何思遠(yuǎn)， 王德全， 宋偉明， 劉萬毅， 孟 哲*

(1.寧夏大學(xué)土木與水利工程學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，寧夏銀川 750021)

規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖中大量使用喹諾酮類、四環(huán)素類和磺胺類等各種抗生素，使得原本作為有機(jī)肥料而大量施用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的畜禽糞便資源，有可能轉(zhuǎn)變?yōu)槠茐沫h(huán)境的污染物[1 - 2]。農(nóng)田長期施用不經(jīng)任何處理并殘留有抗生素的糞便，將造成土壤抗生素殘留污染[3]，也可能被作物吸收累積而危及農(nóng)產(chǎn)品安全[4]。磺胺類(Sulfonamides,SAs)抗生素由于普適及廉價，長期大量用于動物疾病的防治和治療以促進(jìn)畜禽生長。研究表明[5]，只有少量抗生素參與動物的新陳代謝而被有效利用，大部分抗生素攜帶抗性基因(ARGs)以原藥、非代謝物形式或活性代謝物被排泄，因此，在動物糞便中很可能有含量較高的抗生素及其活性代謝產(chǎn)物。

目前，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)已經(jīng)成為檢測動物源性食品中抗生素多殘留的主要手段，動物源性食品中相關(guān)磺胺類及其乙酰代謝物殘留的測定已有報道[6 - 7]。在畜禽糞便中各類抗生素殘留的報道中[8 - 9]，磺胺類抗生素的檢出率和殘留量較低，而相關(guān)N4-乙?；前奉惔x產(chǎn)物殘留的檢測未見報道。本研究建立了加速溶劑萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)快速、有效地確認(rèn)及基質(zhì)匹配定量分析方法，用于監(jiān)測實際畜禽養(yǎng)殖場豬糞、雞糞和牛糞中磺胺類及其代謝物的殘留，為糞肥安全施用和土壤污染的控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ASETM350加速溶劑萃取儀(美國，ThermoFisher公司)；Oasis HLB 固相萃取柱(3 mL/60mg，Waters公司)；H2100R臺式高速冷凍離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、渦旋振蕩器、氮吹儀等處理樣品。Xevo TQ超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，Waters 公司)。

磺胺嘧啶(Sulfadiazine，SDZ)、磺胺甲嘧啶(Sulfamerazine，SMR)、磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine，SMZ)、磺胺甲惡唑(Sulfamethoxazole，SMX)、N4-乙?；前粪奏?N4-Acetylsulfadiazine，N4-ASDZ)、N4-乙?；前芳奏奏?N4-Acetylsulfamerazine，N4-ASMR)、N4-乙酰磺胺二甲嘧啶(N4-Acetylsulfamethazine，N4-ASMZ)和N4-乙酰磺胺甲惡唑(N4-Acetylsulfamethoxazole，N4-ASMX)，均購自德國Ehrenstorfer GmbH公司，純度均大于98%。甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，購自迪馬公司(北京)；正己烷、三氯乙酸等其它試劑均為分析純。分別配制8種磺胺類及其代謝產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)品單標(biāo)甲醇儲備液(100 mg/L)和混合標(biāo)準(zhǔn)品甲醇儲備液(含2.5 mg/L的磺胺類和25 mg/L的乙酰代謝物)，貯存于潔凈棕色玻璃瓶內(nèi)，-18 ℃冷藏。實驗用水為超純水。

1.2 樣品采集及預(yù)處理

樣品采集于吳忠市周邊的4個生豬養(yǎng)殖基地、4個肉雞養(yǎng)殖基地和4個奶牛養(yǎng)殖基地的畜禽糞便，分多點取樣各500 g后，混合。采集的樣品在實驗室通風(fēng)處陰干，混勻后、按四分法取樣200 g，研磨，過60目篩，置于-18 ℃冰柜存放。準(zhǔn)確稱取4 g(±0.1 g)經(jīng)研磨的畜禽糞便樣品，加入硅藻土(3～4 g)混合均勻，裝入22 mL的萃取池。優(yōu)化的實驗條件為：萃取壓力10 MPa、加熱溫度120 ℃、加熱時間6 min，靜態(tài)萃取時間5 min；淋洗體積40%、吹掃時間60 s；周期2次；用20%乙腈-5%三氯乙酸(100∶1，V/V)萃取溶劑進(jìn)行加速全自動提取。提取劑約40 mL于萃取瓶中，加10 mL正己烷除脂(連續(xù) 3次)后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近5 mL，轉(zhuǎn)移至10 mL離心管，低溫高速離心(6 ℃、10 000 r/min)，上層清液轉(zhuǎn)移至已經(jīng)活化的Oasis HLB小柱凈化、純水淋洗、0.1%甲酸的甲醇溶液洗脫，洗脫液氮吹至近干，50%甲醇溶液溶解，過0.22 μm微孔濾膜，轉(zhuǎn)移至自動進(jìn)樣瓶，待UPLC-MS/MS分析。

1.3 UPLC-MS/MS分析

UPLC條件：采用Waters Acquity UPLC 色譜儀和 BEH C18色譜柱(50×2.1 mm，1.7 μm)進(jìn)行分析。流動相A為0.1%甲酸的甲醇溶液，流動相B為0.1%甲酸水溶液；流速0.4 mL/min。梯度洗脫程序：0～3 min，初始流動相A由10%線性增加到45%；3～4 min，流動相A增至95%；4～4.1 min，流動相A為100%；4.1～5.1 min，流動相A降為10%并保持2 min，共運行7 min。柱溫40 ℃，樣品池溫度10 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

MS/MS條件：采用三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters Xevo TQ)，使用電噴霧離子源，正離子模式(ESI+)。離子源溫度150 ℃，毛細(xì)管電壓3.0 kV，脫溶劑溫度450 ℃，脫溶劑氣流量(氮氣)850 L/h，碰撞氣氬氣0.16 mL/min。采用多離子反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)掃描，優(yōu)化后的8種磺胺類及其代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 8種磺胺類及其代謝物的保留時間和優(yōu)化的MS/MS質(zhì)譜參數(shù)

a:Transition=precursor ion→product ion;b:Collision energy.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

圖1 8種目標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 μg/L)總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms for 8 analytes at 50 μg/L each in solvent a.SDZ;b.SMR;c.N4-ASDZ;d.SMZ;e.N4-ASMR;f.SMX;g.N4-ASMZ;h.N4-ASMX.

實驗以0.1%甲酸甲醇溶液(A)-0.1%甲酸水溶液(B)作為流動相，在1.3優(yōu)化條件下，8種目標(biāo)分析物可在3 min內(nèi)獲得很好的分離。8種目標(biāo)分析物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 μg/L)的總離子流色譜圖如圖1?？紤]到基質(zhì)效應(yīng)的影響，實驗采用基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液既能有效地減少基質(zhì)效應(yīng)的影響，又能改善由于基質(zhì)帶來的分析誤差。

2.2 加速溶劑萃取-固相萃取柱凈化條件選擇

畜禽糞便樣品中目標(biāo)分析物的提取采用加速溶劑萃取，實驗選擇了20%乙腈、50%乙腈、20%乙腈-5%三氯乙酸(100∶1,V/V)和20%乙腈-10%三氯乙酸(100∶1,V/V)4種提取溶劑，分別對 8種磺胺類及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行提取。對比4種不同提取劑對 8種目標(biāo)化合物提取效率的影響，以20%乙腈為提取劑，回收率在40%～65%之間，高于以50%乙腈為提取劑，但遠(yuǎn)低于以20%乙腈-5%三氯乙酸(100∶1,V/V)為提取劑的提取率78%～96%。實驗表明三氯乙酸的添加有利于目標(biāo)物的提取，但以20%乙腈-10%三氯乙酸(100∶1,V/V)提取對8種目標(biāo)物的提取率在55%～84%之間，其中N4-乙?；前粪奏ず蚇4-乙?；前芳讗哼虻幕厥章实陀?0%。綜合考慮，選擇20%乙腈-5%三氯乙酸(100∶1,V/V)作為提取溶劑，對目標(biāo)物的提取率在78%～96%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于20%。

2.3 方法的分析性能

在優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，以定量離子對的峰面積計算樣品中相應(yīng)待測物的含量。配制基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，建立目標(biāo)化合物的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程見表2。4種磺胺類及相應(yīng)的4種代謝物分別在1.0～200 μg/L和20.0～2 000 μg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2大于0.9921，可以滿足定量分析的要求。根據(jù)1.0 μg/L(含20.0 μg/L的代謝物)基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜峰，以定量離子對3倍信噪比(S/N=3)的響應(yīng)值計算方法檢出限(LOD)，10倍信噪比(S/N=10)的響應(yīng)值計算方法定量限(LOQ)見表2，磺胺類檢出限為0.5 μg/kg低于磺胺類代謝物的檢出限5 μg/kg。

實驗分別考察了空白樣品加標(biāo)水平在10、50和100 μg/kg下，8種磺胺類及其代謝產(chǎn)物的回收率，每個加標(biāo)濃度平行測定5次，采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法進(jìn)行定量計算得到平均回收率如表2。在3個添加水平分析物的平均回收率(63.8%～103.7%)在職業(yè)分析化學(xué)協(xié)會(AOAC)提出的允許范圍之內(nèi)，日內(nèi)RSD在9%以下，日間RSD在13%以下，說明該方法準(zhǔn)確度高，且重現(xiàn)性良好。

表2 8種目標(biāo)分析物的線性范圍、線性方程、檢出限、加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.4 實際樣品的測定

采用本文建立的加速溶劑萃取-UPLC-MS/MS分析方法，依據(jù)歐洲共同體委員會制定2002/657/EC決議[10]，對雞糞、豬糞和牛糞樣品中陽性樣品進(jìn)行確認(rèn)。陽性樣品中可疑目標(biāo)化合物(磺胺類及其代謝物)均滿足：(1)樣品中目標(biāo)物的保留時間與基質(zhì)匹配校準(zhǔn)溶液的保留時間誤差均小于±0.05 min，低于允許誤差±2.5%；(2)選擇多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，每一對診斷離子的信噪比(S/N)都大于3；(3)對96/23/EC指令附錄Ⅰ的B組物質(zhì)(包括磺胺類)的確認(rèn)需要最少3個識別點，在實際樣品中確認(rèn)目標(biāo)化合物的識別點包括母離子(1.0個識別點)、2個MRM特征離子(3.0個識別點)。

基于該方法建立的基質(zhì)匹配定量曲線，對陽性糞便樣品中已被確認(rèn)的目標(biāo)化合物進(jìn)行計算。由測定結(jié)果表明，在雞糞、豬糞和牛糞樣品中均檢測到多種磺胺類抗生素及其N4-乙?；前反x物見圖2。其中磺胺二甲嘧啶和磺胺甲惡唑的檢出率和殘留量較高，檢出率為90%，殘留量的平均值范圍12～34 μg/kg高于相關(guān)文獻(xiàn)報道[8 - 9]的殘留量范圍0～20 μg/kg。磺胺代謝物中，乙酰代謝物N4-乙?；前范奏奏ず蚇4-乙?；前芳讗哼虻臋z出率高達(dá)100%，平均殘留量在雞糞中為58.1～79.1 μg/kg，豬糞中為80.5～104.2 μg/kg，牛糞中為38.3～50.2 μg/kg。在所有畜禽糞便樣品中未能檢測到N4-乙?；前粪奏?未被發(fā)現(xiàn)或含量低于方法定量限)。

2.5 畜禽糞便中磺胺類抗生素及其N4-乙酰代謝物殘留特征的分析

圖2 磺胺類抗生素及其N4-乙酰代謝物殘留的含量分布Fig.2 Distribution of sulfonamides antibiotics and their N4- acetylizad metabolites in animal feces

通過對4個生豬養(yǎng)殖基地、肉雞養(yǎng)殖基地和奶牛養(yǎng)殖基地實際畜禽糞便樣品的分析，大部分的畜禽糞便樣品中可同時檢測出2種以上磺胺類化合物和N4-乙酰磺胺代謝產(chǎn)物，尤其是N4-乙?；前范奏奏ず蚇4-乙酰磺胺甲惡唑的檢測殘留量較高。在畜禽糞便中相關(guān)乙酰磺胺代謝產(chǎn)物測定的數(shù)據(jù)還很少有報道，但高濃度、多種類乙?；前奉惔x物殘留量的監(jiān)測，暗示了畜禽養(yǎng)殖場存在過度使用磺胺類抗生素混合制劑的可能性。

不同畜禽糞便樣品中磺胺類抗生素及其代謝物的殘留量的差異較大(圖2)，其中豬糞>雞糞>牛糞。豬糞中N4-乙?；前反x物含量高達(dá)154.1 μg/kg，雞糞中為97.4 μg/kg，牛糞為65.2 μg/kg，其總殘留量在180.1～384.8 μg/kg范圍。尤其在豬糞和雞糞樣品中，磺胺二甲嘧啶和磺胺甲惡唑的平均殘留量范圍為16.8～34.5 μg/kg和12.0～29.6 μg/kg，而N4-乙?；前范奏奏ず蚇4-乙酰磺胺甲惡唑平均殘留量范圍為80.5～104.2 μg/kg和58.1～79.1 μg/kg。乙?；前奉惔x產(chǎn)物的殘留特征表現(xiàn)為：乙?；前奉惔x物的殘留量基本是相應(yīng)母體磺胺類抗生素殘留量的2倍。表明乙?；前反x物是磺胺類抗生素經(jīng)動物排泄、且具有活性的、穩(wěn)定的最終產(chǎn)物，從而解釋了很多文獻(xiàn)報道磺胺類殘留值很低的原因，也證實了在動物糞便中存在含量較高的活性代謝產(chǎn)物。

3 結(jié)論

按本文建立的方法，可實現(xiàn)畜禽糞便(雞糞、豬糞和牛糞)樣品中多個磺胺類抗生素及其代謝物的測定。基于該方法探討了雞糞、豬糞和牛糞樣品中磺胺類及其N4-乙酰代謝產(chǎn)物殘留量的污染特征。實驗結(jié)果表明，該方法靈敏度高、準(zhǔn)確度好、定性可靠、能滿足實際樣品中磺胺類抗生素和N4-乙酰代謝物的測定，具有較高的實用價值。