吳杰儒，李俊明，廖燦

(1、江西省婦幼保健院，江西 南昌330006；2、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006)

共刺激分子CD28及CTLA-4的表達(dá)與不明原因反復(fù)流產(chǎn)的相關(guān)性研究

吳杰儒1，李俊明2，廖燦1

(1、江西省婦幼保健院，江西 南昌330006；2、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006)

目的 探討CD28、CTLA-4在母胎界面的表達(dá)與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn) (URSA)的關(guān)系。方法 采集20例診斷為URSA的患者(URSA組)和20例正常早孕婦女(正常對(duì)照組)的部分蛻膜組織，采用Real-Time PCR檢測蛻膜組織中CD28、CTLA-4mRNA的表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)檢測蛻膜組織CD3+T細(xì)胞中CD28、CTLA-4的表達(dá)。結(jié)果 蛻膜組織中CD28mRNA的相對(duì)表達(dá)量 URSA組 （8.51×10-6±4.97×10-6） 較正常對(duì)照組高 （6.82×10-6±7.02×10-6）， 但無顯著差異。 蛻膜組織中 CTLA-4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量 URSA 組（2.35×10-4±3.17×10-4）較正常對(duì)照組（2.09×10-5±2.79×10-5）顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；URSA組CD28/CTLA-4比值顯著降低（P＜0.05）。蛻膜組織中CD3+CD28+T淋巴細(xì)胞亞群URSA組（65.0±7.15%）高于正常對(duì)照組（59.2±4.51%），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。蛻膜組織中CD3+CTLA-4+T淋巴細(xì)胞亞群URSA組（4.54±3.95%）高于對(duì)照組（2.11±1.57%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 蛻膜組織中CD28/CTLA-4的表達(dá)異?？赡芘cURSA的發(fā)病具有密切關(guān)系。

CD28；CTLA-4；原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)；蛻膜組織

自然流產(chǎn)是妊娠的常見結(jié)局之一，自然流產(chǎn)給每一個(gè)家庭和女性本身都帶來很大的困擾，自然流產(chǎn)發(fā)生的危險(xiǎn)隨著妊娠丟失次數(shù)的增加而增加，其復(fù)發(fā)率受多種因素影響。除常見的胚胎染色體異常、生殖道解剖異常、內(nèi)分泌異常、自身免疫疾病以及感染等因素外，臨床上40%～50%的患者流產(chǎn)原因不明確，稱為不明原因反復(fù)流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）。 隨著相關(guān)研究的不斷深入，不明原因反復(fù)流產(chǎn)80%以上都與免疫因素有關(guān)，主要與妊娠免疫耐受失衡相關(guān)[1]。本研究采用RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)URSA患者和正常早孕婦女的蛻膜組織中CD28、CTLA-4的表達(dá)進(jìn)行檢測分析，以探討其表達(dá)情況與URSA發(fā)生中的作用和意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象URSA實(shí)驗(yàn)組選擇2015年7月至2016年6月期間在江西省婦幼保健院就診同意納入研究的URSA患者?；颊呒韧鶡o活產(chǎn)史，均排除染色體異常、生殖道解剖異常、內(nèi)分泌異常、自身免疫性抗體、ABO血型不合、凝血功能異常以及感染等因素；經(jīng)臨床癥狀、婦科檢查、尿HCG、B超診斷為早期胚胎停止發(fā)育或難免流產(chǎn)者，年齡30.2±3.1歲，孕周8.3±2.5周，孕次3.2±0.6次。另選取選擇同期要求行人工流產(chǎn)的正常健康早孕婦女20例作為對(duì)照。對(duì)照組婦女既往均有活產(chǎn)史，無自然流產(chǎn)、死胎或死產(chǎn)史；排除染色體異常、內(nèi)分泌紊亂、生殖道感染以及自身免疫性疾??；孕期無腹痛及陰道出血；B超提示胚胎發(fā)育正常。年齡27.5±3.8歲，孕周 7.8±2.2周，孕次 2.5±0.5次。

1.2 標(biāo)本采集無菌采集研究對(duì)象的部分蛻膜組織，以磷酸緩沖液（PBS）浸泡，一部分置入含有RNA保存液的冷凍管中，4℃過夜后置-80℃保存?zhèn)溆?，另一部分?～4h內(nèi)進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞的分離。

1.3 蛻膜組織單個(gè)核細(xì)胞的分離和檢測無菌采集蛻膜組織后，PBS漂洗后用眼科剪分離成大約100mg大小，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾后，獲取細(xì)胞懸液。離心后用Ficoll分離液梯度離心得到白色絮狀細(xì)胞層，再裂解紅細(xì)胞，離心洗滌得到蛻膜組織單個(gè)核細(xì)胞。然后分別用藻紅蛋白-得克薩斯紅(ECD)、異硫氰酸熒光素（FITC）、藻紅蛋白（PE）標(biāo)記（美國eBioscience公司），同時(shí)設(shè)同型對(duì)照抗體；混勻后避光孵育30min，PBS洗滌，重懸后上機(jī) （貝克曼FC500）。

1.4 RT-PCR檢測蛻膜組織中CD28/CTLA-4基因的表達(dá)取蛻膜組織約100mg，加入1ml TRIzol（Ambion公司）后勻漿，提取RNA，提取后的樣本以260/280nm檢測吸光度以判定純度。按Takara試劑說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR反應(yīng)。CD28引物序列：5'-CTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGT-3'（上游）；5'-CATAGGGCTGGTAATGCTTGCGGGT-3'（下游）；CTLA-4 引物序列：5'-CATGATGGGGA ATGAGTTGA-3' （上游）；5'-AGGTAGTATGGCGGTGGGTA-3'（下游）；每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)復(fù)孔。結(jié)果采用2-△Ct法分析蛻膜組織中CD28/CTLA-4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 FCM分析用流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞表面共刺激分子，先在FSC和SSC二位點(diǎn)陣圖選取淋巴細(xì)胞區(qū)域，然后再以FL1(FITC)和FL2(PE)分別檢測FITC和PE陽性的CD3+T淋巴細(xì)胞表面共刺激分子的表達(dá)，每個(gè)樣本測定30000個(gè)細(xì)胞數(shù)。用flowjo軟件分析相關(guān)檢測數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Student's t-test方法對(duì)平均數(shù)之間的差異進(jìn)行對(duì)比分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD28mRNA、CTLA-4mRNA在URSA組和正常對(duì)照組蛻膜組織中的表達(dá)及其比值分析 URSA組中CD28mRNA的相對(duì)表達(dá)量較正常組增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，URSA組中CTLA-4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常組 （P＜0.05），URSA組CD28/CTLA-4比值顯著小于正常對(duì)照組 （P＜0.05）。 見表 1。

表1 CD28m RNA、CTLA-4 mRNA在蛻膜組織中的相對(duì)表達(dá)量及CD28/CTLA-4比值

2.2 CD28、CGTLA-4 及 CD28/CTLA-4 比值在URSA組、正常對(duì)照組人群在蛻膜組織CD3+T細(xì)胞上表達(dá)比例分析 URSA組患者CD3+CD28+T細(xì)胞表達(dá)比例高于正常對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），URSA 組患者 CD3+CTLA-4+表達(dá)比例高于正常對(duì)照組 （P＜0.05），CD28/CTLA-4 比值顯著降低（P＜0.05）。 見表 2、圖 1。

3 討論

表2 CD28、CGTLA-4及CD28/CTLA-4比值在蛻膜組織CD3+T細(xì)胞表達(dá)比例

圖1 流式細(xì)胞技術(shù)檢測CD3+T淋巴細(xì)胞上CD28、CTLA-4的表達(dá)

正常妊娠過程中，胚胎可以看作是一種特殊的同種異體移植物。有研究顯示，正常的妊娠建立和維持取決于母體免疫系統(tǒng)尤其是子宮局部的免疫細(xì)胞能否識(shí)別并耐受胚胎抗原，而母體免疫系統(tǒng)對(duì)胚胎的識(shí)別受免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。大量研究表明[2-4]，正常妊娠免疫主要以Th2型細(xì)胞因子介導(dǎo)的體液免疫為主，Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等介導(dǎo)B細(xì)胞增殖、抗體產(chǎn)生和同種排斥反應(yīng)的免疫耐受。而妊娠失敗主要由Th1型細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞免疫所致，Th1主要分泌IL-2、IFN-α、TNF-β 等，有免疫殺傷作用。T 細(xì)胞作為主要的免疫細(xì)胞在免疫耐受中起著重要作用，在獲得性免疫應(yīng)答的起點(diǎn)和核心。根據(jù)免疫雙信號(hào)學(xué)說，參與獲得性免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞T淋巴細(xì)胞的活化需要兩個(gè)信號(hào)系統(tǒng)共同參與。第一信號(hào)由抗原提呈細(xì)胞表面的MHC/Ag復(fù)合物與相應(yīng)細(xì)胞的抗原識(shí)別受體 (如T淋巴細(xì)胞的TCR/CD3)結(jié)合后提供，第二信號(hào)則由APC上的共刺激分子與淋巴細(xì)胞上相應(yīng)的受體結(jié)合后介導(dǎo)。研究證明，淋巴細(xì)胞接觸MHC/Ag復(fù)合物后可能產(chǎn)生兩種截然不同的后果：⑴增殖、分化為不同的效應(yīng)細(xì)胞；⑵無反應(yīng)性或凋亡。這兩種結(jié)果的出現(xiàn)以及T細(xì)胞分化的方向主要決定于APC所傳遞的共刺激信號(hào)。

CD28/CTLA-4作為最重要的共刺激分子功能各有不同，CD28與B7結(jié)合后激活T細(xì)胞，促進(jìn)T細(xì)胞克隆增殖；CTLA-4則相反是T細(xì)胞活化的抑制性分子。CD28在T細(xì)胞上為組成性表達(dá)，在靜息和活化狀態(tài)下都有表達(dá)，當(dāng)它與B7結(jié)合以后能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子及其受體的表達(dá)。CTLA-4則不同，在靜息的T細(xì)胞上幾乎不表達(dá)，當(dāng)T細(xì)胞被激活時(shí)，CTLA-4會(huì)出現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，負(fù)調(diào)節(jié)共刺激信號(hào)，行使對(duì)T細(xì)胞自我穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)[5]。CD28和CTLA-4與B7的結(jié)合反應(yīng)了免疫的精細(xì)調(diào)節(jié)，即T細(xì)胞免疫應(yīng)答開始時(shí)需要CD28的介導(dǎo)，而CTLA-4則對(duì)過度活化的T細(xì)胞起到抑制作用，使整個(gè)免疫應(yīng)答處于平衡狀態(tài)。CTLA-4除了傳遞負(fù)性調(diào)節(jié)信號(hào)還起到其他免疫調(diào)節(jié)作用：⑴可提高T細(xì)胞活化的閾值，避免發(fā)生自身免疫反應(yīng)[6，7]；⑵參與Th2細(xì)胞的分化，在缺乏CTLA-4的情況下，初始T細(xì)胞優(yōu)先向Th2分化，并分泌較高水平的IL-4、IL-5、IL-10[8，9]。 CTLA-4 的抑制機(jī)制也分為兩種，在免疫起始階段低水平表達(dá)時(shí)借助TCR處于激活狀態(tài)與胞內(nèi)信使分子SHP-2、PP2A等直接傳遞抑制性信號(hào)；當(dāng)CTLA-4高表達(dá)時(shí)可直接與CD28競爭結(jié)合B7分子，結(jié)合后阻斷CD28分子作用發(fā)揮，通過導(dǎo)致T細(xì)胞的無能或凋亡使免疫反應(yīng)終止[10]。

本研究通過檢測URSA患者蛻膜組織mRNA和蛻膜組織中CD3+T細(xì)胞上CD28、CTLA-4的表達(dá)發(fā)現(xiàn)。URSA組的CD3+CD28+表達(dá)高于正常對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CD3+CTLA-4+也高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明CD3+CTLA-4+的高表達(dá)與URSA的發(fā)生相關(guān)，而CD3+CD28+表達(dá)無差異與URSA的發(fā)生不具有直接的相關(guān)性。在普遍的認(rèn)識(shí)中，CD28是正向調(diào)節(jié)的共刺激分子，根據(jù)這個(gè)推論在URSA患者蛻膜組織中浸潤的T細(xì)胞應(yīng)該高表達(dá)CD28，局部T細(xì)胞過度活化導(dǎo)致URSA的發(fā)生。而本研究的結(jié)果CD28雖然在URSA組高于對(duì)照組但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明正常妊娠婦女蛻膜組織中的CD28也處于活化狀態(tài)。這與我們所認(rèn)知的CD28和CTLA-4所具備的功能不符。在自身免疫疾病中往往表現(xiàn)為CD28高表達(dá)、T細(xì)胞過度激活而CTLA-4低表達(dá)，這類自身免疫疾病的機(jī)理得到廣泛承認(rèn)，而在移植排斥反應(yīng)中，非急性排斥反應(yīng)和急性反應(yīng)相比共刺激分子活性較低[11]。本研究的結(jié)果不符可能與URSA的發(fā)病機(jī)理不同有關(guān)，且不排除還受其他因素影響。其次本研究的樣本數(shù)不大可能也會(huì)影響研究結(jié)果。本研究的樣本都是在刮宮后兩小時(shí)取得的，從免疫學(xué)的角度來看，這些樣本應(yīng)該是發(fā)生了排斥反應(yīng)共刺激分子應(yīng)該處于高表達(dá)狀態(tài)。現(xiàn)代生殖免疫學(xué)認(rèn)為[12]，正常的妊娠母胎之間是處于免疫耐受的，以保證妊娠順利進(jìn)行；而免疫耐受需要適量的免疫識(shí)別和免疫反應(yīng)，這種適量的免疫識(shí)別、反應(yīng)引起的免疫耐受是一個(gè)主動(dòng)的免疫過程，所以T細(xì)胞是產(chǎn)生免疫耐受的重要環(huán)節(jié)。在正常情況下CD28表達(dá)的增加，引起的T細(xì)胞活性增加，不會(huì)對(duì)胎兒直接進(jìn)行排斥反應(yīng)而是通過多因素調(diào)節(jié)維持宮內(nèi)的免疫耐受平衡狀態(tài)，是有利于妊娠進(jìn)行的。而CTLA-4在URSA組的高表達(dá)反映了，在URSA患者中T細(xì)胞的功能反而被抑制了。由于CD28/CTLA-4具有共同的配體B7，我們單獨(dú)比較CD28和CTLA-4對(duì)于解釋T細(xì)胞的功能，會(huì)受到許多因素的干擾。所以本研究把CD28/CTLA-4的比值再做比較，通過比較正負(fù)調(diào)節(jié)因子的比值來解釋T細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)方向以減少干擾因素，另一方面對(duì)于同一患者采用比值來比較更能說明對(duì)T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。如某個(gè)體的CTLA-4很高，但CD28也很高，它的抑制作用肯定不如CTLA-4表達(dá)很高而CD28表達(dá)一般的那么強(qiáng)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)CD28/CTLA-4比值URSA組顯著低于正常對(duì)照組，這提示我們?cè)赨RSA組中母胎界面的T細(xì)胞功能是處于相對(duì)抑制狀態(tài)的，而正常對(duì)照組中處于相對(duì)活躍狀態(tài)。這也證明在孕期母體對(duì)胎兒的同種異體抗原進(jìn)行免疫識(shí)別和免疫應(yīng)答，來誘導(dǎo)維持正常妊娠的免疫耐受，免疫耐受并不是完全不接觸抗原，而是要接觸識(shí)別抗原，然后再通過各種環(huán)節(jié)作用，使母體再次識(shí)別抗原時(shí)不產(chǎn)生免疫效應(yīng)，這個(gè)過程也是個(gè)主動(dòng)的免疫過程。

也有研究顯示在URSA患者中CD28是高表達(dá)而CTLA-4是弱表達(dá)的。如張利群等人研究[8]表明URSA組蛻膜組織的CTLA-4是顯著低于妊娠組的；劉堂兵等人研究[14]發(fā)現(xiàn)孕早期自然流產(chǎn)患者的外周血CD28分子顯著高于早孕期正常妊娠者。還有研究[15]發(fā)現(xiàn)通過干預(yù)共刺激分子信號(hào)使CD28表達(dá)下調(diào)和CTLA-4表達(dá)上調(diào)能顯著降低自然流產(chǎn)模型的胚胎吸收率。以上研究顯示在母胎界面CD28的高表達(dá)和CTLA-4的低表達(dá)造成了局部或外周血T細(xì)胞過度活化導(dǎo)致疾病的發(fā)生。這說明在整個(gè)妊娠過程中，免疫耐受的產(chǎn)生和平衡的維持都很重要。不管是T細(xì)胞被相對(duì)抑制造成免疫耐受沒能正常適度發(fā)生還是T細(xì)胞過度活化導(dǎo)致免疫反應(yīng)過度對(duì)胎兒造成排斥都有可能導(dǎo)致URSA的發(fā)生。同時(shí)T細(xì)胞的分化既影響Th1/Th2的偏移也反過來受其影響，而T細(xì)胞又受共刺激分子的作用而發(fā)生分化。CTLA-4的高表達(dá)與B7結(jié)合誘導(dǎo)T細(xì)胞Th1極化，Th1型細(xì)胞因子對(duì)正常妊娠的維持是不利的。

總的來說URSA的發(fā)生受多因素共同作用影響，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。受條件限制本研究只從CD28和CTLA-4方面入手，發(fā)現(xiàn)相比CD28，CTLA-4在URSA發(fā)生中起到更重要的作用，同時(shí)CD28/CTLA-4比值提示我們局部T細(xì)胞被相對(duì)抑制也可能會(huì)導(dǎo)致URSA的發(fā)生。通過調(diào)節(jié)共刺激分子通路，使T細(xì)胞的免疫功能正常發(fā)揮，保持母胎免疫耐受的平衡，可作為研究共刺激分子與URSA患者相關(guān)性的新方向。

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R714.21，R446.62，R523

A

1674-1129(2017)05-0667-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.010

江西省衛(wèi)生計(jì)生委科技計(jì)劃（項(xiàng)目編號(hào)：20165454）

吳杰儒，男，1983年生，主管技師碩士研究生，檢驗(yàn)科，主要從事臨床免疫檢驗(yàn)診斷學(xué)的研究。

2017-01-20；

2017-08-09)