12.1正常對(duì)照組 0 443.4±66.1* 223.8±26.5*香菇多糖組 40 628.7±68.5# 256.9±33.9#組別 給藥量/（mg/kg)LYP組20 328.5±49.8 136.7±16.4 40 386.1±55.4* 154.0±15.3 80 457.6±47.9* 180.4±28.5*160 487.7±39.7* 197.8±24.2*CM-LYP組20 384.1±55.2* 177.9±18.7*40 433.6±67.8* 202.3±27.5*80 532.5±44.1* 242.7±22.5*160 566.2±67.4* 252.9±30.6*

由表11可以看出，與正常對(duì)照組比較，環(huán)磷酰胺組小鼠血清中的LZM含量顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明免疫抑制小鼠模型建立成功。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照香菇多糖組（40 mg/kg）、龍眼肉多糖組（40～160 mg/kg）、羧甲基化龍眼肉多糖組（20～160 mg/kg）均顯著地提高免疫抑制小鼠血清中L ZM水平（P＜0.05），且這種變化呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。

由表11可知，與正常對(duì)照組相比較，環(huán)磷酰胺組小鼠脾臟中的LZM含量顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明免疫抑制小鼠模型建立成功。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照香菇多糖組（40 mg/kg）、龍眼肉多糖組（80～160 mg/kg）、羧甲基化龍眼肉多糖組（20～160 mg/kg）均明顯提高免疫抑制小鼠脾臟中LZM水平（P＜0.05），且這種變化呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。以上結(jié)果說(shuō)明龍眼肉多糖羧甲基化衍生物對(duì)免疫抑制小鼠的非特異性免疫功能恢復(fù)有促進(jìn)作用。

2.4.4 LYP、CM-LYP對(duì)小鼠血清中IFN-γ和IL-4含量的影響

Th1細(xì)胞亞群與人類多種疾病的關(guān)系非常復(fù)雜且非常重要，Th1/Th2平衡失調(diào)與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展、治療等有密切的關(guān)系[28]。IFN-γ主要來(lái)自于Th1細(xì)胞的分泌，能夠激活T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以增強(qiáng)免疫功能，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫。IL-4主要由Th2細(xì)胞分泌，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，能夠促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖和活化，促進(jìn)免疫球蛋白的生成和類型轉(zhuǎn)換，從而正向調(diào)控機(jī)體的體液免疫。因此，可通過(guò)測(cè)定小鼠血清中IFN-γ、IL-4含量，得出Th1/Th2平衡情況，從而反映出LYP、CM-LYP的免疫調(diào)節(jié)活性。

LYP、CM-LYP對(duì)小鼠血清中IFN-γ含量的影響如表12所示。與空白對(duì)照組比較，CY組小鼠血清中的IFN-γ含量提升了3 倍以上（P＜0.05），主要偏向細(xì)胞免疫。隨著LYP、CM-LYP給藥劑量的增加，血清中的IFN-γ含量逐漸降低，表明Th1免疫應(yīng)答模式減弱。當(dāng)給藥劑量超過(guò)80 mg/kg時(shí)血清中的IFN-γ含量穩(wěn)定并處于正常水平（P＞0.05）。

表12 LYP、CM-LYP對(duì)免疫抑制小鼠血清中INF-γ和IL-4含量的影響（x±s，n=10）Table 12 Effects of LYP and CM-LYP on INF-γand IL-4 levels in serum of immunosuppressed m ice (x s, n= 10)

表12 LYP、CM-LYP對(duì)免疫抑制小鼠血清中INF-γ和IL-4含量的影響（x±s，n=10）Table 12 Effects of LYP and CM-LYP on INF-γand IL-4 levels in serum of immunosuppressed m ice (x s, n= 10)

IL-4質(zhì)量濃度/（pg/m L）CY組 0 178.63±13.44# 42.54±5.98#正常對(duì)照組 0 51.07±4.15* 83.87±6.75*香菇多糖組 40 51.67±4.89* 102.59±7.43*#組別 給藥量/（mg/kg)INF-γ質(zhì)量濃度/（pg/m L）LYP組20 153.83±12.37*# 43.22±5.22#40 126.47±7.81*# 57.84±5.33*#80 50.19±7.91* 70.19±7.91*#160 46.96±6.12* 97.95±8.07*#CM-LYP組20 82.19±4.73*# 62.09±5.61*#40 59.45±5.36*# 85.59±6.54*80 51.08±3.38* 93.30±5.62*#160 41.74±2.77* 115.3±7.09*#

LYP、CM-LYP對(duì)小鼠血清中IL-4含量的影響如表12所示。與空白對(duì)照組比較，CY組小鼠血清中的IL-4含量下降顯著（P＜0.05），主要偏向細(xì)胞免疫。隨著LYP、CM-LYP給藥劑量的增加，血清中的IL-4含量逐漸升高，表明Th2免疫應(yīng)答模式增強(qiáng)。當(dāng)CM-LYP給藥劑量為80 mg/kg時(shí)血清中的IL-4含量接近正常水平（P＞0.05）。綜上所述，隨著LYP、CM-LYP的給藥濃度逐漸增大，免疫抑制小鼠血清中IFN-γ、IL-4含量逐漸恢復(fù)至正常水平，即Th1/Th2趨于平衡，表明，LYP、CM-LYP對(duì)免疫抑制小鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用，且同等劑量濃度下，CM-LYP的免疫調(diào)節(jié)能力優(yōu)于LYP。

3 結(jié) 論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化CM-LYP制備工藝，以羧甲基取代度為衡量指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)MCA濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立羧甲基化取代度與各影響因素之間的回歸模型，得到CM-LYP的最佳工藝條件為MCA濃度1.2 mol/L、反應(yīng)溫度73 ℃、反應(yīng)時(shí)間3.2 h時(shí)，取代度高達(dá)1.053。

自由基是指單獨(dú)存在的、具有配對(duì)價(jià)電子的離子、原子、分子，主要包括超氧陰離子自由基、羥自由基和H2O2等。自由基性質(zhì)活潑和反應(yīng)性強(qiáng)，易造成生物膜系統(tǒng)損傷及細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化障礙，對(duì)人體的健康和壽命危害較大[29-31]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LYP、CM-LYP均能夠抑制小鼠肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化，抑制H2O2引起的紅細(xì)胞溶血，清除羥自由基和超氧陰離子自由基，且在同等質(zhì)量濃度下，CM-LYP的抗氧化活性要強(qiáng)于修飾前的LYP。

體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)給藥劑量在20～160 mg/kg范圍內(nèi)，LYP、CM-LYP均能提高免疫功能抑制小鼠的脾臟指數(shù)，促進(jìn)免疫功能抑制小鼠體內(nèi)溶血素形成，提高免疫功能抑制小鼠脾臟組織和血清中的溶菌酶含量，調(diào)節(jié)免疫抑制小鼠血清中Th1/Th2的平衡。綜上所述，CMLYP對(duì)免疫功能抑制小鼠的非特異性免疫功能、細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能均有明顯的改善和促進(jìn)作用，且在相同劑量濃度下，CM-LYP較修飾前的LYP具有更強(qiáng)的免疫活性，說(shuō)明羧甲基的引入有利于提高LYP的免疫調(diào)節(jié)活性。

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Optim ization of Preparation of Carboxymethylated Polysaccharides from Longan (Dimocarpus longan) Pulp by Response Surface Methodology and Their Antioxidant Activity and Immunoregulatory Activity

WEI Yim ing1, HE Zhou2,*, TIAN Haifen3, WANG Jing1, WU Nini1, HUANG Jing1, YANG Yanfang1,LI Xuehua1,*, NONG Zhenzhen1, WEI Mei1, PAN Xin1, LI Guo1
(1. Pharmaceutical College, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China; 2. The People’s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China; 3. The People’s Hospital of Baise, Baise 533000, China)

In this study, the carboxymethylation of polysaccharides (LYP) extracted from longan (Dimocarpus longan)pulp was investigated using monochloroacetic acid (MCA) w ith polysaccharides-to-MCA ratio, reaction time and reaction temperature as independent variables. The degree of substitution (DS) was taken as response value to optimize the important reaction conditions by response surface methodology. Meanwhile, the antioxidant activity and immunoregulatory of carboxymethlated polysaccharides (CM-LYP) in vivo were measured. The results showed that the optim ized conditions that provided the maximum DS of 1.053 were determ ined as follows: reaction time, 3.2 h; MCA concentration, 1.2 mol/L;and reaction temperature, 73 ℃. The antioxidant activity of CM-LYP was concentration dependent in a certain range of concentration. The percentage inhibition of hydroxyl and superoxide anion radicals, lipid peroxidation, red blood cell hemolysis induced by H2O2were (42.35 ± 5.67)%, (51.91 ± 5.34)%, (67.91 ± 5.72)%, and (47.23 ± 3.5)% by LYP, and(84.39 ± 4.47)%, (87.91 ± 7.32)%, and (79.85 ± 2.92)%, and (54.66 ± 2.83) % by CM-LYP, respectively, implying that the antioxidant activity of LYP was improved as compared to the native polysaccharides. The immunoregulatory activity invivo showed that CM-LYP significantly improved spleen index in immunosuppressed, increased serum hemolysin level and lysozyme activity in serum and spleen, and maintained Th1/Th2 balance, and the effect was better than that of LYP.

longan pulp polysaccharides; carboxymethylation; response surface methodology; immune activity; antioxidant activity

2017-01-06

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（桂科重12118005-1-2）；廣西教育廳專利資助項(xiàng)目（KY2015ZL020）

韋毅銘（1991—），男，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。E-mail：18260903735@163.com

*通信作者：何舟（1982—），男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事中草藥有效成分及免疫研究。E-mail：229189314@qq.com李雪華（1963—），女，教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物活性物質(zhì)提取與活性研究。E-mail：onlythankforyou@163. com

10.7506/spkx1002-6630-201722041

R284.3

A

1002-6630（2017）22-0275-09

韋毅銘, 何舟, 田海芬, 等. 羧甲基化龍眼肉多糖制備工藝優(yōu)化及其抗氧化、免疫活性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(22):275-283. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722041. http://www.spkx.net.cn

WEI Yiming, HE Zhou, TIAN Haifen, et al. Optimization of preparation of carboxymethylated polysaccharides from longan (Dimocarpus longan) pulp by response surface methodology and their antioxidant activity and immunoregulatory activity[J]. Food Science,2017, 38(22): 275-283. (in Chinese w ith English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201722041. http://www.spkx.net.cn