程 劍，林 彬，沈曉潔，劉 燕

(無(wú)錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇無(wú)錫 214028)

論著·基礎(chǔ)研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.28.006

去氫木香內(nèi)酯對(duì)人肝星狀細(xì)胞增殖及凋亡的影響研究

程 劍，林 彬△，沈曉潔，劉 燕

(無(wú)錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇無(wú)錫 214028)

目的探討去氫木香內(nèi)酯(Dehy)對(duì)人肝星狀LX-2細(xì)胞增殖及凋亡的影響，分析其可能的作用機(jī)制。方法人肝星狀LX-2細(xì)胞經(jīng)不同濃度Dehy處理后，采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LX-2細(xì)胞增殖和周期分布，Hoechst 33342染色法及AV-PI雙染法檢測(cè)LX-2細(xì)胞凋亡情況，蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果給予不同濃度的Dehy作用48 h后，能夠明顯抑制LX-2細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞周期于S、G2/M期，同時(shí)誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞的凋亡，呈濃度依賴性；Western blot結(jié)果顯示，Dehy可促進(jìn)P27、Bax的表達(dá)上調(diào)，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)。結(jié)論Dehy通過調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2和P27的表達(dá)誘導(dǎo)人肝星狀LX-2細(xì)胞的凋亡和周期的阻滯。

去氫木香內(nèi)酯；肝星狀細(xì)胞LX-2；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

肝纖維化是一個(gè)世界范圍內(nèi)的衛(wèi)生難題[1]，它是由各種致病因子所致慢性肝損傷后，肝內(nèi)實(shí)質(zhì)細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞異常增生導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積的病理過程，隨著病情的發(fā)展，將導(dǎo)致肝小葉及纖維結(jié)節(jié)的形成，最終發(fā)展成肝硬化[2-3]。所以，及時(shí)對(duì)肝纖維化進(jìn)行有效地治療顯得尤為重要。目前對(duì)肝纖維化的治療主要通過抗炎、抗病毒、減少ECM沉積等方式[4]，然而這些治療效果并不理想，尋找有效的抗纖維化的藥物及治療方法仍然是首要任務(wù)。

去氫木香內(nèi)酯(dehydrocostuslactone，Dehy)是一種倍半萜內(nèi)酯類化合物，主要從木香、木蘭、月桂樹等植物中提取出來(lái)的。我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥常使用含有木香的復(fù)方治療腫瘤，而其中抗癌的主要活性成分就是Dehy[5-6]。國(guó)內(nèi)外的眾多文獻(xiàn)報(bào)道了Dehy的抗癌作用[7-8]，研究還發(fā)現(xiàn)Dehy具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化等多方面的藥理活性[9-12]。Chen等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Dehy在低劑量條件下對(duì)肝癌細(xì)胞Hep-3B、HepA2的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)的基因表達(dá)均具有明顯的抑制作用，主要表現(xiàn)在mRNA表達(dá)量的降低，這說明Dehy具有很好的抗乙型肝炎病毒活性。而肝纖維化的一個(gè)主要的病因就是乙型肝炎病毒的感染，所以Dehy具備很好的抗肝纖維化的應(yīng)用前景。目前，Dehy對(duì)肝纖維化的影響還未見報(bào)道，本文通過研究體外條件下Dehy對(duì)肝星狀LX-2細(xì)胞的增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)而探究Dehy在肝纖維化發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人肝星狀LX-2細(xì)胞由上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。LX-2細(xì)胞于37 ℃水浴鍋中快速?gòu)?fù)蘇，接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含100 U/mL青霉素和鏈霉素)中，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%左右即可用0.25%胰酶消化，根據(jù)需要的密度進(jìn)行接種。

1.1.2藥物 Dehy購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)前配制10 mg/mL的Dehy備用原液，用二甲基亞砜(DMSO)溶解，置于4℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存，使用時(shí)再用DMEM培養(yǎng)基稀釋成需要的濃度。

1.1.3主要試劑 DMEM干粉和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，DMSO和胰蛋白酶購(gòu)自上海博光生物技術(shù)有限公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)粉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司，Hoechst 33342染色劑和細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司和上海翊圣生物科技有限公司，P27、Bax、Bcl-2抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，抗GAPDH、兔二抗購(gòu)自康成生物公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 待LX-2細(xì)胞生長(zhǎng)到80%融合度左右，用0.25%胰酶消化，800 r/min離心3 min，用10%胎牛血清重懸，于計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)胞的密度用10%胎牛血清稀釋至5 000個(gè)/100 μL，將細(xì)胞混懸液加入96孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后，每孔給予0、2、4、8、12、16、20 μg/mL的Dehy，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。處理24 h或48 h后，加入20 μL的0.5 mg/mL MTT，避光條件孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基，再加入150 μL DMSO溶解結(jié)晶，于搖床上搖15 min左右，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè)光密度值(OD值)，檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm。根據(jù)公式計(jì)算Dehy對(duì)LX-2細(xì)胞的增殖抑制能力，細(xì)胞抑制率=(1-空白對(duì)照組OD值/實(shí)驗(yàn)對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.2細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組，Dehy低、中、高3個(gè)濃度實(shí)驗(yàn)組；將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX-2細(xì)胞消化，離心，用10%胎牛血清重懸，以45萬(wàn)/皿的密度接種細(xì)胞于6 cm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁后，各組按照Dehy 0、2.5、5.0、10.0 μg/mL處理；48 h后，收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，再用75%的冰乙醇(-20 ℃預(yù)冷)固定，置于4 ℃冰箱中過夜；用預(yù)冷PBS洗3次，離心，去除乙醇，加入200 μL的PI染液重懸細(xì)胞，避光條件下反應(yīng)30 min，混勻，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3Hoechst 33342染色法觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化 分組同1.2.2；先在6孔板底部固定蓋玻片，再將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX-2細(xì)胞消化，離心，用10%胎牛血清重懸，以15萬(wàn)/孔的密度接種細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后給予Dehy 0、2.5、5.0、10.0 μg/mL)處理；48 h后，加入4%甲醛固定15 min，PBS洗凈，再加入Hoechst 33342 染料(1∶1 000)避光染色20 min，PBS洗凈，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核變化，并拍照。

1.2.4Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡 分組同1.2.2；將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX-2細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化，離心，用10% 胎牛血清重懸，以45萬(wàn)/皿的密度接種細(xì)胞于6 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜后，給予Dehy 0、2.5、5.0、10.0 μg/mL處理；48 h后，收集上清液，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，1 500 r/min離心3 min，用預(yù)冷的PBS洗3次，加入100 μL的Buffer重懸細(xì)胞，于避光條件下再分別加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI Staining Solution，混勻，4 ℃條件下反應(yīng)10 min；染色結(jié)束后在1 h內(nèi)完成上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理同上，處理48 h后，用PBS洗3次，吸凈剩余的PBS，根據(jù)細(xì)胞的密度加入一定量預(yù)先配好的蛋白裂解液(蛋白酶抑制劑混合物∶磷酸酶抑制劑∶PMSF∶RIPA為1∶1∶1∶100)于冰上裂解30 min(每隔5分鐘搖晃1次，使得細(xì)胞充分裂解)，離心收集上清液，加入1/4體積的上樣緩沖液，置于沸水中10 min，使其變性，最后放置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。根?jù)所測(cè)蛋白的分子量配制SDS-PAGE分離膠(8%、10%)，濃縮膠均為5%，每組上樣總蛋白均為30 μg，60 V電泳約30 min后，換成120 V電泳90 min；根據(jù)蛋白Mark，裁剪所需的膠帶，將蛋白按0.25 A、120 min條件轉(zhuǎn)至PVDF膜上，再用5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗孵育P27(1∶800)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000)過夜，TBST洗滌3次，孵育兔二抗(GAPDH除外)，TBST洗3次后用ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光；以GAPDH作為內(nèi)參，通過灰度分析軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1Dehy對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的抑制作用 MTT結(jié)果顯示，細(xì)胞的活性受到明顯的抑制，且隨著濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)。Dehy作用48 h的抑制率明顯高于24 h，所以后期實(shí)驗(yàn)均采用48 h檢測(cè)時(shí)間。見圖1。

圖1 Dehy對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2Dehy對(duì)LX-2細(xì)胞周期分布的影響 經(jīng)過Dehy處理后，LX-2細(xì)胞周期分布發(fā)生明顯的改變，隨著Dehy濃度的升高，S和G2/M期細(xì)胞增加，G0/G1期減少。見表1、圖2。

圖2 Dehy對(duì)LX-2細(xì)胞周期分布的影響

A:空白對(duì)照組；B：Dehy 2.5 μg/mL；C：Dehy 5.0 μg/mL；D:Dehy 10.0 μg/mL
圖3 LX-2細(xì)胞的Hoechst 33342染色

2.3Dehy對(duì)LX-2細(xì)胞凋亡的影響 給予不同劑量的Dehy處理LX-2細(xì)胞48 h后，通過Hoechst 33342染色發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組細(xì)胞核染色均勻，熒光較弱且呈現(xiàn)彌散狀態(tài)，沒有表現(xiàn)出明顯的凋亡現(xiàn)象；實(shí)驗(yàn)組中，隨著給藥劑量的增加，熒光強(qiáng)度越來(lái)越強(qiáng)，且可觀察到細(xì)胞核呈現(xiàn)固縮狀態(tài)，表現(xiàn)出明顯的凋亡現(xiàn)象，見圖3。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示，隨著濃度的增加，凋亡率逐漸上升，見圖4。

表1 Dehy對(duì)LX-2細(xì)胞周期分布的影響

*:P<0.05，與空白對(duì)照組比較

*:P<0.05，與空白對(duì)照組比較
圖4 Dehy對(duì)LX-2細(xì)胞凋亡的影響

*:P<0.05，與空白對(duì)照組比較
圖5 Dehy對(duì)LX-2細(xì)胞的Bcl-2、P27及Bax表達(dá)的影響

2.4Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，周期相關(guān)蛋白P27、促凋亡蛋白Bax的表達(dá)上調(diào)，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)。見圖 5。

3 討 論

肝纖維化是酒精，非酒精性脂肪肝，乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染等慢性肝損傷發(fā)展而來(lái)，最終導(dǎo)致肝硬化，影響肝臟的功能和代謝。在肝纖維化發(fā)展的過程中，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活被認(rèn)為是肝纖維化時(shí)過量ECM 的主要來(lái)源[13]。所以，抑制或者逆轉(zhuǎn)HSC的激活是肝纖維化治療的主要靶點(diǎn)，而增殖是HSC激活的主要標(biāo)志，所以可通過抑制HSC的增殖或誘導(dǎo)其凋亡，阻止HSC的激活，從而減緩肝纖維化的發(fā)展進(jìn)程。Dehy是菊科植物木香中分離所得的倍半萜內(nèi)酯類化合物，本實(shí)驗(yàn)主要研究Dehy對(duì)人肝星狀LX-2細(xì)胞的增殖及凋亡的作用，并探討可能的分子機(jī)制。

筆者通過MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Dehy對(duì)人肝星狀LX-2細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，隨著濃度的增加，抑制作用越明顯，且作用48 h的抑制率明顯高于24 h。肝纖維化的一個(gè)主要特征就是細(xì)胞異常增殖，而細(xì)胞的增殖與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)。細(xì)胞周期是指持續(xù)分裂的細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的整個(gè)過程。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的增加，S、G2/M期細(xì)胞逐漸增多，G0/G1期細(xì)胞明顯減少，說明Dehy可以阻滯細(xì)胞周期于S、G2/M，從而抑制了LX-2細(xì)胞的增殖。抑制增殖的另一個(gè)主要原因是細(xì)胞凋亡，本研究結(jié)果表明，Dehy可以誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞的凋亡，且呈劑量依賴性。

為了進(jìn)一步研究Dehy誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞凋亡及周期阻滯的分子機(jī)制，筆者檢測(cè)了相關(guān)蛋白的表達(dá)。P27是細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子家族中的一員，該蛋白能夠結(jié)合并阻止細(xì)胞周期素E-CDK2或細(xì)胞周期素D-CDK4復(fù)合物的激活，因此能夠抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，影響細(xì)胞生長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞周期行使負(fù)調(diào)控作用，是一種抑癌基因[14]。結(jié)果顯示，Dehy作用于LX-2細(xì)胞后P27蛋白的表達(dá)上調(diào)，并且呈劑量依賴性，說明P27參與了細(xì)胞周期阻滯作用，從而抑制了LX-2細(xì)胞的增殖。Bax和Bcl-2屬于Bcl-2家族蛋白，是線粒體凋亡途徑中最主要的調(diào)控因子，主要表現(xiàn)對(duì)線粒體膜通透性和膜電位的影響[15]。Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)過Dehy處理后的細(xì)胞，其Bcl-2的表達(dá)明顯減少，Bax的表達(dá)呈劑量依賴性增加，因此，推測(cè)Dehy可能是通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)影響細(xì)胞的凋亡。

本研究表明，Dehy可以通過調(diào)節(jié)P27、Bcl-2和Bax的表達(dá)，影響人肝星狀LX-2細(xì)胞的周期阻滯和凋亡，從而抑制其增殖的作用，而其具體的分子調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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Effectofdehydrocostuslactoneonproliferationandapoptosisinhepaticstellatecells

ChengJian,LinBin△,ShenXiaojie,LiuYan

(WuxiSeniorHealthVocationalTechnologySchool,Wuxi,Jiangsu214028,China)

ObjectiveTo investigate the effects of dehydrocostuslactone(Dehy) on human hepatic stellate LX-2 cells proliferation,apoptosis and the possible related mechanisms.MethodsAfter treating the LX-2 cells by different concentrations of Dehy,the MTT assay and flow cytometry were used to assess the influence of Dehy on cell proliferation and cycle distribution of LX-2 cells.The Hoechst 33342 staining and AV-PI dual staining were used to detect the effect of Dehy on cell apoptosis in LX-2 cells.The apoptosis related proteins expression was detected by Western blot.ResultsAfter different concentrations of Dehy acting for 48 h could significantly inhibit the proliferation of LX-2 cells,blocked the cellular cycle at stage S and G2/M,meanwhile induced LX-2 cells apoptosis in the concentration dependent manner;Western blot results showed that Dehy could promote the up-regulation of P27 and bax expression and down-regulation of Bcl-2.ConclusionDehy induces human liver LX-2 cells apoptosis and cell cycle arrest by adjusting the expression of Bax,Bcl-2 and P27.

dehydrocostuslactone;hepatic stellate cells;cell cycle;apoptosis

程劍(1967-)，教授，碩士，主要從事腫瘤與病理方向研究?！?/p>

，E-mail:529733809@qq.com。

R364.3

A

1671-8348(2017)28-3906-03

2017-05-22

2017-07-10)

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.28.008