周迎春++王林裴++劉少博++華向美++劉會(huì)凌++彭新然
摘 要:基于降低樣品的基質(zhì)效應(yīng)、提高回收率和方法效率,建立采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)法測(cè)定動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康姆椒?。分別對(duì)樣品的提取溶劑和凈化方法進(jìn)行優(yōu)化,然后用UPLC-MS/MS儀進(jìn)行測(cè)定,外標(biāo)法定量。結(jié)果表明:采用乙腈作為提取溶劑、C18固相萃取柱經(jīng)甲醇活化后直接上樣,且上樣量為5 mL時(shí)的凈化效果最佳。在此條件下,甲基睪丸酮在1~50 ng/mL范圍內(nèi)的線(xiàn)性關(guān)系良好,R2≥0.998,方法檢出限為0.3 μg/kg,定量限為
1.0 μg/kg;以甲基睪丸酮的添加量分別為1.0、2.0、10.0、40.0 μg/kg的水平進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,回收率在70.60%~112.41%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviations,RSD)為4.33%~9.26%。本方法操作簡(jiǎn)便、成本低、靈敏度高,適用于批量動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮的殘留量檢測(cè)。
關(guān)鍵詞:甲基睪丸酮;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;動(dòng)物源性食品;固相萃取
Determination of Methyl Testosterone Residues in Foods of Animal Origin by Using Ultra Performance
Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
ZHOU Yingchun1, WANG Linpei1, LIU Shaobo2, HUA Xiangmei1, LIU Huiling1, PENG Xinran1
(1.Luohe Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Luohe 462300, China;
2.Cargill Food (Luohe) Co. Ltd., Luohe 462300, China)
Abstract: An efficient method for the determination of methyl testosterone residues in foods of animal origin with low matrix effect and high recovery was presented by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS). Samples were extracted with acetonitrile, and the extract was cleaned up on a C18 solid phase extraction column (SPE-C18), concentrated by nitrogen gas blowing, detected by UPLC-MS-MS and quantitated by external standard method. The calibration curve for methyl testosterone exhibited a good linearity with R2 higher than 0.998. The limit of detection (LOD) was 0.3 μg/kg, and the limit of quantification (LOQ) was 1.0 μg/kg. The recoveries of methyl testosterone in spiked samples were in the range of 70.60%–112.41% at spiked levels of 1.0, 2.0, 10.0 and 40.0 μg/kg, with relative standard deviations (RSD) between 4.33% to 9.26%. This method was simple, low-cost, sensitive and suitable for the batch determination of methyl testosterone residues in foods of animal origin.
Key words: methyl testosterone; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; foods of animal origin; solid phase extraction
DOI:10.7506/rlyj1001-8123-201709011
中圖分類(lèi)號(hào):O657.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1001-8123(2017)09-0063-06
引文格式:
周迎春, 王林裴, 劉少博, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮?dú)埩袅縖J]. 肉類(lèi)研究, 2017, 31(9): 63-68. DOI:10.7506/rlyj1001-8123-201709011. http://www.rlyj.pub
ZHOU Yingchun, WANG Linpei, LIU Shaobo, et al. Determination of methyl testosterone residues in foods of animal origin by using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research, 2017, 31(9): 63-68. DOI:10.7506/rlyj1001-8123-201709011. http://www.rlyj.pubendprint
甲基睪丸酮屬于人工合成雄性激素,在動(dòng)物的苗種培育[1-2]和性別控制等方面作用明顯[3-5],但長(zhǎng)期攝入可使畜、禽、魚(yú)類(lèi)機(jī)體產(chǎn)生慢性或蓄積毒性,擾亂激素平衡,造成免疫力下降[6]、畸形[7]、死亡等[8-9]。2003年,我國(guó)將甲基睪丸酮列為禁用獸藥,然而由于甲基睪丸酮可以提高養(yǎng)殖產(chǎn)量,因此仍有不法分子在使用。2016年,我國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局將甲基睪丸酮列為動(dòng)物源性食品的法檢項(xiàng)目。目前,水產(chǎn)品及飼料中甲基睪丸酮?dú)埩袅康臏y(cè)定方法已經(jīng)比較成熟[10-11],主要包括液相色譜法[12-14]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-19]及酶聯(lián)免疫法[20];然而現(xiàn)有的動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康臏y(cè)定方法往往有許多不足之處,例如提取過(guò)程繁瑣、有機(jī)試劑用量大、環(huán)境污染嚴(yán)重,且不能有效降低基質(zhì)效應(yīng),導(dǎo)致回收率較低,影響測(cè)定的準(zhǔn)確性。本研究針對(duì)更好地降低基質(zhì)效應(yīng)、提高回收率等方面進(jìn)行改進(jìn),建立了一種利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)儀測(cè)定動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康姆椒ā?/p>
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
動(dòng)物源性食品由河南進(jìn)口肉類(lèi)指定口岸漯河查驗(yàn)區(qū)提供。
甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品(純度97.6%) 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司;C18固相萃取柱 美國(guó)Agilent公司;
甲酸(質(zhì)譜純)、乙酸乙酯、乙腈、甲醇(均為色
譜純) 美國(guó)Fisher Scientific公司;實(shí)驗(yàn)用水均為超純水;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.2 儀器與設(shè)備
6470型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司;VX-Ⅲ型渦旋振蕩器 北京踏錦科技有限公司;5810R型離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;5982-9110型固相萃取裝置 美國(guó)Agilent公司;N-EVAP型氮吹儀
美國(guó)Organomation公司;KQ 5200DE型數(shù)控超聲波清
洗器 昆山市超聲儀器有限公司;XPE 205型分析天平(感量0.01 mg) 瑞士Mettler-Toledo公司。
1.3 方法
1.3.1 樣品制備
從動(dòng)物源性食品樣品中取出有代表性可食部分,質(zhì)量不低于500 g,用組織搗碎機(jī)充分搗碎、混勻,裝入潔凈的自封袋中,備用。
1.3.2 樣品前處理
準(zhǔn)確稱(chēng)取搗碎的樣品(0.500±0.002) g于50 mL聚丙烯離心管中,加入10 mL提取溶劑,渦旋振蕩10 min,超聲提取20 min,4 000 r/min離心5 min,吸取上清液,待凈化。其中分別選取甲醇、乙腈和乙酸乙酯作為提取溶劑,比較不同提取溶劑對(duì)樣品的提取效果。
1.3.3 樣品提取液的凈化
分別采用冷凍法、固相萃取法和分散固相萃取法對(duì)樣品提取液進(jìn)行凈化,比較不同凈化方法的效果。
冷凍法[21]:將待凈化上清液置于-18 ℃冷凍6 h后取出,1 000 r/min離心5 min,吸取5 mL上清液,在40 ℃水浴條件下用氮?dú)獯蹈?,殘?jiān)靡译?0.1%甲酸溶液(10∶90,V/V)定容至1.0 mL,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后,待UPLC-MS/MS檢測(cè)。
固相萃取法[22]:用3 mL甲醇對(duì)固相萃取柱進(jìn)行活化后,加入5 mL待凈化上清液,立即收集流出物,再用3 mL甲醇進(jìn)行洗脫,收集洗脫液;將全部洗脫液在40 ℃水浴條件下用氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)靡译?0.1%甲酸溶液(10∶90,V/V)定容至1.0 mL,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后,待UPLC-MS/MS檢測(cè)。
分散固相萃取法[23]:將1.0 g C18粉末加入待凈化上清液中,振蕩5 min,4 000 r/min離心5 min,吸取5 mL上清液,在40 ℃水浴條件下用氮?dú)獯蹈?,殘?jiān)靡译?0.1%甲酸溶液(10∶90,V/V)定容至1.0 mL,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后,待UPLC-MS/MS檢測(cè)。
1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:將甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品用不同體積的乙腈-0.1%甲酸溶液(10∶90,V/V)定容,配制成甲基睪丸酮質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
以甲基睪丸酮的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),外標(biāo)法定量。
1.3.5 色譜條件
Poroshell 120 EC-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.7 μm);柱溫35 ℃;進(jìn)樣量2.0 μL;流動(dòng)相梯度洗脫程序如表1所示。
1.3.6 質(zhì)譜條件
電噴霧離子源,正離子模式;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)模式;干燥氣溫度300 ℃;干燥氣流速6 L/min;毛細(xì)管電壓3 500 V;其他質(zhì)譜參數(shù)如表2所示。
目標(biāo)化合物的定性依據(jù):待測(cè)樣品中目標(biāo)化合物色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比,變化范圍應(yīng)在±2.5%之內(nèi)。甲基睪丸酮的定量離子與定性離子豐度比在(100±20)%之間則為陽(yáng)性。
1.3.7 樣品提取及凈化效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)
基質(zhì)校準(zhǔn)溶液的配制:1)取不同體積的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入將空白樣品按照1.3.2、1.3.3節(jié)提取和凈化所得的凈化液,定容,配制成甲基睪丸酮質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的基質(zhì)校準(zhǔn)溶液;2)準(zhǔn)確稱(chēng)取搗碎的樣品(0.500±0.002) g于50 mL聚丙烯離心管中,加入不同體積的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.3.2、1.3.3節(jié)進(jìn)行提取和凈化,配制成甲基睪丸酮質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的基質(zhì)校準(zhǔn)溶液。endprint
按照公式(1)~(3)計(jì)算樣品的基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect,ME)、回收率(recovery,RE)及方法效率(method efficiency,PE)。ME值越小,表明樣品的基質(zhì)效應(yīng)越嚴(yán)重[24-27]。
(1)
(2)
(3)
式中:A為用乙腈-0.1%甲酸溶液配制的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值;B為用空白樣品凈化液配制的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值;C為空白樣品中添加甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)行提取和凈化的響應(yīng)值。
1.4 數(shù)據(jù)處理
使用安捷倫UPLC-MS/MS儀自帶的Mass Hunter數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)所采集數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖。
2 結(jié)果與分析
2.1 樣品提取及凈化條件的優(yōu)化
2.1.1 提取溶劑的選擇
提取溶劑影響樣品的ME、RE和PE[28-29],由表3可知,3 種提取溶劑中乙酸乙酯的ME最大,RE及PE最低,這可能是由于乙酸乙酯的極性較弱,在萃取甲基睪丸酮的同時(shí)溶解了大部分的脂肪等非極性化合物,因此對(duì)目標(biāo)化合物造成了干擾;與甲醇相比,乙腈的RE降低了2.01%,但ME值和PE分別升高了3.57%和2.83%,因此選擇乙腈作為提取溶劑。
2.1.2 凈化方法的選擇
ME是定量分析中必須考慮的因素[30],采用冷凍法、固相萃取法或分散固相萃取法等方式對(duì)樣品進(jìn)行凈化均有助于降低ME。脂肪在動(dòng)物源性食品中占比最大,可能是造成ME的主要因素。由表4可知,3 種凈化方法均降低了樣品的ME,其中固相萃取法的ME最小,且RE和PE最高,這可能與C18固相萃取柱具有更好的除脂效果有關(guān)。因此選用固相萃取法對(duì)樣品進(jìn)行凈化,同時(shí)進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法以降低ME。
2.1.3 樣品凈化上樣量的確定
在保證靈敏度的前提下,對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋有助于降低ME[31],同時(shí)減少凈化時(shí)的上樣量有助于提高固相萃取柱的凈化效果,因此,分別選擇上樣量為5 mL和10 mL提取液進(jìn)行固相萃取凈化。由表5可知,凈化時(shí)的上樣量為5 mL時(shí)可以明顯降低ME、提高RE和PE,因此減少上樣量可以避免固相萃取柱過(guò)載造成的凈化不徹底;但上樣量較低時(shí)的提取效率有所降低,這可能是由于固相萃取過(guò)程本身造成了目標(biāo)化合物的損失,因此考慮進(jìn)一步優(yōu)化固相萃取條件。
2.1.4 固相萃取條件的優(yōu)化
C18固相萃取柱屬于非極性柱,主要用于除去樣品中的脂肪等非極性成分[32],對(duì)甲基睪丸酮的吸附作用很小。對(duì)固相萃取柱進(jìn)行活化可以使吸附劑保持濕潤(rùn)而具有吸附能力,同時(shí)可以除去填料中可能存在的雜質(zhì)。固相萃取柱的活化要充分,且不同分離模式固相萃取柱的活化溶劑也不同,C18固相萃取柱通常使用水溶性有機(jī)溶劑進(jìn)行活化,例如先用甲醇淋洗,再用水或緩沖溶液淋洗[33]。本研究分別采用以下3 種方式對(duì)固相萃取柱進(jìn)行活化:方法1:不經(jīng)活化直接上樣,收集凈化液,并用3 mL甲醇洗脫;方法2:甲醇活化后上樣,收集凈化液,并用3 mL甲醇洗脫;方法3:甲醇、水依次活化后上樣,收集凈化液,并用3 mL甲醇洗脫。
由表6可知,由于方法3最后加入的活化試劑是水,而樣品洗脫液主要是有機(jī)溶劑甲醇,這可能會(huì)影響C18固相萃取柱對(duì)提取液中非極性雜質(zhì)的吸附,因此方法2的ME最小、RE和PE最高,即C18固相萃取柱經(jīng)甲醇活化后直接上樣,收集凈化液的效果最佳。
2.2 實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證
2.2.1 甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子色譜圖及線(xiàn)性關(guān)系
質(zhì)量濃度為50 ng/mL的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的提取離子色譜圖如圖1所示。以甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),所得線(xiàn)性方程為y=1 782.882x-1 525.374,R2≥0.998,在1~50 ng/mL
范圍內(nèi)甲基睪丸酮的線(xiàn)性關(guān)系良好。
2.2.2 方法檢出限和定量限
對(duì)空白樣品進(jìn)行20 次平行測(cè)定,根據(jù)GB/T 27404—2008
《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[34]中規(guī)定的CL=3Sb/b(其中CL為方法定量限,Sb為空白值標(biāo)準(zhǔn)偏差,b為方法校準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率),得出甲基睪丸酮的定量限為1.0 μg/kg,檢出限為0.3 μg/kg。
2.2.3 方法回收率和精密度
動(dòng)物源性食品空白樣品及空白樣品中加入40.0 μg/kg甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)后的提取離子色譜圖如圖2所示。
由表7可知,將加入量分別為1.0、2.0、10.0、40.0 μg/kg的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加到空白動(dòng)物源性食品樣品中的回收率在70.60%~112.41%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)≤9.26%。GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》[34]規(guī)定被測(cè)組分含量小于100 μg/kg時(shí),回收率應(yīng)在60%~120%之間、R2≥0.99;被測(cè)組分含量為1.0、10.0、100.0 μg/kg時(shí),RSD應(yīng)分別滿(mǎn)足RSD≤30%、RSD≤21%、RSD≤15%,因此本研究所建立方法的相關(guān)系數(shù)、回收率和精密度均符合要求。
表 7 加標(biāo)樣品中甲基睪丸酮的回收率和精密度(n=6)
2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)
隨機(jī)選取108 份進(jìn)口肉類(lèi)樣品(凍豬背皮30 份、凍豬背膘30 份、凍豬去皮去骨后腿肉48 份),分別采用本研究建立的方法(方法1)和農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-1-2008《動(dòng)物源性食品中11 種激素殘留檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[35]中的方法(方法2)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,108 份進(jìn)口肉類(lèi)樣品中均未檢出甲基睪丸酮。endprint
隨機(jī)選取以上3 種肉類(lèi)的陰性樣品各2 份,分別以1.0、2.0 μg/kg的加標(biāo)量加入甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液,再分別采用方法1和方法2進(jìn)行檢測(cè)。由表8可知,2 種方法的測(cè)定結(jié)果基本一致,回收率為69.0%~95.0%,且方法1采用外標(biāo)法,與方法2相比降低了成本,因此本研究建立的檢測(cè)方法可行。
3 結(jié) 論
本研究基于降低基質(zhì)效應(yīng)、提高回收率及方法效率,探索并建立了一種利用UPLC-MS/MS法測(cè)定動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮?dú)埩袅康姆椒?。該方法測(cè)定甲基睪丸酮的檢出限為0.3 μg/kg,定量限為1.0 μg/kg,回收率、精密度和準(zhǔn)確度均符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》中的規(guī)定;同時(shí),通過(guò)與農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-1-2008中的方法進(jìn)行對(duì)比,證實(shí)本研究建立的方法檢測(cè)準(zhǔn)確性較高。本方法操作簡(jiǎn)便、成本較低、提取溶劑用量小,減少了污染及對(duì)實(shí)驗(yàn)操作人員的危害,適用于批量動(dòng)物源性食品中甲基睪丸酮的檢測(cè)。
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