趙明濤，鄭璞*，邢晨光，劉思琴，趙希景，陳鵬程

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 2(廈門歐米克生物科技有限公司，生物工程試驗(yàn)室，福建 廈門，361000)

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中胡椒醛、胡椒酸以及黃樟油素

趙明濤1，鄭璞1*，邢晨光2，劉思琴1，趙希景2，陳鵬程1

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 2(廈門歐米克生物科技有限公司，生物工程試驗(yàn)室，福建 廈門，361000)

建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中胡椒醛、胡椒酸以及黃樟油素的分析方法。采用梯度洗脫程序，流動(dòng)相為A：乙腈，流動(dòng)相B：0.1%甲酸水溶液，Amethyst C18-H反相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，胡椒醛、胡椒酸以及底物黃樟油素能夠良好分離，且平均加標(biāo)回收率在98.0%～101.0%，精密度偏差在0.5%～2.0%范圍內(nèi)。 用此方法測(cè)得液化沙雷氏菌CCTCC No：M2016170發(fā)酵液中含有182 mg/L 胡椒醛和9.8 mg/L胡椒酸。

高效液相色譜；胡椒醛；胡椒酸；液化沙雷氏菌；發(fā)酵液

胡椒醛(Piperonal)，又稱洋茉莉醛(Heliotropine)，化學(xué)名稱為3，4-亞甲二氧基苯甲醛。19世紀(jì)中葉，F(xiàn)ITTING和MIELCH在研究胡椒堿的水解以及氧化過程中發(fā)現(xiàn)了胡椒醛[1]。胡椒醛在香英豆、刺槐花等植物中少量存在，被廣泛應(yīng)用于食用香精、皂用、化妝品、醫(yī)藥以及電鍍等工業(yè)，是世界上最主要的香料之一[2]。目前，胡椒醛的工業(yè)生產(chǎn)主要由化學(xué)合成，但是化學(xué)合成過程中存在環(huán)境污染、產(chǎn)率低、操作難度大等缺陷。近年來，生物技術(shù)合成胡椒醛的研究逐漸興起[3]。一些微生物能夠通過微生物發(fā)酵或添加前體轉(zhuǎn)化產(chǎn)生芳香醛、芳香酸等物質(zhì)。因此，準(zhǔn)確測(cè)定發(fā)酵過程中底物的消耗，產(chǎn)物胡椒醛及其胡椒酸的生成，對(duì)于研究利用微生物生產(chǎn)胡椒醛具有重要意義。

目前定量測(cè)定發(fā)酵液中的芳香醛類主要采用高效液相色譜法( high performance liquid chromatography，HPLC)[4-6]，氣相色譜法( gas phase chromatography，GC)[7-8]。RYU[9-10]等利用高效液相色譜法，采用梯度洗脫程序,對(duì)微生物發(fā)酵液中的丁香酚、異丁香酚、香蘭素以及阿魏酸等苯丙素類化合物進(jìn)行了定量測(cè)定。但在胡椒醛的微生物法制備中，一般采用GC方法測(cè)定發(fā)酵液中的產(chǎn)物含量。如SANTOS[7-8]等以氫氣為載氣檢測(cè)真菌、酵母和細(xì)菌發(fā)酵液中的胡椒醛。其中Aspergillus、Cladosporium,Peacilomyces和Pseudomonas三株菌株的發(fā)酵液最高含64 mg/L 胡椒醛。本課題組前期篩選到1株能夠發(fā)酵產(chǎn)胡椒醛的液化沙雷氏菌CCTCC No：M2016170，本文通過建立梯度洗脫高效液相色譜法，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測(cè)發(fā)酵液中的胡椒醛、胡椒酸以及黃樟油素，為進(jìn)一步選育高產(chǎn)菌株和優(yōu)化發(fā)酵工藝奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑

HITACHI Chromaster 高效液相色譜儀，HITACHI Chromaster 5430 DVD檢測(cè)器，HITACHI Chromaster 5110 泵結(jié)構(gòu)，HITACHI Chromaster 5319 柱溫箱，HITACHI Chromaster 5210 自動(dòng)進(jìn)樣器；美國(guó)賽分科技有限公司Amethyst C18-H反向柱(4.6 mm×250 mm，5μm)。

乙腈為色譜純，乙酸乙酯和甲酸均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

標(biāo)準(zhǔn)品：胡椒醛和黃樟油素，由廈門嘉盟生物科技有限公司；胡椒酸，北京百靈威科技有限公司。

1.2菌種

液化沙雷氏菌(SerratialiquefaciensCCTCC No：M2016170)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，從黑龍江原始森林土壤中篩選獲得。

1.3菌株培養(yǎng)以及發(fā)酵條件

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，葡萄糖10 g，蒸餾水1 L，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：NH4NO31 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO40.5 g，K2HPO41.5 g，NaCl 0.5 g，酵母膏0.5 g，葡萄糖5 g，蒸餾水1 L，pH 7.0。

發(fā)酵條件：將斜面保藏的液化沙雷氏菌接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30 ℃下培養(yǎng)15～20 h。然后種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃下培養(yǎng)20 h，然后向發(fā)酵液中加入底物至終質(zhì)量濃度1 g/L，繼續(xù)發(fā)酵48 h。

1.4樣品的處理

取5 mL發(fā)酵液，用2倍體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取液利用0.45 μm的有機(jī)濾膜過濾，過濾液進(jìn)樣檢測(cè)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取一定量的胡椒醛、胡椒酸以及黃樟油素，用乙酸乙酯配制成質(zhì)量濃度均為1 g/L的混合標(biāo)樣。

1.5.2 HPLC檢測(cè)條件

色譜柱：Amethyst C18-H反向柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；UV檢測(cè)器；流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：0.1%甲酸水溶液；柱溫30～40 ℃；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；進(jìn)樣量10 μL；梯度洗脫程序見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1胡椒醛、胡椒酸和黃樟油素分離條件的選擇

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用RYU[9-10]等報(bào)道的270 nm。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

根據(jù)RYU[9-10]等的報(bào)道，對(duì)于苯丙素類化合物可以采用乙腈與水作為流動(dòng)相測(cè)定，流動(dòng)相中添加適量甲酸可以調(diào)節(jié)pH以抑制其相應(yīng)酸的解離，改善色譜峰型、提高分離度[11-12]。本文先分別選用2種不同比例的流動(dòng)相[V(乙腈)∶V(水)∶V(甲酸)=55∶45∶0.1和V(乙腈)∶V(水)∶V(甲酸)=70∶30∶0.1]，比較采用等度洗脫方法分離胡椒醛、胡椒酸以及黃樟油素的情況(圖1)。樣品用乙酸乙酯溶解。從圖1A中可以看出，胡椒醛與胡椒酸不能分離，黃樟油素與乙酸乙酯的出峰存在疊加(18 min 處)，并且黃樟油素出現(xiàn)不良峰型。改變流動(dòng)相配比，如圖1B所示，胡椒醛、胡椒酸以及黃樟油素的出峰時(shí)間均提前，但仍不能達(dá)到分離的效果。

1-胡椒醛和胡椒酸；2-黃樟油素圖1 混合標(biāo)樣等度洗脫色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard sample using isocratic elution

改用梯度洗脫程序(表1)，其中流動(dòng)相為A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液。隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的增加，待測(cè)物質(zhì)根據(jù)極性強(qiáng)弱順序出峰，能很好地實(shí)現(xiàn)基線分離，分離度好(R>1.5)，并且峰型良好(圖 2)。

表1 梯隊(duì)洗脫程序

1-胡椒酸;2-胡椒醛;3-黃樟油素圖2 混合標(biāo)樣梯度洗脫色譜圖Fig.2 Chromatograms of mixed standard sample using gradient elution

2.1.3 柱溫

分別選取柱溫30、35和40 ℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖 3)，柱溫對(duì)待測(cè)物質(zhì)的分離影響較小，雖然隨著柱溫的上升，待測(cè)物質(zhì)保留時(shí)間在提前，但幅度較小，并沒有出現(xiàn)峰疊加、峰型過寬等問題。

■-胡椒酸；●-胡椒醛；▲-黃樟油素圖3 柱溫對(duì)胡椒醛、胡椒酸以及黃樟油素保留時(shí)間的影響Fig.3 Effect of column temperature on the retention time of piperonal,piperonylic acid and safrole

2.2外標(biāo)工作曲線和線性范圍的確定

將混合標(biāo)準(zhǔn)液在上述得到的色譜條件下進(jìn)行定量分析，以峰面積外標(biāo)法定量，得出胡椒醛、胡椒酸以及黃樟油素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)(見表2)。其中，3種物質(zhì)在10～500 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

表2 回歸方程、線性范圍和檢測(cè)限 (n=5)

注：y：峰面積(mAu*s)；X：質(zhì)量濃度(g/L)。

2.3溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取按1.5.1方法制備的混合樣品，稀釋至終質(zhì)量濃度為200 mg/L，分別在室溫放置0，3，6，12，24 h后進(jìn)行考察。供試品室溫放置24 h后，胡椒醛、胡椒酸以及黃樟油素的平均RSD分別為0.65%，0.98%，0.77%。表明溶液在制備24 h基本穩(wěn)定。

2.4重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取按1.5.1 方法制備的混合樣品，平行制備5份供試品溶液，樣品溶度為200 mg/L。按照上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果表明，胡椒醛、胡椒酸以及黃樟油素的平均含量為199.95，200.51， 200.12mg /L，平均RSD分別為 0.56%，0.68%，0.62%。表明方法重現(xiàn)性良好。

2.5發(fā)酵液中胡椒醛、胡椒酸以及異黃樟素的分離檢測(cè)

按照1.3的方法進(jìn)行整個(gè)發(fā)酵過程的操作，取發(fā)酵48 h的發(fā)酵液5 mL，按1.4的方法進(jìn)行樣品處理，測(cè)定胡椒醛、胡椒酸以及異黃樟素的含量，分析譜圖見圖4。 在S.liquefaciensM2016170發(fā)酵液樣品中，檢測(cè)到9.8 mg/L胡椒酸，182 mg/L 胡椒醛以及黃樟油素200 mg/L。

1-胡椒酸;2-胡椒醛;3-黃樟油素圖4 發(fā)酵液分析譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of fermentation broth

2.6回收率與精密度實(shí)驗(yàn)

在已知含量的發(fā)酵樣品中添加一定量的胡椒醛、胡椒酸以及黃樟油素標(biāo)準(zhǔn)品，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算此3種物質(zhì)的加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3。

表3 胡椒醛、胡椒酸以及黃樟油素回收率與精密度測(cè)定結(jié)果 (n=3)

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)S.liquefaciensM2016170菌株發(fā)酵過程發(fā)酵液中的胡椒酸、胡椒醛以及黃樟油素的分析方法，通過分析流動(dòng)相成分及其配比、柱溫以及離子抑制劑實(shí)驗(yàn)得出，采用乙腈與0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，按照表1所述的梯度洗脫程序，控制柱溫30 ℃的色譜條件，對(duì)發(fā)酵液中的胡椒酸、胡椒醛以及黃樟油素3種物質(zhì)進(jìn)行了有效的分離以及定量檢測(cè)。該方法具有分離效果好、定性及定量準(zhǔn)確、分析時(shí)間較短等優(yōu)點(diǎn)，可以用于生物技術(shù)制備胡椒醛。

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Determinationofpiperonal,piperonylicacidandsafroleinfermentationbrothbyhighperformanceliquidchromatography

ZHAO Ming-tao1,ZHENG Pu1*,XING Chen-guang2,LIU Si-qin1,ZHAO Xi-jing2,CHEN Peng-cheng1

1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China) 2(Laboratory of Biological Engineering,Xiamen Oamic Biotechnology Co.,Ltd.,Xiamen 361000,China)

A high performance liquid chromatography method was developed for the determination of piperonal,piperonylic acid and safrole in fermentation broth.The separation was performed on Amethyst C18-H C18column (250 mm × 4.6 mm，5μm) using gradient elution,the mobile phase A was acetonitrile and B was 0.1% formic acid solution.The column temperature was chosen for 30 ℃ and the detection wave length was 270 nm.It was found that piperonal,piperonylic acid and substrate safrole could be well separated in the conditions,which showed that average recoveries were within the range of 98.0%-101.0%,and the relative standard deviations ranging from 0.5% to 2.0% in samples.This method was also applied for the determination of fermentation broth ofSerratialiquefaciensM2016170,which contained 182 mg/L piperonal and 9.8 mg/L piperonylic acid.

high performance liquid chromatography;piperonal;piperonylic acid;Serratialiquefaciens;fermentation broth

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.12206

碩士研究生(鄭璞教授為通訊作者，E-mail: zhengpu@jiangnan.edu.cn)。

2016-06-12，改回日期：2016-08-31