趙延兵，秦 雯，張 偉，牛馨苗，付俊敏，李世朋

Slug與KISS-1在肝細胞癌的表達與意義

趙延兵1，秦 雯1，張 偉1，牛馨苗1，付俊敏2，李世朋1

目的 探討Slug與KISS-1在肝細胞癌組織中表達與意義。方法 采用qRT-PCR與免疫組織化學法檢測肝細胞癌組織和正常肝臟組織中Slug與KISS-1的mRNA及蛋白水平的表達。結果 肝細胞癌組織中Slug mRNA表達明顯高于正常肝臟組織，而肝細胞癌組織中KISS-1 mRNA表達明顯低于正常肝臟組織（均P＜0.05）；肝細胞癌組織中Slug蛋白陽性率高于正常組織，而KISS-1蛋白陽性率低于正常組織（均P＜0.05）；且兩者表達呈負相關（r＝-0.877，P＜0.05）。結論 Slug與KISS-1在肝細胞癌中的表達呈負相關，二者在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移過程中可能存在拮抗作用。

Slug；KISS-1；肝細胞癌；mRNA；

Abstract：Objective To investigate the expression and its significance of Slug and KISS-1 in hepatocellular carcinomas. Methods qRT-PCR and immunohistochemistry were used to detect the mRNA and protein expression of Slug and KISS-1 in the cancer tissues from hepatocellular carcinomas and normal tissues. Results The expression of Slug mRNA in hepatocellular carcinoma was higher than that in normal liver tissues.However，the expression of KISS-1 mRNA in hepatocellular carcinoma was lower than that in normal liver tissues（all P＜0.05）.The positive rate of Slug protein was significantly higher in the cancer tissues than that in normal tissues，but the positive rate of KISS-1 protein was significantly lower in cancer tissues than that in normal tissues（all P＜0.05）.There was a negative correlation between the two expressions（r＝-0.877，P＜0.05）. Conclusion The expression of Slug was negative correlation to KISS-1 in hepatocellular carcinomas，and they might play antagonistic action in the process of development and metastasis of hepatocellular carcinomas.

Key words：Slug；KISS-1；hepatocellular carcinoma；mRNA

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國常見的惡性腫瘤之一，因其惡性程度高、侵襲力強而易發(fā)生轉移，肝癌患者預后較差［1］。近些年來，發(fā)現(xiàn)核因子Slug在骨肉瘤發(fā)生和進展中發(fā)生作用［2］。而KISS-1基因是在人類黑色素細胞株中發(fā)現(xiàn)的腫瘤轉移抑制基因，其異常表達與結腸癌細胞發(fā)生、發(fā)展存在著密切的關系［3］。本文通過分子生物學技術檢測Slug、KISS-1在肝細胞癌組織中表達，分析兩者的相關性，為肝細胞癌浸潤和轉移的研究提供理論依據(jù)，報道如下。

1 材料與方法

1.1 組織標本 本研究標本收集于焦作市人民醫(yī)院2004年9月至2014年12月接受肝癌切除手術治療的30例患者。其中新鮮凍存的肝癌組織12例與存檔的石蠟標本30例。另取20例正常肝臟組織標本（新鮮凍存的組織標本9例與存檔石蠟標本20例），所有病例均由兩位病理醫(yī)師診斷，病理類型均為肝細胞癌，所有病例均有完整臨床病歷資料。

1.2 主要試劑與儀器 總RNA提取試劑盒（Sigma-Aldrich公司，美國），反轉錄試劑盒（TaKaRa公司，日本），引物（Slug，F(xiàn)：GGCACTTAGACCACCTTA，R：AAATCCCTCATAATAGACAC；KISS-1，F(xiàn)：ACCTGCCGAACTACAACTGG，R：TCCCTTAGCCCTACGTCCC；β-actin，F(xiàn)：CATGTACGTTGCTATCCAGGC，R：CTCCTTAATGTCACGCACGAT）購于上海生工公司，熒光定量試劑盒（Roche公司，瑞士），兔源一抗 Slug（CST公司，美國）和KISS-1（CST公司，美國），二步法免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。主要儀器：iQ5熒光定量 PCR檢測系統(tǒng)（Bio-Rad，美國），LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)（UVP，美國），F(xiàn)-4500型熒光檢測儀（HITACHI，日本），UV-2000型可見／紫外分光光度計（UNICO，美國）。

1.3 QRT-PCR檢測 Slug與 KISS-1 mRNA表達肝臟組織總RNA提取參照試劑盒說明進行，然后逆轉錄合成 cDNA作為模板，qRT-PCR反應條件：56℃，10 s；95℃，5 min；95℃；20 s；循環(huán) 35次，60℃，1 min，50μL反應體系。目的基因量 ＝2-△△CT，2-△△CT表示的是實驗組目的基因表達相對于對照組變化的倍數(shù)。△△CT ＝實驗（CT目的基因-CTβactin）-對照（CT目的基因-CTβ-actin）。

1.4 免疫組化檢測 Slug與 KISS-1表達與分布將肝臟石蠟標本作連續(xù)切片，63℃烤片，然后脫蠟、水化、3%H2O2孵育 22 min；微波爐抗原修復 12 min，然后自然緩慢冷卻至室溫。然后按照免疫組化試劑盒說明書進行染色，一抗（Slug與 KISS-1）4℃濕盒中孵育過夜。然后滴加含有二抗的工作液，最后DAB試劑盒顯色，然后復染、脫水、透明、封片與鏡檢拍照。采用半定量積分法依據(jù)染色強度和陽性細胞百分率判斷染色結果［3］。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。獨立樣本的比較采用t檢驗，構成比的比較采用 χ2檢驗，相關性分析采用 Spearman相關檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 qRT-PCR結果 肝細胞癌組織中Slug mRNA表達水平（19.75±2.45）明顯高于正常肝臟組織（6.15±1.65），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.5）；而肝細胞癌組織中 KISS-1 mRNA表達水平（13.75±3.79）明顯低于正常肝臟組織（1.95±0.35），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 免疫組化結果 Slug蛋白染色主要定位于肝癌細胞核內，KISS-1蛋白染色主要存在于肝癌細胞漿內，見圖1。Slug在肝細胞癌組織中的表達明顯高于正常肝臟組織，差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝12.167，P＜0.001），見表1。KISS-1蛋白在肝細胞癌組織中的陽性率顯著低于正常肝組織，差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝25.301，P＜0.001），見表 2。采用配對資料的檢驗；表明兩種蛋白在肝細胞癌中的表達存在負相關（rs＝-0.877，P＜0.001），見表 3。

圖1 Slug和KISS-1蛋白在肝細胞癌中的表達

表1 Slug在不同肝臟組織中的表達 例

表2 KISS-1在不同肝臟組織中的表達 例

表3 Slug與KISS-1在肝癌組織表達的相關性 例

3 討論

癌細胞侵襲和轉移是影響肝細胞癌預后的重要因素之一，遺傳表觀學與分子生物學研究表明腫瘤細胞一些基因活性的改變及其表達產(chǎn)物在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移和預后等一系列病理生理過程中發(fā)揮著關鍵作用［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)Slug的異常激活可促進腫瘤細胞生長、增殖，增強腫瘤細胞的運動、侵襲能力，同時抑制細胞凋亡［6］。Snail、Slug和KAI1蛋白的表達水平在宮頸鱗狀細胞癌（cervix squamous cell carcinoma，CSCC）組織中與腫瘤組織的分化程度、國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，IFGO）分期、浸潤深度、淋巴結轉移與否及預后等均有關，在 CSCC組織中早期聯(lián)合檢測 Snail、Slug和 KAI1對判斷預后有價值［7］。RT-PCR半定量結果顯示 HIF-1α、MT、Slug和E-鈣黏附蛋白在乳腺癌中的表達可作為監(jiān)測乳腺癌發(fā)展的指標［8］。本研究在肝細胞癌組織中 Slug mRNA表達明顯高于正常肝臟組織，同時，肝細胞癌組織中的Slug蛋白水平明顯高于肝臟正常組織。結果提示，Slug的異常表達在促進肝癌細胞生長、增殖，促進細胞運動、侵襲過程中可能發(fā)揮重要作用。

KISS-1基因是一種腫瘤轉移抑制基因，能明顯抑制腫瘤細胞的生物學行為，并有限制腫瘤細胞侵襲與遷移的能力。過表達的KISS-1可明顯抑制大腸癌細胞的侵襲能力，并通過 PI3K／AKT NF-κB通路降低基質金屬蛋白酶9（matrix metalloprotein 9，MMP-9）的表達［9］。將過表達 KISS-1重組質粒轉染至SW480結腸癌細胞，過表達KISS-1組細胞增殖率明顯低于對照組，且高表達KISS-1組細胞劃痕損傷愈合的速度明顯下降。因此，高表達KISS-1可抑制結腸癌 SW480細胞的增殖，降低細胞遷移速度［10］。KISS-1基因甲基化狀態(tài)有望成為評估結直腸癌轉移風險的重要指標［11］。而且，KISS-1對宮頸癌的浸潤及轉移有抑制作用，聯(lián)合檢測KISS-1和MMP-2的表達有望成為判定宮頸癌浸潤及轉移能力的重要指標之一［12］。在肝癌組織中，KISS-1和MMP-9的表達呈負相關性，KISS-1和MMP-9的表達失衡與肝癌細胞侵襲轉移有關，KISS-1的缺失表達可作為預測HCC轉移潛能的參考指標［13］。

本研究中肝細胞癌組織中KISS-1 mRNA及蛋白水平較正常肝臟組織均降低。同時，本研究表明Slug與KISS-1在肝細胞癌組織中的表達呈負相關（r＝-0.877，P＜0.001）。因此推測 Slug和 KISS-1在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移過程中可能存在拮抗作用。

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Expression and Its Significance of Slug and KISS-1 in Hepatocellular Carcinomas

ZHAO Yan-bing1，QIN Wen1，ZHANG Wei1，NIU Xin-miao1，F(xiàn)U Jun-min2，LI Shi-peng1
（1.Second Department of General Surgery，Jiaozuo People′s Hospital，Jiaozuo 454002，China；2.Key Laboratory of Pharmacology and Medical Molecular Biology，Medical College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China）

R735.7

A

1672-688X（2017）03-0166-03

10.15926／j.cnki.issn1672-688x.2017.03.002

河南省教育廳自然科學研究項目（2007310002）

2017-01-14

1.焦作市人民醫(yī)院普外二區(qū)，河南焦作454002 2.河南科技大學藥理學與醫(yī)學分子生物學重點實驗室，河南洛陽471003

趙延兵（1975—），男，河南溫縣人，副主任醫(yī)師，從事普外疾病的診治與研究工作。