彭麗芳， 李 樺

(武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

縮膽囊素(Cholecystokinin，CCK)是一類分布廣泛且具有多種生理功能的多型性神經(jīng)肽，通常以四肽CCK4、五肽CCK5和八肽CCK8形式存在于腦脊液中[1]。CCK神經(jīng)肽對記憶、學(xué)習(xí)和睡眠等生理功能具有調(diào)控作用，與抑郁等精神類疾病也緊密相關(guān)[2 - 3]。目前報道的腦脊液及血液中CCK神經(jīng)肽的定量分析主要基于放射性免疫法[4 - 5]，該方法靈敏度高，但需使用昂貴的抗體，且有交叉反應(yīng)的缺點。因此，研究建立高效、經(jīng)濟(jì)、特異性強(qiáng)的CCK神經(jīng)肽定量分析方法，對于闡明其含量與腦疾病之間的關(guān)系具有重要的理論價值和臨床意義。

常規(guī)生物傳感器以酶、抗體等生物分子為識別元件，由于蛋白質(zhì)類抗體價格昂貴且熱穩(wěn)定性差，限制了這類生物傳感器的廣泛應(yīng)用[6 - 7]。分子印跡技術(shù)是以目標(biāo)分子為模板合成具有特異性識別能力的分子印跡聚合物(Molecularly Imprinted Polymer，MIP)，MIP不僅具有抗體的特異性識別能力，而且具有耐高溫、抗酸堿及有機(jī)溶劑、制備成本低和可重復(fù)利用的優(yōu)點。MIP技術(shù)已經(jīng)逐步應(yīng)用于傳感[8 - 9]、免疫分析[10 - 11]和色譜分離[12]等領(lǐng)域。與小分子MIP相比，蛋白質(zhì)MIP的合成制備更具挑戰(zhàn)性，主要是因為蛋白質(zhì)分子量大且聚合過程中構(gòu)象多變?？乖瓫Q定簇法是以多肽或蛋白質(zhì)中一個特異性的裸露短肽為模板分子，制備所得的MIP可用來特異性識別整個多肽或蛋白質(zhì)，該技術(shù)已用于合成多種蛋白質(zhì)MIP[13 - 14]。

本課題組曾用抗原決定簇法合成制備CCK-MIP整體柱，將其用于固相微萃取-液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)測定人腦脊液中CCK神經(jīng)肽[15]。本研究用抗原決定簇法，在硅烷化的玻片表面制備能特異性識別CCK神經(jīng)肽的MIP膜。結(jié)合MIP的高選擇性與熒光法的高靈敏度，研究建立了基于此MIP膜的固相競爭-熒光免疫分析方法，并對人腦脊液中CCK神經(jīng)肽進(jìn)行定量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑及材料

1100型液相色譜儀(美國，Agilent公司)；5700型紅外(IR)光譜分析儀(美國，Nicolet公司)；Zeiss掃描電子顯微鏡(SEM)(德國，Sigma公司)；DSY5000X型熒光倒置顯微鏡(重慶澳浦光電技術(shù)有限公司)，配置MC21型CCD探測器(廣州明美光電技術(shù)有限公司)。

CCK4、CCK5、CCK8、四肽YPLG、甲啡肽(Met-enk)、亮啡肽(Leu-enk)以及FITC標(biāo)記的CCK5(FITC-CCK5)，均購于上海吉爾生化有限公司(純度>98%)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、丙烯酰胺(AM)、4-乙烯基吡啶(4-VP)、3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS)，均購于Aladdin公司(純度>96%)；偶氮二異丁腈(AIBN)、甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酸(AA)，均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(分析純)。

1.2 實驗步驟

1.2.1玻片的預(yù)處理玻片用雙官能團(tuán)試劑γ-MAPS預(yù)處理使其表面硅烷化。依次在0.1 mol/L的NaOH溶液和HCl中煮沸1 h后置于γ-MAPS-甲醇(1∶9，V/V)溶液中浸泡12 h，甲醇沖洗，N2吹干即可。

1.2.2縮膽囊素-分子印跡膜(CCK-MIP)的制備在400 μL甲醇中依次加入3 mg模板分子CCK4，3 μL 功能單體MAA，40 μL交聯(lián)劑EDMA，0.025 g引發(fā)劑AIBN，超聲溶解，充入N25 min。將預(yù)聚合液轉(zhuǎn)移至硅烷化的玻片表面，蓋上普通載玻片，置于培養(yǎng)皿中并用保鮮膜密封，溫度60 ℃熱引發(fā)聚合8 h。聚合后的MIP膜置于乙腈-水(3∶7，V/V)溶液振蕩洗脫(洗脫液含0.1%TFA)，直至洗脫液用HPLC-UV法檢測不到模板分子的信號為止。非印跡聚合物(NIP)的制備除不加模板分子外，其他均相同。

1.2.3CCK-MIP膜吸附平衡實驗通過吸附平衡實驗評價MIP膜的吸附容量及選擇性。分別用5 mL濃度為5、10、15、35、50、100、175、350 μmol/L的CCK4 標(biāo)準(zhǔn)溶液與MIP膜溫育3 h，以HPLC法測定吸附平衡后溶液中CCK4的濃度，并按公式計算吸附容量(Qe)：Qe=V(c0-ce)/m。式中c0和ce(μmol/L)分別代表吸附前后CCK4的濃度，V為CCK4 溶液體積(L)，m為MIP膜質(zhì)量(g)。

MIP膜的特異性以印跡因子(IF)來考察，IF定義為：IF=QMIP/QNIP。其中QMIP和QNIP分別代表印跡膜和非印跡膜的吸附容量。

MIP膜的選擇性考察：多肽混合溶液(CCK4、CCK5、CCK8、YPLG、Met-enk和Leu-enk，濃度均為5.5 μmol/L)與MIP膜溫育3 h，以HPLC法測定吸附平衡后溶液中各多肽濃度，計算IF。

1.2.4人腦脊液的樣品處理人腦脊液樣品取自于武漢同濟(jì)醫(yī)院的病人，并于-80 ℃儲存。使用前將氯仿與腦脊液(4∶1，V/V)混勻，4 ℃下于4 000g離心10 min以除去蛋白質(zhì)，取上清液備用。

1.2.5MIP膜-競爭性熒光免疫分析方法測定CCK神經(jīng)肽含量配置一系列標(biāo)準(zhǔn)CCK5與FITC-CCK5的混合溶液，其中FITC-CCK5濃度固定為210 pmol/L,CCK5濃度分別為0、20、60、120、200、400 pmol/L。將混合溶液與MIP膜溫育進(jìn)行競爭性熒光免疫反應(yīng)，3 h后取出MIP膜，用pH=8.0的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液沖洗2 min；用熒光倒置顯微鏡-CCD圖像分析系統(tǒng)隨機(jī)對MIP膜上10個區(qū)域進(jìn)行拍照，得到10張熒光圖(FM)，每張熒光圖隨機(jī)選取15個相同面積的圓，以圖像分析軟件 image-pro-plus 分析這些圓(共150個)的熒光強(qiáng)度，獲取平均值(FI)。以歸一化熒光強(qiáng)度(B/B0%)為縱坐標(biāo)，繪制B/B0% 隨CCK5濃度變化的曲線，得到擬合方程。其中B為競爭性免疫反應(yīng)中不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)CCK5溶液所對應(yīng)的FM的FI值，B0為CCK5標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0時所對應(yīng)的熒光圖的FI值。將待分析樣品進(jìn)行MIP膜熒光免疫反應(yīng)，將得到熒光圖的FI值代入擬合的線性回歸方程式，計算人腦脊液樣品中CCK神經(jīng)肽的含量。競爭免疫分析方法的檢出限(LOD)為標(biāo)準(zhǔn)品CCK5濃度為0時，對應(yīng)的FI值減去其標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)的三倍所得值代入線性回歸方程求得的CCK濃度[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 MIP膜的制備機(jī)理及固相競爭-熒光免疫分析方法的設(shè)計

CCK系列神經(jīng)肽具有相同C端(Trp-Met-Asp-Phe-NH2)，用抗原決定簇法以CCK4為模板所制備的MIP對CCK神經(jīng)肽均能特異性識別。圖1為CCK-MIP膜的制備及固相競爭-熒光免疫分析方法設(shè)計示意圖，以抗原決定簇法在硅烷化的玻片表面原位合成MIP膜，洗脫移除模板CCK4后，MIP膜形成能特異性吸附CCK神經(jīng)肽的識別位點。以此MIP膜為固相吸附基質(zhì)，游離的CCK與熒光標(biāo)記的CCK5(FITC-CCK5)競爭性吸附到MIP膜的識別位點，建立固相競爭-熒光免疫分析方法，利用熒光倒置顯微鏡-CCD圖像分析系統(tǒng)對吸附到MIP膜上CCK神經(jīng)肽進(jìn)行定量分析。

圖1 CCK-MIP膜的制備及固相競爭-熒光免疫分析應(yīng)用Fig.1 Schematic illustration of CCK-MIP membrane preparation and its application for competitive immunoassay

2.2 MIP膜聚合條件的選擇優(yōu)化

為制備出對CCK神經(jīng)肽具有特異性識別能力且形貌良好的MIP膜，本實驗對單體的種類及用量、交聯(lián)劑用量等聚合條件進(jìn)行了系統(tǒng)的選擇及優(yōu)化。研究表明，該體系最佳功能單體為MAA，模板與單體最佳比例為1∶4。聚合過程中，通過交聯(lián)劑與硅烷化試劑的作用，MIP膜鍵合到玻片表面，因此交聯(lián)劑的用量是本實驗考察的重點。研究表明當(dāng)單體與交聯(lián)劑比例為1∶6時，所制備的MIP膜特異性吸附能力強(qiáng)、形貌規(guī)整且耐沖洗。

2.3 MIP膜的表征

圖2 為MIP的掃描電鏡(SEM)圖及MIP、NIP和MAA的紅外(IR)光譜圖。由圖2A可見所制備的MIP膜為結(jié)構(gòu)致密、孔徑均勻的交聯(lián)狀聚合物，這為傳質(zhì)提供了良好的場所。從圖2B可以看出，MIP和NIP 特征吸收峰的位置和強(qiáng)度相似，1 729.08 cm-1處為交聯(lián)劑EDMA中C=O伸縮振動吸收峰；與MAA相比，MIP和NIP在1 633 cm-1處的C=C鍵伸縮振動和3 100～3 000 cm-1處 C-H 伸縮振動明顯減弱，由此表明，MAA參與了聚合過程。綜上分析說明，本實驗已經(jīng)成功制備了MIP膜。

圖2 (A)MIP膜掃描電鏡(SEM)圖；(B) NIP、MIP 和MAA的紅外(IR)光譜圖Fig.2 (A) SEM image of MIP membrane;(B)IR spectra of NIP,MIP and MAA

圖3 MIP/NIP膜對CCK4的吸附等溫線Fig.3 Adsorption isotherm of CCK4 on MIP/NIP membrane

2.4 MIP膜吸附容量及選擇性考察

按實驗步驟1.2.3進(jìn)行吸附平衡實驗，圖3是MIP/NIP膜對CCK4的吸附等溫線，MIP膜對CCK4的吸附容量為31.7 μmol/g，而NIP膜僅2.61 μmol/g，印跡因子達(dá)到12，說明MIP膜對CCK4具有高的特異性識別能力。

表1是MIP/NIP膜對6種小肽的吸附容量和印跡因子。表1表明：MIP膜對CCK4、CCK5和CCK8的印跡因子分別為5.6、4.5 和4.3，而對另三種非CCK類的小肽的印跡因子均接近1，說明該MIP膜能選擇性識別CCK神經(jīng)肽。

表1 MIP/NIP膜的吸附容量(Q)和印跡因子(IF)

2.5 基于MIP膜的競爭-熒光免疫分析法測定人腦脊液中CCK神經(jīng)肽

按實驗步驟1.2.5進(jìn)行MIP膜的競爭-熒光免疫實驗，圖4A為競爭吸附后MIP膜熒光圖及平均熒光強(qiáng)度圖，圖4B為由圖4A數(shù)據(jù)繪制的競爭結(jié)合校準(zhǔn)曲線(1)及半對數(shù)曲線(2)。圖4B(1)中B/B0%與CCK5濃度在0～200 pmol/L范圍內(nèi)存在明顯線性關(guān)系，繪制該范圍內(nèi)半對數(shù)曲線如圖4B(2)所示，表2為該競爭性免疫分析方法的線性回歸方程式，線性范圍，相關(guān)系數(shù)和CCK5檢出限。我們所建立的固相競爭-熒光免疫分析方法對CCK神經(jīng)肽檢出限達(dá)到8.91 pmol/L，與文獻(xiàn)所報道的RIA方法檢出限相近[5]。

圖4 (A)競爭吸附后MIP膜熒光圖及其平均熒光強(qiáng)度(FI：所分析的150個圓的熒光強(qiáng)度平均值)；(B) MIP膜競爭結(jié)合校準(zhǔn)曲線及半對數(shù)曲線Fig.4 (A)Quantitative representation of the fluorescence intensities for the fluorescent micrograph(FI:The mean fluorescence intensity of 150 wafers);(B)Competitive binding calibration curve(1) and semi-logarithmic linegraph(2) for the MIP membrane

AnalyteLinear range(pmol/L)Regression equationR2LOD(pmol/L)CCK50-200lgY=1.9898-0.0023X0.99198.91

Y:B/B0(%);X:CCK5 concentration(pmol/L).

按實驗步驟1.2.5對預(yù)處理后的人腦脊液樣品進(jìn)行MIP膜競爭熒光免疫實驗，表3為所測的CCK神經(jīng)肽含量，結(jié)果表明：人腦脊液樣品中CCK神經(jīng)肽的含量與文獻(xiàn)報道接近[17]。

2.6 MIP膜競爭性免疫分析方法評價

為考察該分析方法的重現(xiàn)性，對加標(biāo)腦脊液進(jìn)行3次平行分析。表4是MIP膜競爭性免疫分析方法日間加標(biāo)回收率及精密度，從表中可以看出CCK5的平均加標(biāo)回收率在96.4%～113%之間，加標(biāo)回收率的RSD為2.2%～4.6%。將此MIP膜反復(fù)用于競爭吸附-解吸15次左右，吸附性能略微降低，說明該方法的重現(xiàn)性好且該印跡膜具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，適用于腦脊液樣品中CCK神經(jīng)肽的高靈敏和高選擇性分析。

表3 腦脊液樣品中CCK神經(jīng)肽含量

表4 競爭性免疫分析方法日間加標(biāo)回收率及精密度(n=3)

3 結(jié)論

本研究用抗原決定簇法，在硅烷化的玻片表面合成制備了對CCK神經(jīng)肽具有特異性識別能力的MIP膜。結(jié)合MIP的高選擇性與熒光的高靈敏度，以此MIP膜為固相吸附基質(zhì)，我們研究建立了基于此MIP膜固相競爭-熒光免疫分析方法，該方法可對人腦脊液中CCK神經(jīng)肽進(jìn)行定量分析。實驗結(jié)果表明所制備的分子印跡膜具有特異性強(qiáng)和可重復(fù)利用的優(yōu)點，在縮膽囊素神經(jīng)肽分析中具有良好的應(yīng)用價值。