田慧青，于景華，王攀，張瑞明

（天津科技大學(xué)，天津300457）

不同WPNI脫脂乳粉對發(fā)酵乳飲料穩(wěn)定性的影響

田慧青，于景華，王攀，張瑞明

（天津科技大學(xué)，天津300457）

以TSI（動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性指數(shù)）、粒徑、Δ BS（背散射光強(qiáng)變化值）為指標(biāo)，比較6種以不同WPNI的脫脂乳粉為原料的發(fā)酵乳飲料體系的穩(wěn)定性，并利用SDS-PAGE分析了發(fā)酵乳飲料的離心沉淀物質(zhì)成分。結(jié)果表明：發(fā)酵乳飲料的原料脫脂乳粉WPNI值越低，即未變性蛋白含量越低，脫脂乳粉熱變性程度越大，產(chǎn)品的TSI值越高，粒徑越大，ΔBS也越大，飲料體系的穩(wěn)定性越差。通過SDS-PAGE分析得到，沉淀物質(zhì)主要為casein，β-lg，α-La，還有少量的Lf和BSA。

脫脂乳粉；WPNI；發(fā)酵乳飲料；穩(wěn)定性

Abstract:This research,using TSI(dynamic stability index),particle size and Δ BS(back scattered light intensity change)as indexes,compared the stability of the fermented milk beverage system produced from six different types of skim milk powder with different WPNI values,and analysised the content the ingredients of centrifugal precipitation in fermented milk beverage with SDS-PAGE.The results showed that lower WPNI value(lower the undenatured protein content)indicates higher the thermal denaturation degree of skim milk power,higher TSI value,larger particle size and larger Δ BS.Besides,stability of the beverage system with lower WPNI value was lower as well.The SDS-PAGE anal?ysis also revealed that the precipitated substances were mainly casein,β-lg,α-La,and a small amount of Lf,BSA.

Key words:skim milk powder;WPNI;fermented milk beverage;stability

0 引言

在生產(chǎn)和研究中，脫脂乳粉通常會(huì)作為乳制品和乳飲料的主要原料，不同來源的原料對產(chǎn)品的口感、質(zhì)構(gòu)、穩(wěn)定性發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。不同WPNI的脫脂乳粉本質(zhì)區(qū)別在于乳清蛋白變性程度不同。不同WPNI脫脂乳粉乳清蛋白變性程度的不同會(huì)影響到后期產(chǎn)品穩(wěn)定性體系中乳清蛋白與乳清蛋白之間以及乳清蛋白與酪蛋白之間的反應(yīng)，進(jìn)而影響到發(fā)酵乳飲料的穩(wěn)定性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與儀器

脫脂乳粉1，脫脂乳粉2，脫脂乳粉3，脫脂乳粉4，脫脂乳粉5，脫脂乳粉6，葡萄糖，白砂糖，檸檬酸鈉，檸檬酸，復(fù)配穩(wěn)定劑（2158-1B），副干酪乳桿菌，α-乳白蛋白（α-La，＞85%），β-乳球蛋白（β-Lg，＞90%），牛血清白蛋白（BSA，＞90%），低相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。

MODEL均質(zhì)機(jī)，YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌鍋，HWS24型電熱恒溫水浴鍋，HWS24型電熱恒溫水浴鍋，Turbiscan Lab穩(wěn)定性分析儀，DYCZ–24DN型電泳儀。

1.2 方法

分別以12%的已知WPNI值的脫脂乳粉1（7.85），脫脂乳粉 2（4.44），脫脂乳粉 3（4.02），脫脂乳粉 4（3.19），脫脂乳粉5（2.89），脫脂乳粉6（1.14）為原料，加入6%葡萄糖干拌混勻，加入50～55℃的水，攪拌溶解，放入45～50℃的水浴鍋中水合30 min；然后用高壓蒸汽滅菌鍋殺菌（95℃，1 h）；待溫度降至30～40℃時(shí)，在無菌環(huán)境下進(jìn)行接種副干酪乳桿菌（0.0105%），封口后放入37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行恒溫發(fā)酵72 h；發(fā)酵至終點(diǎn)后取出置于4℃冰箱中后熟1～2 d；用70～80℃的水將白砂糖和檸檬酸鈉溶解，殺菌（95℃，5 min）；待溫度降至40℃左右，將它與發(fā)酵乳基料按照3∶1的比例進(jìn)行混合；將混料攪拌均勻后，用5%的檸檬酸和檸檬酸鈉溶液調(diào)pH值至3.80；然后在30 MPa下進(jìn)行均質(zhì)，無菌灌裝，待溫度降至室溫后放入4℃環(huán)境下保藏待測[1-3]。

1.2.1 TSI值、粒徑、Δ BS的測定

Turbiscan分析儀測定原理：采用Turbiscan分析儀對樣品進(jìn)行穩(wěn)定性測試，將待測樣品裝進(jìn)一圓柱形玻璃測試室中，儀器采用了脈沖近紅外光源（λ=880nm），當(dāng)測試室內(nèi)透明度較差時(shí)，分析儀的兩個(gè)同步光學(xué)探測器獲得兩部分組成的發(fā)射光斑，分別為探測透過樣品的透射光和被樣品反射的反射光。光學(xué)探測頭從低于樣品測試室底部的2 mm處起沿樣品測試室向上掃描，最大高度為55 mm，每40 mm高度采集一次透射光和反射光數(shù)據(jù)。透射光和反射光強(qiáng)度以%表示，其含義是相對標(biāo)準(zhǔn)樣品光通量為10%的硅油的光通量的百分比。對于透明體系，選取透射光的透過率(T%)為指標(biāo)，不透明體系則選取背散射光的反射率(BS%)為指標(biāo)，發(fā)酵乳飲料屬于不透明體系，其穩(wěn)定性評價(jià)指標(biāo)為BS。掃描曲線給出了不同掃描時(shí)間透射光和反射光隨樣品高度的變化關(guān)系。以樣品初始BS為對照，不同觀察時(shí)間的BS與之的差值（Δ BS）反映其體系的變化，從而放大了樣品在測定時(shí)間內(nèi)微觀特征變化。穩(wěn)定分析儀給出的評價(jià)指標(biāo)是樣品觀察時(shí)間內(nèi)背散射光的平均變化率，也稱穩(wěn)定動(dòng)力學(xué)參數(shù)(dynamic stability index，TSI)。TSI與體系穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，TSI值越小，體系越穩(wěn)定，TSI值越大，體系越不穩(wěn)定[4]。

實(shí)驗(yàn)測定步驟：取樣品約20 mL加入樣品池，加蓋后置于儀器的樣品槽中，設(shè)定20 min掃描1次，共掃描7 h。可以直接得到樣品的TSI值，并通過軟件TLAB Expert計(jì)算可以得到體系的顆粒粒徑。

1.2.2 產(chǎn)品離心沉淀物的SDS-PAGE分析

發(fā)酵乳飲料經(jīng)4 000 r/min（10 min）離心后取沉淀物質(zhì)1 g復(fù)原于10 mL蒸餾水中45℃水浴鍋中水合20 min，與上樣緩沖液以1∶1比例混合，上樣量為20 μL。分離膠體積分?jǐn)?shù)為15%，濃縮膠體積分?jǐn)?shù)為5%。預(yù)電泳電壓為80 V，進(jìn)入分離膠后為120 V。分離膠濃縮膠配方如表1所示。

表1 分離膠和濃縮膠配制表

2 結(jié)果與討論

2.1 不同WPNI脫脂乳粉的發(fā)酵乳產(chǎn)品的TSI值比較

圖1為不同WPNI脫脂乳粉為原料的發(fā)酵乳飲料的TSI值。圖1中，LT1,LT2,LT3,LT4,LT5,LT6分別為以脫脂乳粉1,2,3,4,5,6為原料的發(fā)酵乳飲料。

圖1 不同WPNI脫脂乳粉為原料的發(fā)酵乳飲料的TSI值

表2 不同發(fā)酵乳飲料貨架期預(yù)測值

利用穩(wěn)定性分析儀測定以不同WPNI脫脂乳粉為原料的發(fā)酵乳飲料，并通過TLAb Expert軟件得到測定時(shí)間內(nèi)樣品整體TSI的變化值。由圖1可以看出，以不同WPNI脫脂乳粉為原料的發(fā)酵乳飲料其TSI值不同。以脫脂乳粉6為原料的發(fā)酵乳飲料的TSI值顯著高于其余5種發(fā)酵乳飲料，穩(wěn)定性最差。除了脫脂乳粉6，其余5種脫脂乳粉為原料的發(fā)酵乳飲料的TSI值較接近，大致在0.85～1.28之間。由表2可知，脫脂乳粉的WPNI值與對應(yīng)的發(fā)酵乳飲料產(chǎn)品的TSI值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即脫脂乳粉的WPNI值越低，TSI值越高，也就是脫脂乳粉中未變性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，產(chǎn)品穩(wěn)定性越高。這主要是因?yàn)橛绊懨撝榉蹮嶙冃猿潭鹊年P(guān)鍵技術(shù)在預(yù)熱殺菌階段，高溫加熱脫脂乳粉經(jīng)過預(yù)熱殺菌后，90%的β-Lg和40%的α-La發(fā)生變性，乳粉功能特性發(fā)生巨大變化，其中包括：乳清蛋白的變性、變性的乳清蛋白與酪蛋白膠束的交聯(lián)、可溶性鈣和磷酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)槟z體相，殺滅細(xì)菌以及酶的失活[5]等等。低、中熱脫脂乳粉在生產(chǎn)過程中熱處理強(qiáng)度小，未變性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，使其保留了較好的乳化穩(wěn)定性，脫脂乳粉的乳化性使蛋白質(zhì)發(fā)揮其兩親性，當(dāng)?shù)鞍走w移達(dá)到油-水結(jié)合平衡后，油-水界面形成的高彈性薄膜可以承受一定程度機(jī)械沖擊，從而維持乳飲料的穩(wěn)定狀態(tài)。由此可見，發(fā)酵乳飲料穩(wěn)定性與所用原料脫脂乳粉的WPNI有關(guān)，且產(chǎn)品穩(wěn)定性隨脫脂乳粉WPNI值的降低而降低。

2.2 不同WPNI脫脂乳粉的發(fā)酵乳產(chǎn)品的粒徑比較

圖2為不同WPNI脫脂乳粉的為原料的發(fā)酵乳飲料的粒徑。圖2中，LT1，LT2，LT3，LT4，LT5，LT6分別為以脫脂乳粉1，2，3，4，5，6為原料的發(fā)酵乳飲料。

圖2 不同WPNI脫脂乳粉的為原料的發(fā)酵乳飲料的粒徑

利用穩(wěn)定性分析儀測定以不同WPNI脫脂乳粉為原料的發(fā)酵乳飲料，并通過TLAb Expert軟件得到測定時(shí)間內(nèi)樣品池中部粒徑的變化值。由圖2可以看出，以脫脂乳粉1，2，3，4，5為原料的發(fā)酵乳飲料粒徑值均沒有明顯變化，而以脫脂乳粉6為原料的發(fā)酵乳飲料粒徑有明顯減小趨勢，這是因?yàn)橐缘?、中熱脫脂乳粉為原料的發(fā)酵乳飲料體系相對穩(wěn)定，但是以高熱脫脂乳粉為原料的發(fā)酵乳飲料體系不穩(wěn)定，感官觀察在樣品池中下部出現(xiàn)了明顯分層，而粒徑值的測定選取的位置為樣品池的中部，所以樣品出現(xiàn)明顯分層是發(fā)酵乳飲料6的粒徑呈減小趨勢的原因。從粒徑值大小的比較來看，原料脫脂乳粉的WPNI值越低，粒徑值越大。根據(jù)Stocks定律，在發(fā)酵乳飲料乳濁液體系中，蛋白粒子密度比水相密度大，當(dāng)水相不足以支撐蛋白粒子時(shí)，蛋白粒子就會(huì)下沉，最終生成沉淀，因此粒徑越大，飲料體系越不穩(wěn)定[6-7]。發(fā)酵乳飲料的粒徑隨脫脂乳粉WPNI值的降低而增大，這說明脫脂乳粉的受熱程度越大，對應(yīng)的發(fā)酵乳飲料體系越不穩(wěn)定。

2.3 不同WPNI脫脂乳粉發(fā)酵乳產(chǎn)品的Δ BS值比較

利用穩(wěn)定性分析儀測定以不同WPNI脫脂乳粉為原料的發(fā)酵乳飲料穩(wěn)定性，并得到它們在測定時(shí)間內(nèi)的Δ BS，分別如圖3（圖中橫坐標(biāo)代表樣品池的高度，左側(cè)為樣品池底部）所示。

由圖3可以看出，以脫脂乳粉1，2，3為原料的產(chǎn)品的Δ BS在5%～10%之間，而以脫脂乳粉4，5，6為原料的產(chǎn)品的Δ BS均在10%以上。由此說明，發(fā)酵乳飲料產(chǎn)品體系的穩(wěn)定性與脫脂乳粉的未變性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)有很大關(guān)系。脫脂乳粉在生產(chǎn)過程中，當(dāng)受熱程度較小時(shí)，α-La變性程度較小，主要是β-Lg的變性，β-Lg變性后附著在酪蛋白膠束表面，附屬絲狀物形成“溝壑”狀態(tài)，此時(shí)表面疏水性很高，隨著加熱強(qiáng)度的增大，α-La開始變性，覆蓋在β-Lg絲狀物，填滿了“溝壑”，這樣在酪蛋白上形成了光滑的膠束表面，此時(shí)乳清蛋白與酪蛋白形成了聚合物。發(fā)酵乳飲料pH值在3.6～4.4之間，低于酪蛋白的等電點(diǎn)（4.6），此時(shí)發(fā)酵乳飲料體系中的酪蛋白極不穩(wěn)定，在乳清蛋白的促進(jìn)作用下，兩者的聚合物發(fā)生變性沉淀[8-10]。這種現(xiàn)象在以脫脂乳粉6為原料的發(fā)酵乳飲料中有明顯表現(xiàn)，由圖3（f）可以看出，兩種產(chǎn)品的Δ BS均發(fā)生很大的波動(dòng)，從不同時(shí)間對產(chǎn)品掃描曲線的變化來看，兩者都發(fā)生了明顯分層，這主要是因?yàn)楦邷丶訜崦撝榉墼谏a(chǎn)過程中乳清蛋白發(fā)生了很大程度的變性。

2.4 SDS-PAGE分析

對以不同WPNI脫脂乳粉為原料的產(chǎn)品4 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min得到的沉淀物質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖4所示。

圖3 不同WPNI脫脂乳粉為原料的發(fā)酵乳飲料的Δ BS值

圖4 不同WPNI脫脂乳粉的發(fā)酵乳飲料離心沉淀物的SDS-PAGE分析

由圖4可以看出，以脫脂乳粉1，2，3，4，5，6為原料的產(chǎn)品的各乳清蛋白條帶依次變淺，由此說明脫脂乳粉WPNI值越低，所得產(chǎn)品離心沉淀物中乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)越低，其中以脫脂乳粉6為原料的產(chǎn)品沉淀物質(zhì)中幾乎沒有α-La、β-lg、BSA、IgH，只有少量的Lf，這是因?yàn)殡S著受熱程度的增加，參加聚合反應(yīng)的乳蛋白增多，乳粉中未變性乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，乳飲料產(chǎn)品中未變性乳清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)也相應(yīng)降低。從各條帶上可以看出，沉淀物質(zhì)主要為casein、β-lg、α-La，還有少量的 Lf和 BSA，很明顯β-lg比α-La參與聚合反應(yīng)少，這是因?yàn)棣?La與Ca2+結(jié)合后有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，變性后可復(fù)性。β-Lg的熱變性在乳清蛋白和酪蛋白膠束聚合反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，加熱條件下，天然β-Lg二聚體解離后，單體經(jīng)過分子內(nèi)二硫鍵反應(yīng)形成活性單體，和酪蛋白膠束表面的κ-CN發(fā)生二硫鍵反應(yīng)，結(jié)合到膠束上；α-La的變性程度也會(huì)因β-Lg的存在而增加，因?yàn)樵诩訜釛l件下α-La先與β-Lg相互反應(yīng)生成復(fù)雜的中間產(chǎn)物，再與酪蛋白膠束結(jié)合。因此，通過以不同熱變性脫脂乳粉為原料的LT離心沉淀物在的SDS-PAGE分析得到，產(chǎn)品中沉淀物質(zhì)主要為casein，β-lg，α-La，還有少量的Lf和BSA，且原料脫脂乳粉WPNI值越低，所得產(chǎn)品離心沉淀物中未變性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)越低。

3 結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)得到發(fā)酵乳飲料的原料脫脂乳粉WP?NI值越低，即未變性蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)越低，脫脂乳粉熱變性程度越大，產(chǎn)品的TSI值越高，粒徑越大，Δ BS也越大，飲料體系的穩(wěn)定性越差。通過SDS-PAGE分析發(fā)酵乳飲料的離心沉淀物得到，沉淀物質(zhì)主要為ca?sein，β-lg，α-La，還有少量的Lf和BSA。

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Study on the stabilization system of fermented milk drinks induced by skimmed milk power of different WPNI

TIAN Huiqing,YU Jinghua，WANG Pan，ZHANG Ruiming
（Tianjin university of science and technology,Tianjin 300457）

TS252.51

A

1001-2230（2017）09-0026-04

2017-02-23

國家自然科學(xué)基金(31271904)。

田慧青(1990-)，女，研究生，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。

于景華