●劉翠芳

Survivin基因調(diào)節(jié)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲與遷移機(jī)制的探討

●劉翠芳

目的：檢測(cè)并研究Survivin基因?qū)251及U87神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲及遷移的影響，為膠質(zhì)瘤的基因治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：（1）通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞在干擾及過(guò)表達(dá)Survivin膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的變化；（2）通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞在干擾及過(guò)表達(dá)Survivin膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的變化；（3）通過(guò)Westernblot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞在干擾Survivin 48h后N-cadherin表達(dá)及定位的變化；（4）通過(guò)明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在干擾及過(guò)表達(dá)Survivin 48h后細(xì)胞分泌MMP的變化。結(jié)果：（1）針對(duì)Survivin特異性的三條siRNAoligo，干擾效率達(dá)70%-80%；過(guò)表達(dá)后轉(zhuǎn)染率在80%左右；（2）劃痕實(shí)驗(yàn)Transwell實(shí)驗(yàn)（不鋪膠）證實(shí)轉(zhuǎn)染siRNAoligo和過(guò)表達(dá)Survivin后細(xì)胞遷移數(shù)目明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染siRNAoligo和過(guò)表達(dá)Survivin后穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)目明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)；（3）Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染siRNAoligo和過(guò)表達(dá)Survivin后細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯低于對(duì)照組(P＜0.01)；（4）明膠酶譜證實(shí)轉(zhuǎn)染siRNAoligo后細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬酶低于對(duì)照組，而過(guò)表達(dá)Survivin后高于對(duì)照組；明膠酶譜實(shí)驗(yàn)顯示：與對(duì)照組相比，siRNAoligo組MMP2的活性明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論：（1）Survivin基因調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力；（2）Survivin基因通過(guò)調(diào)節(jié)MMP2的分泌來(lái)影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力；

神經(jīng)膠質(zhì)瘤；Survivin；細(xì)胞遷移；細(xì)胞侵襲；基質(zhì)金屬酶

腦膠質(zhì)瘤是臨床最為常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的46%，占成年人全身腫瘤的2%；惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)病率為5～8/100萬(wàn)。在世界范圍內(nèi)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)、死亡率最高的原發(fā)性腦腫瘤之一[1]，是威脅人類生命健康最主要的疾病之一，約占全部原發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤40～60%，年發(fā)病率5～10/10萬(wàn)[2]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

引物：質(zhì)粒PG-survivin、PG由武漢晶賽生物公司合成并測(cè)序。

Survivin干擾序列為∶GGA CCA CCG CAT CTC TAC A。

β-actin：上游引物：5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’

下游引物：5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3’

針對(duì)人Survivin基因特異性的三條siRNAoligo：

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染(按Lipofectamine?2000說(shuō)明書(shū)操作)

1.2.2 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

1.2.3 細(xì)胞體外侵襲試驗(yàn)

1.2.4 細(xì)胞體外遷移試驗(yàn)

Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室的上室不鋪設(shè)Matrigel膠，其余方法步驟同4。

1.2.5 明膠酶譜試驗(yàn)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義及作圖軟件

用于分析統(tǒng)計(jì)及作圖軟件為Image J、SPSS19.0、Adobe Illustrator CS4等，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（±s )表示，統(tǒng)計(jì)分析方法采用選用兩樣本 t檢驗(yàn)和單因素方差分析(One-way ANOVA)， ?P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，?? P＜0.01，有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 在U251細(xì)胞中Survivin干擾、過(guò)表達(dá)效果的檢測(cè)

針對(duì)Survivin基因設(shè)計(jì)三條高特異性siRNA oligo，并請(qǐng)Genema公司合成，分別為Survivin-siRNA1、Survivin-siRNA2和Survivin-siRNA3。如圖1

圖1

2.2 轉(zhuǎn)染小干擾及過(guò)表達(dá)Survivin基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞系U251遷移能力的影響

為研究Survivin對(duì)細(xì)胞遷移的影響，首先采用劃痕實(shí)驗(yàn)，如圖1C所示，劃痕48h后陰性對(duì)照組劃痕已明顯縮小，并且有融合的趨勢(shì)，而轉(zhuǎn)染小干擾組的劃痕無(wú)明顯愈合，也無(wú)融合趨勢(shì)。如表1

表1 轉(zhuǎn)染siRNA后不同時(shí)間段劃痕實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組的比值

2.3 Survivin基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞系U251侵襲能力的影響

以上結(jié)果表明Survivin基因可增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力，那么FRK是否對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力產(chǎn)生影響？為此利用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步的探討。結(jié)果示：與陰性對(duì)照相比，干擾組細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少；而與空載體組相比，過(guò)表達(dá)Survivin組細(xì)胞侵襲能力明顯增加。如表2

表2 染siRNAoligo及過(guò)表達(dá)不同時(shí)間段后Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組的比值

3 討論

細(xì)胞遷移和侵襲是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，這個(gè)過(guò)程需要很多蛋白的調(diào)節(jié)。惡性腫瘤的發(fā)生和惡性進(jìn)展是一個(gè)逐步積累、多基因改變的多步驟過(guò)程，惡性腫瘤常表現(xiàn)出細(xì)胞無(wú)限增殖、凋亡減少、細(xì)胞周期調(diào)控異常、大量新生血管形成、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特征，膠質(zhì)瘤也表現(xiàn)出惡性腫瘤的常見(jiàn)特征。

結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組相比，干擾組MMP2活性在轉(zhuǎn)染48h時(shí)明顯降低，而MMP9活性未檢測(cè)出。提示在U251細(xì)胞中干擾Survivin基因，可以降低MMP2蛋白的活性，下調(diào)MMP2的分泌，進(jìn)而抑制了其遷移與侵襲的能力。

（作者單位：濱州醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室、東營(yíng)市人民醫(yī)院）

[1]Kleihues P, Louis DN, Scheithauer BW, et al.The WHO classification of tumors of the nervous system [J] .Neuropathol Exp Neurol, 2001.61∶215-225