超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮?dú)埩袅?/h1>
2017-10-20 03:27:48周迎春王林裴劉少博華向美劉會(huì)凌彭新然
肉類研究 2017年9期
周迎春++王林裴++劉少博++華向美++劉會(huì)凌++彭新然
摘 要：基于降低樣品的基質(zhì)效應(yīng)、提高回收率和方法效率，建立采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法測(cè)定動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康姆椒?。分別對(duì)樣品的提取溶劑和凈化方法進(jìn)行優(yōu)化，然后用UPLC-MS/MS儀進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：采用乙腈作為提取溶劑、C18固相萃取柱經(jīng)甲醇活化后直接上樣，且上樣量為5 mL時(shí)的凈化效果最佳。在此條件下，甲基睪丸酮在1～50 ng/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，R2≥0.998，方法檢出限為0.3 μg/kg，定量限為
1.0 μg/kg；以甲基睪丸酮的添加量分別為1.0、2.0、10.0、40.0 μg/kg的水平進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，回收率在70.60%～112.41%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD）為4.33%～9.26%。本方法操作簡便、成本低、靈敏度高，適用于批量動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮的殘留量檢測(cè)。
關(guān)鍵詞：甲基睪丸酮；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；動(dòng)物源性食品；固相萃取
Determination of Methyl Testosterone Residues in Foods of Animal Origin by Using Ultra Performance
Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
ZHOU Yingchun1， WANG Linpei1， LIU Shaobo2， HUA Xiangmei1， LIU Huiling1， PENG Xinran1
（1.Luohe Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Luohe 462300， China；
2.Cargill Food （Luohe） Co. Ltd.， Luohe 462300， China）
Abstract： An efficient method for the determination of methyl testosterone residues in foods of animal origin with low matrix effect and high recovery was presented by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS-MS）. Samples were extracted with acetonitrile， and the extract was cleaned up on a C18 solid phase extraction column （SPE-C18）， concentrated by nitrogen gas blowing， detected by UPLC-MS-MS and quantitated by external standard method. The calibration curve for methyl testosterone exhibited a good linearity with R2 higher than 0.998. The limit of detection （LOD） was 0.3 μg/kg， and the limit of quantification （LOQ） was 1.0 μg/kg. The recoveries of methyl testosterone in spiked samples were in the range of 70.60%–112.41% at spiked levels of 1.0， 2.0， 10.0 and 40.0 μg/kg， with relative standard deviations （RSD） between 4.33% to 9.26%. This method was simple， low-cost， sensitive and suitable for the batch determination of methyl testosterone residues in foods of animal origin.
Key words： methyl testosterone； ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry； foods of animal origin； solid phase extraction
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709011
中圖分類號(hào)：O657.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2017）09-0063-06
引文格式：
周迎春， 王林裴， 劉少博， 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮?dú)埩袅縖J]. 肉類研究， 2017， 31（9）： 63-68. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709011. http：//www.rlyj.pub
ZHOU Yingchun， WANG Linpei， LIU Shaobo， et al. Determination of methyl testosterone residues in foods of animal origin by using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2017， 31（9）： 63-68. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709011. http：//www.rlyj.pubendprint
甲基睪丸酮屬于人工合成雄性激素，在動(dòng)物的苗種培育[1-2]和性別控制等方面作用明顯[3-5]，但長期攝入可使畜、禽、魚類機(jī)體產(chǎn)生慢性或蓄積毒性，擾亂激素平衡，造成免疫力下降[6]、畸形[7]、死亡等[8-9]。2003年，我國將甲基睪丸酮列為禁用獸藥，然而由于甲基睪丸酮可以提高養(yǎng)殖產(chǎn)量，因此仍有不法分子在使用。2016年，我國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局將甲基睪丸酮列為動(dòng)物源性食品的法檢項(xiàng)目。目前，水產(chǎn)品及飼料中甲基睪丸酮?dú)埩袅康臏y(cè)定方法已經(jīng)比較成熟[10-11]，主要包括液相色譜法[12-14]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-19]及酶聯(lián)免疫法[20]；然而現(xiàn)有的動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康臏y(cè)定方法往往有許多不足之處，例如提取過程繁瑣、有機(jī)試劑用量大、環(huán)境污染嚴(yán)重，且不能有效降低基質(zhì)效應(yīng)，導(dǎo)致回收率較低，影響測(cè)定的準(zhǔn)確性。本研究針對(duì)更好地降低基質(zhì)效應(yīng)、提高回收率等方面進(jìn)行改進(jìn)，建立了一種利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）儀測(cè)定動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康姆椒ā?/p>
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
動(dòng)物源性食品由河南進(jìn)口肉類指定口岸漯河查驗(yàn)區(qū)提供。
甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度97.6%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；C18固相萃取柱 美國Agilent公司；
甲酸（質(zhì)譜純）、乙酸乙酯、乙腈、甲醇（均為色
譜純） 美國Fisher Scientific公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.2 儀器與設(shè)備
6470型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Agilent公司；VX-Ⅲ型渦旋振蕩器 北京踏錦科技有限公司；5810R型離心機(jī) 德國Eppendorf公司；5982-9110型固相萃取裝置 美國Agilent公司；N-EVAP型氮吹儀
美國Organomation公司；KQ 5200DE型數(shù)控超聲波清
洗器 昆山市超聲儀器有限公司；XPE 205型分析天平（感量0.01 mg） 瑞士Mettler-Toledo公司。
1.3 方法
1.3.1 樣品制備
從動(dòng)物源性食品樣品中取出有代表性可食部分，質(zhì)量不低于500 g，用組織搗碎機(jī)充分搗碎、混勻，裝入潔凈的自封袋中，備用。
1.3.2 樣品前處理
準(zhǔn)確稱取搗碎的樣品（0.500±0.002） g于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL提取溶劑，渦旋振蕩10 min，超聲提取20 min，4 000 r/min離心5 min，吸取上清液，待凈化。其中分別選取甲醇、乙腈和乙酸乙酯作為提取溶劑，比較不同提取溶劑對(duì)樣品的提取效果。
1.3.3 樣品提取液的凈化
分別采用冷凍法、固相萃取法和分散固相萃取法對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化，比較不同凈化方法的效果。
冷凍法[21]：將待凈化上清液置于-18 ℃冷凍6 h后取出，1 000 r/min離心5 min，吸取5 mL上清液，在40 ℃水浴條件下用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)靡译?0.1%甲酸溶液（10∶90，V/V）定容至1.0 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，待UPLC-MS/MS檢測(cè)。
固相萃取法[22]：用3 mL甲醇對(duì)固相萃取柱進(jìn)行活化后，加入5 mL待凈化上清液，立即收集流出物，再用3 mL甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；將全部洗脫液在40 ℃水浴條件下用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)靡译?0.1%甲酸溶液（10∶90，V/V）定容至1.0 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，待UPLC-MS/MS檢測(cè)。
分散固相萃取法[23]：將1.0 g C18粉末加入待凈化上清液中，振蕩5 min，4 000 r/min離心5 min，吸取5 mL上清液，在40 ℃水浴條件下用氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)靡译?0.1%甲酸溶液（10∶90，V/V）定容至1.0 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，待UPLC-MS/MS檢測(cè)。
1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：將甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品用不同體積的乙腈-0.1%甲酸溶液（10∶90，V/V）定容，配制成甲基睪丸酮質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
以甲基睪丸酮的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。
1.3.5 色譜條件
Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2.0 μL；流動(dòng)相梯度洗脫程序如表1所示。
1.3.6 質(zhì)譜條件
電噴霧離子源，正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流速6 L/min；毛細(xì)管電壓3 500 V；其他質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。
目標(biāo)化合物的定性依據(jù)：待測(cè)樣品中目標(biāo)化合物色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比，變化范圍應(yīng)在±2.5%之內(nèi)。甲基睪丸酮的定量離子與定性離子豐度比在（100±20）%之間則為陽性。
1.3.7 樣品提取及凈化效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)
基質(zhì)校準(zhǔn)溶液的配制：1）取不同體積的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入將空白樣品按照1.3.2、1.3.3節(jié)提取和凈化所得的凈化液，定容，配制成甲基睪丸酮質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的基質(zhì)校準(zhǔn)溶液；2）準(zhǔn)確稱取搗碎的樣品（0.500±0.002） g于50 mL聚丙烯離心管中，加入不同體積的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2、1.3.3節(jié)進(jìn)行提取和凈化，配制成甲基睪丸酮質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的基質(zhì)校準(zhǔn)溶液。endprint
按照公式（1）～（3）計(jì)算樣品的基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）、回收率（recovery，RE）及方法效率（method efficiency，PE）。ME值越小，表明樣品的基質(zhì)效應(yīng)越嚴(yán)重[24-27]。
（1）
（2）
（3）
式中：A為用乙腈-0.1%甲酸溶液配制的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值；B為用空白樣品凈化液配制的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值；C為空白樣品中添加甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行提取和凈化的響應(yīng)值。
1.4 數(shù)據(jù)處理
使用安捷倫UPLC-MS/MS儀自帶的Mass Hunter數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)所采集數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 樣品提取及凈化條件的優(yōu)化
2.1.1 提取溶劑的選擇
提取溶劑影響樣品的ME、RE和PE[28-29]，由表3可知，3 種提取溶劑中乙酸乙酯的ME最大，RE及PE最低，這可能是由于乙酸乙酯的極性較弱，在萃取甲基睪丸酮的同時(shí)溶解了大部分的脂肪等非極性化合物，因此對(duì)目標(biāo)化合物造成了干擾；與甲醇相比，乙腈的RE降低了2.01%，但ME值和PE分別升高了3.57%和2.83%，因此選擇乙腈作為提取溶劑。
2.1.2 凈化方法的選擇
ME是定量分析中必須考慮的因素[30]，采用冷凍法、固相萃取法或分散固相萃取法等方式對(duì)樣品進(jìn)行凈化均有助于降低ME。脂肪在動(dòng)物源性食品中占比最大，可能是造成ME的主要因素。由表4可知，3 種凈化方法均降低了樣品的ME，其中固相萃取法的ME最小，且RE和PE最高，這可能與C18固相萃取柱具有更好的除脂效果有關(guān)。因此選用固相萃取法對(duì)樣品進(jìn)行凈化，同時(shí)進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法以降低ME。
2.1.3 樣品凈化上樣量的確定
在保證靈敏度的前提下，對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋有助于降低ME[31]，同時(shí)減少凈化時(shí)的上樣量有助于提高固相萃取柱的凈化效果，因此，分別選擇上樣量為5 mL和10 mL提取液進(jìn)行固相萃取凈化。由表5可知，凈化時(shí)的上樣量為5 mL時(shí)可以明顯降低ME、提高RE和PE，因此減少上樣量可以避免固相萃取柱過載造成的凈化不徹底；但上樣量較低時(shí)的提取效率有所降低，這可能是由于固相萃取過程本身造成了目標(biāo)化合物的損失，因此考慮進(jìn)一步優(yōu)化固相萃取條件。
2.1.4 固相萃取條件的優(yōu)化
C18固相萃取柱屬于非極性柱，主要用于除去樣品中的脂肪等非極性成分[32]，對(duì)甲基睪丸酮的吸附作用很小。對(duì)固相萃取柱進(jìn)行活化可以使吸附劑保持濕潤而具有吸附能力，同時(shí)可以除去填料中可能存在的雜質(zhì)。固相萃取柱的活化要充分，且不同分離模式固相萃取柱的活化溶劑也不同，C18固相萃取柱通常使用水溶性有機(jī)溶劑進(jìn)行活化，例如先用甲醇淋洗，再用水或緩沖溶液淋洗[33]。本研究分別采用以下3 種方式對(duì)固相萃取柱進(jìn)行活化：方法1：不經(jīng)活化直接上樣，收集凈化液，并用3 mL甲醇洗脫；方法2：甲醇活化后上樣，收集凈化液，并用3 mL甲醇洗脫；方法3：甲醇、水依次活化后上樣，收集凈化液，并用3 mL甲醇洗脫。
由表6可知，由于方法3最后加入的活化試劑是水，而樣品洗脫液主要是有機(jī)溶劑甲醇，這可能會(huì)影響C18固相萃取柱對(duì)提取液中非極性雜質(zhì)的吸附，因此方法2的ME最小、RE和PE最高，即C18固相萃取柱經(jīng)甲醇活化后直接上樣，收集凈化液的效果最佳。
2.2 實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證
2.2.1 甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子色譜圖及線性關(guān)系
質(zhì)量濃度為50 ng/mL的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子色譜圖如圖1所示。以甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性方程為y=1 782.882x-1 525.374，R2≥0.998，在1～50 ng/mL
范圍內(nèi)甲基睪丸酮的線性關(guān)系良好。
2.2.2 方法檢出限和定量限
對(duì)空白樣品進(jìn)行20 次平行測(cè)定，根據(jù)GB/T 27404—2008
《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[34]中規(guī)定的CL=3Sb/b（其中CL為方法定量限，Sb為空白值標(biāo)準(zhǔn)偏差，b為方法校準(zhǔn)曲線斜率），得出甲基睪丸酮的定量限為1.0 μg/kg，檢出限為0.3 μg/kg。
2.2.3 方法回收率和精密度
動(dòng)物源性食品空白樣品及空白樣品中加入40.0 μg/kg甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)后的提取離子色譜圖如圖2所示。
由表7可知，將加入量分別為1.0、2.0、10.0、40.0 μg/kg的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加到空白動(dòng)物源性食品樣品中的回收率在70.60%～112.41%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）≤9.26%。GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[34]規(guī)定被測(cè)組分含量小于100 μg/kg時(shí)，回收率應(yīng)在60%～120%之間、R2≥0.99；被測(cè)組分含量為1.0、10.0、100.0 μg/kg時(shí)，RSD應(yīng)分別滿足RSD≤30%、RSD≤21%、RSD≤15%，因此本研究所建立方法的相關(guān)系數(shù)、回收率和精密度均符合要求。
表 7 加標(biāo)樣品中甲基睪丸酮的回收率和精密度（n=6）
2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)
隨機(jī)選取108 份進(jìn)口肉類樣品（凍豬背皮30 份、凍豬背膘30 份、凍豬去皮去骨后腿肉48 份），分別采用本研究建立的方法（方法1）和農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-1-2008《動(dòng)物源性食品中11 種激素殘留檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[35]中的方法（方法2）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，108 份進(jìn)口肉類樣品中均未檢出甲基睪丸酮。endprint
隨機(jī)選取以上3 種肉類的陰性樣品各2 份，分別以1.0、2.0 μg/kg的加標(biāo)量加入甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別采用方法1和方法2進(jìn)行檢測(cè)。由表8可知，2 種方法的測(cè)定結(jié)果基本一致，回收率為69.0%～95.0%，且方法1采用外標(biāo)法，與方法2相比降低了成本，因此本研究建立的檢測(cè)方法可行。
3 結(jié) 論
本研究基于降低基質(zhì)效應(yīng)、提高回收率及方法效率，探索并建立了一種利用UPLC-MS/MS法測(cè)定動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康姆椒?。該方法測(cè)定甲基睪丸酮的檢出限為0.3 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg，回收率、精密度和準(zhǔn)確度均符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》中的規(guī)定；同時(shí)，通過與農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-1-2008中的方法進(jìn)行對(duì)比，證實(shí)本研究建立的方法檢測(cè)準(zhǔn)確性較高。本方法操作簡便、成本較低、提取溶劑用量小，減少了污染及對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員的危害，適用于批量動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮的檢測(cè)。
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周迎春++王林裴++劉少博++華向美++劉會(huì)凌++彭新然
摘 要：基于降低樣品的基質(zhì)效應(yīng)、提高回收率和方法效率，建立采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法測(cè)定動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康姆椒?。分別對(duì)樣品的提取溶劑和凈化方法進(jìn)行優(yōu)化，然后用UPLC-MS/MS儀進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：采用乙腈作為提取溶劑、C18固相萃取柱經(jīng)甲醇活化后直接上樣，且上樣量為5 mL時(shí)的凈化效果最佳。在此條件下，甲基睪丸酮在1～50 ng/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，R2≥0.998，方法檢出限為0.3 μg/kg，定量限為
1.0 μg/kg；以甲基睪丸酮的添加量分別為1.0、2.0、10.0、40.0 μg/kg的水平進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，回收率在70.60%～112.41%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD）為4.33%～9.26%。本方法操作簡便、成本低、靈敏度高，適用于批量動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮的殘留量檢測(cè)。
關(guān)鍵詞：甲基睪丸酮；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；動(dòng)物源性食品；固相萃取
Determination of Methyl Testosterone Residues in Foods of Animal Origin by Using Ultra Performance
Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
ZHOU Yingchun1， WANG Linpei1， LIU Shaobo2， HUA Xiangmei1， LIU Huiling1， PENG Xinran1
（1.Luohe Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Luohe 462300， China；
2.Cargill Food （Luohe） Co. Ltd.， Luohe 462300， China）
Abstract： An efficient method for the determination of methyl testosterone residues in foods of animal origin with low matrix effect and high recovery was presented by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS-MS）. Samples were extracted with acetonitrile， and the extract was cleaned up on a C18 solid phase extraction column （SPE-C18）， concentrated by nitrogen gas blowing， detected by UPLC-MS-MS and quantitated by external standard method. The calibration curve for methyl testosterone exhibited a good linearity with R2 higher than 0.998. The limit of detection （LOD） was 0.3 μg/kg， and the limit of quantification （LOQ） was 1.0 μg/kg. The recoveries of methyl testosterone in spiked samples were in the range of 70.60%–112.41% at spiked levels of 1.0， 2.0， 10.0 and 40.0 μg/kg， with relative standard deviations （RSD） between 4.33% to 9.26%. This method was simple， low-cost， sensitive and suitable for the batch determination of methyl testosterone residues in foods of animal origin.
Key words： methyl testosterone； ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry； foods of animal origin； solid phase extraction
DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709011
中圖分類號(hào)：O657.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2017）09-0063-06
引文格式：
周迎春， 王林裴， 劉少博， 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮?dú)埩袅縖J]. 肉類研究， 2017， 31（9）： 63-68. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709011. http：//www.rlyj.pub
ZHOU Yingchun， WANG Linpei， LIU Shaobo， et al. Determination of methyl testosterone residues in foods of animal origin by using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2017， 31（9）： 63-68. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709011. http：//www.rlyj.pubendprint
甲基睪丸酮屬于人工合成雄性激素，在動(dòng)物的苗種培育[1-2]和性別控制等方面作用明顯[3-5]，但長期攝入可使畜、禽、魚類機(jī)體產(chǎn)生慢性或蓄積毒性，擾亂激素平衡，造成免疫力下降[6]、畸形[7]、死亡等[8-9]。2003年，我國將甲基睪丸酮列為禁用獸藥，然而由于甲基睪丸酮可以提高養(yǎng)殖產(chǎn)量，因此仍有不法分子在使用。2016年，我國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局將甲基睪丸酮列為動(dòng)物源性食品的法檢項(xiàng)目。目前，水產(chǎn)品及飼料中甲基睪丸酮?dú)埩袅康臏y(cè)定方法已經(jīng)比較成熟[10-11]，主要包括液相色譜法[12-14]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-19]及酶聯(lián)免疫法[20]；然而現(xiàn)有的動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康臏y(cè)定方法往往有許多不足之處，例如提取過程繁瑣、有機(jī)試劑用量大、環(huán)境污染嚴(yán)重，且不能有效降低基質(zhì)效應(yīng)，導(dǎo)致回收率較低，影響測(cè)定的準(zhǔn)確性。本研究針對(duì)更好地降低基質(zhì)效應(yīng)、提高回收率等方面進(jìn)行改進(jìn)，建立了一種利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）儀測(cè)定動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康姆椒ā?/p>
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
動(dòng)物源性食品由河南進(jìn)口肉類指定口岸漯河查驗(yàn)區(qū)提供。
甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度97.6%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；C18固相萃取柱 美國Agilent公司；
甲酸（質(zhì)譜純）、乙酸乙酯、乙腈、甲醇（均為色
譜純） 美國Fisher Scientific公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.2 儀器與設(shè)備
6470型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Agilent公司；VX-Ⅲ型渦旋振蕩器 北京踏錦科技有限公司；5810R型離心機(jī) 德國Eppendorf公司；5982-9110型固相萃取裝置 美國Agilent公司；N-EVAP型氮吹儀
美國Organomation公司；KQ 5200DE型數(shù)控超聲波清
洗器 昆山市超聲儀器有限公司；XPE 205型分析天平（感量0.01 mg） 瑞士Mettler-Toledo公司。
1.3 方法
1.3.1 樣品制備
從動(dòng)物源性食品樣品中取出有代表性可食部分，質(zhì)量不低于500 g，用組織搗碎機(jī)充分搗碎、混勻，裝入潔凈的自封袋中，備用。
1.3.2 樣品前處理
準(zhǔn)確稱取搗碎的樣品（0.500±0.002） g于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL提取溶劑，渦旋振蕩10 min，超聲提取20 min，4 000 r/min離心5 min，吸取上清液，待凈化。其中分別選取甲醇、乙腈和乙酸乙酯作為提取溶劑，比較不同提取溶劑對(duì)樣品的提取效果。
1.3.3 樣品提取液的凈化
分別采用冷凍法、固相萃取法和分散固相萃取法對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化，比較不同凈化方法的效果。
冷凍法[21]：將待凈化上清液置于-18 ℃冷凍6 h后取出，1 000 r/min離心5 min，吸取5 mL上清液，在40 ℃水浴條件下用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)靡译?0.1%甲酸溶液（10∶90，V/V）定容至1.0 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，待UPLC-MS/MS檢測(cè)。
固相萃取法[22]：用3 mL甲醇對(duì)固相萃取柱進(jìn)行活化后，加入5 mL待凈化上清液，立即收集流出物，再用3 mL甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；將全部洗脫液在40 ℃水浴條件下用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)靡译?0.1%甲酸溶液（10∶90，V/V）定容至1.0 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，待UPLC-MS/MS檢測(cè)。
分散固相萃取法[23]：將1.0 g C18粉末加入待凈化上清液中，振蕩5 min，4 000 r/min離心5 min，吸取5 mL上清液，在40 ℃水浴條件下用氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)靡译?0.1%甲酸溶液（10∶90，V/V）定容至1.0 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，待UPLC-MS/MS檢測(cè)。
1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：將甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品用不同體積的乙腈-0.1%甲酸溶液（10∶90，V/V）定容，配制成甲基睪丸酮質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
以甲基睪丸酮的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量。
1.3.5 色譜條件
Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2.0 μL；流動(dòng)相梯度洗脫程序如表1所示。
1.3.6 質(zhì)譜條件
電噴霧離子源，正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流速6 L/min；毛細(xì)管電壓3 500 V；其他質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。
目標(biāo)化合物的定性依據(jù)：待測(cè)樣品中目標(biāo)化合物色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比，變化范圍應(yīng)在±2.5%之內(nèi)。甲基睪丸酮的定量離子與定性離子豐度比在（100±20）%之間則為陽性。
1.3.7 樣品提取及凈化效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)
基質(zhì)校準(zhǔn)溶液的配制：1）取不同體積的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入將空白樣品按照1.3.2、1.3.3節(jié)提取和凈化所得的凈化液，定容，配制成甲基睪丸酮質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的基質(zhì)校準(zhǔn)溶液；2）準(zhǔn)確稱取搗碎的樣品（0.500±0.002） g于50 mL聚丙烯離心管中，加入不同體積的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2、1.3.3節(jié)進(jìn)行提取和凈化，配制成甲基睪丸酮質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的基質(zhì)校準(zhǔn)溶液。endprint
按照公式（1）～（3）計(jì)算樣品的基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）、回收率（recovery，RE）及方法效率（method efficiency，PE）。ME值越小，表明樣品的基質(zhì)效應(yīng)越嚴(yán)重[24-27]。
（1）
（2）
（3）
式中：A為用乙腈-0.1%甲酸溶液配制的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值；B為用空白樣品凈化液配制的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值；C為空白樣品中添加甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行提取和凈化的響應(yīng)值。
1.4 數(shù)據(jù)處理
使用安捷倫UPLC-MS/MS儀自帶的Mass Hunter數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)所采集數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 樣品提取及凈化條件的優(yōu)化
2.1.1 提取溶劑的選擇
提取溶劑影響樣品的ME、RE和PE[28-29]，由表3可知，3 種提取溶劑中乙酸乙酯的ME最大，RE及PE最低，這可能是由于乙酸乙酯的極性較弱，在萃取甲基睪丸酮的同時(shí)溶解了大部分的脂肪等非極性化合物，因此對(duì)目標(biāo)化合物造成了干擾；與甲醇相比，乙腈的RE降低了2.01%，但ME值和PE分別升高了3.57%和2.83%，因此選擇乙腈作為提取溶劑。
2.1.2 凈化方法的選擇
ME是定量分析中必須考慮的因素[30]，采用冷凍法、固相萃取法或分散固相萃取法等方式對(duì)樣品進(jìn)行凈化均有助于降低ME。脂肪在動(dòng)物源性食品中占比最大，可能是造成ME的主要因素。由表4可知，3 種凈化方法均降低了樣品的ME，其中固相萃取法的ME最小，且RE和PE最高，這可能與C18固相萃取柱具有更好的除脂效果有關(guān)。因此選用固相萃取法對(duì)樣品進(jìn)行凈化，同時(shí)進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法以降低ME。
2.1.3 樣品凈化上樣量的確定
在保證靈敏度的前提下，對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋有助于降低ME[31]，同時(shí)減少凈化時(shí)的上樣量有助于提高固相萃取柱的凈化效果，因此，分別選擇上樣量為5 mL和10 mL提取液進(jìn)行固相萃取凈化。由表5可知，凈化時(shí)的上樣量為5 mL時(shí)可以明顯降低ME、提高RE和PE，因此減少上樣量可以避免固相萃取柱過載造成的凈化不徹底；但上樣量較低時(shí)的提取效率有所降低，這可能是由于固相萃取過程本身造成了目標(biāo)化合物的損失，因此考慮進(jìn)一步優(yōu)化固相萃取條件。
2.1.4 固相萃取條件的優(yōu)化
C18固相萃取柱屬于非極性柱，主要用于除去樣品中的脂肪等非極性成分[32]，對(duì)甲基睪丸酮的吸附作用很小。對(duì)固相萃取柱進(jìn)行活化可以使吸附劑保持濕潤而具有吸附能力，同時(shí)可以除去填料中可能存在的雜質(zhì)。固相萃取柱的活化要充分，且不同分離模式固相萃取柱的活化溶劑也不同，C18固相萃取柱通常使用水溶性有機(jī)溶劑進(jìn)行活化，例如先用甲醇淋洗，再用水或緩沖溶液淋洗[33]。本研究分別采用以下3 種方式對(duì)固相萃取柱進(jìn)行活化：方法1：不經(jīng)活化直接上樣，收集凈化液，并用3 mL甲醇洗脫；方法2：甲醇活化后上樣，收集凈化液，并用3 mL甲醇洗脫；方法3：甲醇、水依次活化后上樣，收集凈化液，并用3 mL甲醇洗脫。
由表6可知，由于方法3最后加入的活化試劑是水，而樣品洗脫液主要是有機(jī)溶劑甲醇，這可能會(huì)影響C18固相萃取柱對(duì)提取液中非極性雜質(zhì)的吸附，因此方法2的ME最小、RE和PE最高，即C18固相萃取柱經(jīng)甲醇活化后直接上樣，收集凈化液的效果最佳。
2.2 實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證
2.2.1 甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子色譜圖及線性關(guān)系
質(zhì)量濃度為50 ng/mL的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子色譜圖如圖1所示。以甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性方程為y=1 782.882x-1 525.374，R2≥0.998，在1～50 ng/mL
范圍內(nèi)甲基睪丸酮的線性關(guān)系良好。
2.2.2 方法檢出限和定量限
對(duì)空白樣品進(jìn)行20 次平行測(cè)定，根據(jù)GB/T 27404—2008
《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[34]中規(guī)定的CL=3Sb/b（其中CL為方法定量限，Sb為空白值標(biāo)準(zhǔn)偏差，b為方法校準(zhǔn)曲線斜率），得出甲基睪丸酮的定量限為1.0 μg/kg，檢出限為0.3 μg/kg。
2.2.3 方法回收率和精密度
動(dòng)物源性食品空白樣品及空白樣品中加入40.0 μg/kg甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)后的提取離子色譜圖如圖2所示。
由表7可知，將加入量分別為1.0、2.0、10.0、40.0 μg/kg的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加到空白動(dòng)物源性食品樣品中的回收率在70.60%～112.41%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）≤9.26%。GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[34]規(guī)定被測(cè)組分含量小于100 μg/kg時(shí)，回收率應(yīng)在60%～120%之間、R2≥0.99；被測(cè)組分含量為1.0、10.0、100.0 μg/kg時(shí)，RSD應(yīng)分別滿足RSD≤30%、RSD≤21%、RSD≤15%，因此本研究所建立方法的相關(guān)系數(shù)、回收率和精密度均符合要求。
表 7 加標(biāo)樣品中甲基睪丸酮的回收率和精密度（n=6）
2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)
隨機(jī)選取108 份進(jìn)口肉類樣品（凍豬背皮30 份、凍豬背膘30 份、凍豬去皮去骨后腿肉48 份），分別采用本研究建立的方法（方法1）和農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-1-2008《動(dòng)物源性食品中11 種激素殘留檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[35]中的方法（方法2）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，108 份進(jìn)口肉類樣品中均未檢出甲基睪丸酮。endprint
隨機(jī)選取以上3 種肉類的陰性樣品各2 份，分別以1.0、2.0 μg/kg的加標(biāo)量加入甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別采用方法1和方法2進(jìn)行檢測(cè)。由表8可知，2 種方法的測(cè)定結(jié)果基本一致，回收率為69.0%～95.0%，且方法1采用外標(biāo)法，與方法2相比降低了成本，因此本研究建立的檢測(cè)方法可行。
3 結(jié) 論
本研究基于降低基質(zhì)效應(yīng)、提高回收率及方法效率，探索并建立了一種利用UPLC-MS/MS法測(cè)定動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康姆椒?。該方法測(cè)定甲基睪丸酮的檢出限為0.3 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg，回收率、精密度和準(zhǔn)確度均符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》中的規(guī)定；同時(shí)，通過與農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-1-2008中的方法進(jìn)行對(duì)比，證實(shí)本研究建立的方法檢測(cè)準(zhǔn)確性較高。本方法操作簡便、成本較低、提取溶劑用量小，減少了污染及對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員的危害，適用于批量動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮的檢測(cè)。
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