劉 偉， 張 楠， 李 兵， 范 賽， 屠瑞瑩， 吳國(guó)華， 薛 穎， 趙 榕*

(北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100013)

甲硝唑(Metronidazole，MNZ)屬于硝基咪唑類(lèi)抗生素，其抗菌廣譜，對(duì)厭氧原生動(dòng)物和細(xì)菌十分有效。研究表明，硝基咪唑類(lèi)藥物及其代謝產(chǎn)物具有潛在的動(dòng)物致癌、致畸、致突變作用和遺傳毒性[1 - 2]。氯霉素(Chloramphenicol，CAP)屬于酰氨醇類(lèi)藥物，曾被廣泛地用于動(dòng)物各種傳染性疾病的預(yù)防和治療。氯霉素對(duì)人體有嚴(yán)重的副作用，它能抑制人體骨髓造血功能而引起再生障礙性貧血癥和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病[3 - 4]。甲硝唑和氯霉素早在2002年就被農(nóng)業(yè)部列入禁止用于包括蜜蜂在內(nèi)的所有食用動(dòng)物的物質(zhì)名單中，且不得在動(dòng)物源食品中檢出[5]。然而，在養(yǎng)蜂過(guò)程中，蜂場(chǎng)為避免蜂群感染某些疾病，可能會(huì)違規(guī)使用這些便宜且治療指數(shù)較高的抗生素。蜂蜜中檢出甲硝唑或氯霉素的案例時(shí)有發(fā)生[6]。

目前，關(guān)于蜂蜜中甲硝唑或氯霉素的檢測(cè)主要采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7 - 8]；樣品前處理方法主要采用溶劑直接提取[9]、QuEChERS方法[10]或固相萃取法[11 - 12]。由于甲硝唑與氯霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)有較大差異，在采用串聯(lián)質(zhì)譜作為檢測(cè)器時(shí)，需要分別采用正離子和負(fù)離子采集模式，因此同時(shí)測(cè)定甲硝唑和氯霉素的方法報(bào)道不多。本文報(bào)道的方法可以采用一種前處理過(guò)程同時(shí)對(duì)蜂蜜樣品中殘留的甲硝唑和氯霉素進(jìn)行提取、富集和凈化，并且通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜的正負(fù)離子切換模式達(dá)到甲硝唑和氯霉素的同時(shí)測(cè)定，提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)成本。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters Xevo TQ-S超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)，Waters 公司)；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)，SIGMA公司)；氮?dú)獯蹈蓛x(美國(guó)，Orgnomation公司)；固相萃取裝置(日本，SHIMADZU-GL公司)；InertSep RP-1固相萃取柱(日本，SHIMADZU-GL公司)。

甲硝唑、甲硝唑內(nèi)標(biāo)物(Metronidazole-d4，MNZ-d4)，氯霉素和氯霉素內(nèi)標(biāo)物(Chloramphenicol-d5，CAP-d5)，均購(gòu)自 Dr.Ehrenstorfer，純度 ≥ 99%。乙酸乙酯、甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純(美國(guó)Dikma公司)；實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q系統(tǒng)(美國(guó)，Millipore公司)制得。

1.2 樣品前處理

1.2.1提取稱(chēng)取2 g蜂蜜樣品(精確至0.01 g)于50 mL具塞塑料離心管中，加入50 μL濃度為10 ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)液。向離心管內(nèi)加入5 mL超純水，待蜂蜜完全溶解后再加入20 mL乙酸乙酯，渦旋混勻1 min再置于搖床上振蕩20 min。之后，將離心管置于高速冷凍離心機(jī)中，以10 000 r/min離心5 min，再將上層乙酸乙酯轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中，在40 ℃的水浴中氮?dú)獯蹈?。然后，向離心管中加入10 mL水并渦旋混勻，待固相萃取凈化。

1.2.2凈化InertSep RP-1固相萃取柱預(yù)先用5 mL甲醇和5 mL水進(jìn)行活化與平衡。將10 mL樣品溶液分批倒入固相萃取小柱中；待溶液全部通過(guò)小柱后，用5 mL含10%甲醇水溶液淋洗小柱。再通過(guò)減壓抽干小柱中的水分，采用5 mL含70%甲醇水溶液洗脫目標(biāo)物。洗脫液在40 ℃的水浴中用氮?dú)獯抵两?，加? mL定容液(流動(dòng)相初始比例)，過(guò)0.22 μm濾膜，供儀器測(cè)定。

1.3 儀器條件

1.3.1色譜條件色譜柱:Endeavorsil C18柱(100×2.1 mm，1.8 μm，美國(guó)Dikma公司)；流動(dòng)相：A為水，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～3 min，5%～95%B；3～5 min，95%B；5～7 min，95%～5%B；7～8 min，5%B；流動(dòng)相流速：0.25 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)；甲硝唑?yàn)檎x子模式(ESI+)，氯霉素為負(fù)離子模式(ESI-)；離子源溫度：150 ℃；毛細(xì)管電壓：2.5 V；脫溶劑氣溫度：450 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 甲硝唑與氯霉素的質(zhì)譜參數(shù)與保留時(shí)間

*Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

在串聯(lián)質(zhì)譜上進(jìn)行正負(fù)離子采集模式切換時(shí)，系統(tǒng)通常需要一定的時(shí)間來(lái)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。為了使目標(biāo)物均在系統(tǒng)穩(wěn)定時(shí)得到采集，兩個(gè)目標(biāo)物應(yīng)有適當(dāng)?shù)姆蛛x度。實(shí)驗(yàn)比較了4種不同的流動(dòng)相組合：(1)水+甲醇；(2)水+乙腈；(3)0.1%甲酸水溶液+甲醇；(4)0.1%甲酸水溶液+乙腈。通過(guò)對(duì)梯度洗脫程序進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，確定了采用水與乙腈組成二元流動(dòng)相體系。在此條件下，目標(biāo)物在質(zhì)譜上的響應(yīng)值(峰面積)較高，兩個(gè)組分的峰形和分離度較好。通過(guò)多次進(jìn)樣(n>6)計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表明，采集目標(biāo)物時(shí)系統(tǒng)處于穩(wěn)定狀態(tài)。

2.2 前處理方法的優(yōu)化

針對(duì)蜂蜜樣品和目標(biāo)物的性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)比較了4種不同的前處理方式，包括：(1)采用水直接溶解蜂蜜，再將蜂蜜水溶液進(jìn)行固相萃取凈化；(2)加水溶解蜂蜜后，加入乙酸乙酯萃取目標(biāo)物，取乙酸乙酯層并將溶劑吹干后加入超純水溶解殘?jiān)?，再進(jìn)行固相萃取凈化；(3)采用pH=8.8的磷酸緩沖液溶解蜂蜜，再將樣品溶液進(jìn)行固相萃取凈化；(4)采用QuEChERS前處理方法，用乙腈提取目標(biāo)物，取部分乙腈層吹干溶劑后定容、過(guò)膜，上機(jī)測(cè)定。通過(guò)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)比較回收率表明，采用方法(2)的回收率明顯高于其他3種方式，故對(duì)蜂蜜試樣采用方法(2)前處理方式。

為達(dá)到較好的凈化效果，本實(shí)驗(yàn)前處理采用固相萃取技術(shù)對(duì)兩種目標(biāo)物進(jìn)行同時(shí)富集和凈化。參考文獻(xiàn)確定采用反相機(jī)理的固相萃取柱。根據(jù)目標(biāo)物的理化性質(zhì)，對(duì)固相萃取的淋洗和洗脫曲線(xiàn)進(jìn)行了考察，確定了采用含10%甲醇水溶液作為淋洗液，去除在萃取柱上極性較強(qiáng)、保留相對(duì)較弱的雜質(zhì)；采用含70%甲醇水溶液作為洗脫液以避免有更多極性相對(duì)較弱的雜質(zhì)被洗脫下來(lái)。淋洗曲線(xiàn)和洗脫曲線(xiàn)見(jiàn)圖1與圖2。

圖1 固相萃取淋洗曲線(xiàn)Fig.1 The relationship between rinse solution and recoveries of metronidazole and chloramphenicol

圖2 固相萃取洗脫曲線(xiàn)Fig.2 The relationship between elute solution and recoveries of metronidazole and chloramphenicol

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到線(xiàn)性方程。結(jié)果表明，甲硝唑和氯霉素在1～100 ng/mL范圍內(nèi)，在選定的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定時(shí)，線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999。取陰性蜂蜜樣品進(jìn)行3個(gè)濃度水平(0.5、5和25 μg/kg)的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)6次。由表2可見(jiàn)，目標(biāo)物的回收率范圍為71.4%～122.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)范圍為 5.0%～12.3%，表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度均滿(mǎn)足分析要求。方法檢出限和定量限見(jiàn)表2。

表2 方法檢出限(LODs)、定量限(LOQs)、回收率與精密度(RSDs)

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)市售20種不同蜂蜜樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中1件同時(shí)檢出甲硝唑和氯霉素殘留，含量分別是0.36 μg/kg和0.64 μg/kg。

3 結(jié)論

本文建立了同時(shí)測(cè)定蜂蜜中甲硝唑和氯霉素殘留量的方法。目標(biāo)物采用乙酸乙酯提取，固相萃取富集和凈化，通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜的正負(fù)離子切換模式來(lái)同時(shí)測(cè)定甲硝唑和氯霉素。本方法縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率，靈敏度和準(zhǔn)確度滿(mǎn)足監(jiān)管要求，可用于蜂蜜中甲硝唑和氯霉素殘留的監(jiān)測(cè)。