孫寧，張佳林，張城碩，焦奧，陳保民

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院肝膽外科暨器官移植科，沈陽 110001）

DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑 SGI-1027 對人肝細胞癌細胞增殖及凋亡的影響

孫寧，張佳林，張城碩，焦奧，陳保民

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院肝膽外科暨器官移植科，沈陽 110001）

目的探討 SGI-1027 對肝細胞癌細胞增殖及凋亡的影響。方法給予不同濃度（0、5、10、15、20、25、30 和 35 μmol/L）的SGI-1027 處理 Huh7 細胞 24 h 后，MTS 法檢測 SGI-1027 對 Huh7 細胞增殖活性的影響。實驗組 Huh7 細胞中加入 SGI-1027 30 μmol/L，對照組 Huh7 細胞中僅加入等量 0.1%DMSO；碘化丙啶染色和流式細胞儀檢測 SGI-1027 對 Huh7 細胞周期的影響；Annexin V-FITC/PI雙染法和流式細胞儀檢測 SGI-1027 對 Huh7 細胞凋亡的影響；TUNEL 染色觀察 SGI-1027 處理后 Huh7 細胞形態(tài)變化。結(jié)果SGI-1027 在 Huh7 細胞中的 IC50為 27.3 μmol/L，SGI-1027 能夠抑制 Huh7 細胞增殖，并呈劑量依賴性。SGI-1027不影響 Huh7 細胞周期；SGI-1027 能夠誘導 Huh7 細胞凋亡，對照組和實驗組的凋亡率分別為（3.242±0.204）%和（46.57±2.512）%（P ＜ 0.05）。TUNEL 染色觀察對照組細胞呈圓形，而實驗組細胞呈典型凋亡表現(xiàn)，對照組和實驗組凋亡細胞百分率分別為（1.077±0.407）%和（58.24±8.427）%（P ＜ 0.05）。結(jié)論SGI-1027 能夠抑制 Huh7 細胞增殖，并且能夠誘導其凋亡。

DNA 甲基化；DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑；SGI-1027；肝細胞癌

原發(fā)性肝癌是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率排名第 4 位，致死率排名第 3 位［1］。肝細胞癌是原發(fā)性肝癌中最常見的一種，其對化療的不敏感性和易耐藥性很大程度上限制了化療藥物在治療中的應用，而其靶向治療尚處于起步階段，索拉非尼對患者生存率的影響甚微。隨著研究的不斷深入，個體化基因治療開始引起人們的重視［2］。

近年來，研究［3］發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學改變（特別是DNA甲基化）與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。哺乳動物的DNA甲基化修飾與抑制基因的表達、親本印記、X染色體失活和抑制基因組重復元素等有關(guān)［4-5］。重復元素的低甲基化會導致基因組不穩(wěn)定，而基因啟動子區(qū)高甲基化則與基因沉默、細胞增殖、凋亡和DNA修復有關(guān)，所以DNA異常甲基化與腫瘤抑制基因功能失活密切相關(guān)［6］，但不同于導致基因失活的其他原因，DNA甲基化是一個可逆的過程，因此尋找能夠抑制或逆轉(zhuǎn)甲基化的藥物是基因治療的一個關(guān)鍵靶點。

DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）抑制劑可通過抑制DNA 甲基化的激活恢復抑癌基因的表達活性和功能，從而抑制腫瘤細胞的生長，誘導其凋亡，因此DNMTs抑制劑可作為潛在的抗癌藥物應用于癌癥治療［7-9］。最近，非核苷類 DNMTs抑制劑的出現(xiàn)進一步推動了去甲基化治療的進展。SGI-1027 是一種新型的 DNMTs小分子抑制劑［10-11］，它并不通過與 RNA 或 DNA 結(jié)合來抑制 DNMTs的活性，而是通過誘導降解DNMTs達到去甲基化的目的。但目前關(guān)于 SGI-1027 的去甲基化作用對人肝細胞癌細胞增殖、凋亡的影響尚無研究。因此，本研究主要探討 SGI-1027對肝細胞癌細胞增殖及凋亡的影響，了解 SGI-1027 的作用機制，為今后去甲基化藥物應用于肝細胞癌的治療提供新的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

人肝細胞癌細胞Huh7購自中國科學院細胞庫；DMEM 培養(yǎng)基（美國 Invitrogen 公司）；胎牛血清 FBS（美國 Life Technologies 公司）；SGI-1027（美國 Selleck公司）；MTS檢測試劑盒（美國Promega公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國MPBIO公司）；細胞周期檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒、TUNEL檢測試劑盒（凱基生物技術(shù)有限公司）；PBS（0.01 mol/L，pH 7.4，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；4%多聚甲醛、Triton X-100（索萊寶生物科技有限公司）。酶標儀（美國 Thermo 公司）；BD FACSCalibur流式細胞儀（美國 Becton Dickinson 公司）；熒光顯微鏡 DMI4000（德國Leica公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)

Huh7細胞單層貼壁生長于配置好的DMEM培養(yǎng)基中，內(nèi)含 10%胎牛血清、青霉素 G 濃度 100 U/L、鏈霉素濃度 100 μg/L，37 ℃、5%CO2恒溫密閉式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 細胞增殖活性測定

按 照 藥 品 說 明 配 制 SGI-1027 50 mmol/L 儲 存液，分裝后存放于-80 ℃待用。工作液濃度為 30 μmol/L。細胞鋪板密度為 1×104/孔，接種于 96 孔板，培養(yǎng) 24 h 后加入不同濃度（0、5、10、15、20、25、30和 35 μmol/L）的 SGI-1027，其 中 0 組 僅 加 入 0.1% DMSO，24 h 后每孔加入 20 μL MTS 液（注意避光），置于 37 ℃孵箱 4 h。酶標定量儀在波長 490 nm、參考波長為 450 nm 下測定光密度值；細胞存活率（%）=（OD實驗組-OD調(diào)零孔）/（OD對照組-OD調(diào)零孔）×100。測定 SGI-1027 作用于 Huh7 細胞的 IC50為 27.3 μmol/L，故后續(xù)實驗中選用 30 μmol/L 作為實驗組給藥濃度，藥物處理時間為24 h。

1.4 檢測細胞周期

細胞培養(yǎng)同前。細胞鋪板密度為 2×105/孔，接種于 6孔板，對照組僅加入 0.1%DMSO，實驗組加入30 μmol/L SGI-1027，24 h 后 0.25%不含 EDTA 胰酶消化收集，逐步按照細胞周期檢測試劑盒說明書操作，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.5 檢測細胞凋亡

細胞培養(yǎng)、實驗分組、細胞鋪板、細胞處理及消化細胞方法同前。PBS 洗滌細胞 2 次，2 000 r/min 離心 5 min，收集細胞數(shù)不能少于（1～5）×105，逐步按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，1 h 內(nèi)流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6 TUNEL染色

細胞培養(yǎng)、實驗分組、細胞鋪板、細胞處理方法同前。按照TUNEL檢測試劑盒說明書要求操作，熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)改變，激發(fā)波長 543 nm，發(fā)射波長 571 nm，拍照后計數(shù)細胞凋亡率。凋亡率（%）=凋亡細胞數(shù)/接種細胞數(shù)×100。

1.7 統(tǒng)計學分析

采 用 SPSS 19.0 統(tǒng) 計 軟 件 對 數(shù) 據(jù) 進 行 統(tǒng) 計 分析。所有實驗均進行3次，數(shù)據(jù)以x± s表示，細胞增殖活性及 IC50的組間比較采用單因素方差分析，實驗組與對照組兩兩比較采用配對樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SGI-1027 抑制 Huh7 細胞增殖活性

MTS 法檢測不同濃度梯度 SGI-1027 處理 24 h后Huh7 細胞增殖活性的變化。結(jié)果顯示：當 SGI-1027 的給藥劑量達到 20 μmol/L 時便對 Huh7 細胞的增殖活性產(chǎn)生抑制，而當給藥劑量達到 35 μmol/L時細胞的增殖活性受到明顯的抑制。另外，SGI-1027 作用于 Huh7 細胞的 IC50為 27.3 μmol/L（圖 1）。

2.2 SGI-1027 不影響 Huh7 細胞周期

圖1 不同濃度SGI-1027對Huh7細胞增殖活性的影響Fig.1 Effect of various concentrations of SGI-1027 on the proliferative viability of Huh7 cells

碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色和流式細胞儀檢測 SGI-1027 對 Huh7 細胞周期的影響，結(jié)果顯示：對照組和實驗組中 G1期細胞比例分別為（73.810±1.357）%和（72.547±2.724）%；S 期細胞百分比分別為（17.017±1.443）%和（14.140±1.067）%；G2期 細 胞 比 例 分 別（8.377 ± 1.542）% 和（6.110 ± 4.116）%，實驗組與對照組間各期細胞比例均無統(tǒng)計學差異（P ＞ 0.05），SGI-1027 并不影響 Huh7 的細胞周期，見圖2。

2.3 SGI-1027 促進 Huh7 細胞凋亡

圖2 SGI-1027 對 Huh7 細胞周期的影響Fig.2 Effects of SGI-1027 on the cell cycle of Huh7 cells

Annexin V-FITC/PI雙染法和流式細胞儀檢測實驗組和對照組Huh7細胞的凋亡情況，結(jié)果顯示：實驗組 Huh7 細胞在給予 SGI-1027 去甲基化處理 24 h后，可檢測到大量早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞，而對照組中，不論早期凋亡細胞還是晚期凋亡細胞都很少被檢測到，計算對照組和實驗組的細胞凋亡率分別為（3.242±0.204）%和（46.57±2.512）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見圖 3。

圖3 SGI-1027 對 Huh7 細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of SGI-1027 on the apoptosis of Huh7 cells

另外，本研究還采用TUNEL染色法對實驗組和對照組中Huh7細胞的形態(tài)改變進行了觀察，同時進一步驗證 SGI-1027 對 Huh7 細胞凋亡的促進作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：實驗組Huh7細胞可觀察到細胞收縮、核染色或染色質(zhì)凝集、細胞凋亡小體形成等典型的細胞凋亡表現(xiàn)，而對照組Huh7細胞形態(tài)呈圓形，且實驗組中熒光染色后的凋亡細胞比對照組更明亮。對照組和實驗組凋亡細胞百分率分別為（1.077± 0.407）% 和（58.240 ± 8.427）% ，差 異 有 統(tǒng) 計 學 意 義（P＜ 0.05），見圖 4。

圖4 TUNEL染色法觀察Huh7細胞形態(tài)的改變Fig.4 TUNEL staining was used to observe the morphological changes of Huh7 cells

3 討論

DNMTs是DNA甲基化修飾中必不可少的關(guān)鍵因素，在其催化下S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶形成 5-甲基胞嘧啶，從而形成甲基化［12］。因此，對于DNMTs抑制劑的研究成為抗癌藥物研究領(lǐng)域的一大熱點。近幾年來，已有一些DNMTs抑制劑正處于臨床前期和臨床研究評價階段，比如5-氮雜胞苷、地西他濱、法扎拉濱等［13］。事實上，地西他濱已通過美國食品藥品監(jiān)督管理局批準，并用于骨髓增生異常綜合征的治療［14］。但這些藥物共同的特點是均為核苷類抑制劑，它們可以與DNA結(jié)合或同時結(jié)合DNA和RNA形成新的產(chǎn)物，所以此類藥物性質(zhì)不穩(wěn)定和相對較高的細胞毒性限制了其在臨床中的應用［15-16］。另外還有 SGI-110（以前稱為 S110），它是一種復合抑制劑，含有5-氮雜胞苷核苷酸和脫氧鳥苷的同時含有5-氮雜脫氧胞苷的一部分，雖然研究顯示 SGI-110 抑制 DNA 甲基化非常有效，但其穩(wěn)定性和細胞毒性與地西他濱相同［17］。

SGI-1027是一種新型喹啉類非核苷類抑制劑，性狀穩(wěn)定并具有高度親脂性（單基團吡啶類似物），它可以通過抑制DNMTs的活性從而達到去甲基化的目的，恢復抑癌基因的活性。此外，它并不與RNA或DNA結(jié)合，所以其穩(wěn)定性和毒性相比傳統(tǒng)的核苷類 DNMTs抑制劑低［10］。到目前為止，其去甲基化作用對腫瘤細胞生物學行為的影響尚無研究報道，特別是其抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡的研究甚少。

本研究中，MTS檢測結(jié)果顯示SGI-1027能夠抑制肝細胞癌細胞的增殖活性，并呈劑量依賴性。通常細胞增殖的抑制作用與細胞周期進程和細胞凋亡有關(guān)，然而本研究發(fā)現(xiàn) SGI-1027 對 Huh7 的細胞周期沒有明顯的影響。為了進一步研究 SGI-1027抑制Huh7細胞增殖活性與細胞凋亡之間是否存在一定的關(guān)系，本研究使用 Annexin V-FITC/PI雙染法及流式細胞儀檢測細胞凋亡，同時采用TUNEL染色觀察其去甲基化作用對Huh7細胞形態(tài)的影響。流式細胞儀分析顯示，給予有效劑量的 SGI-1027 去甲基化后，早期和晚期凋亡細胞的比例明顯增加。此外，TUNEL 染色顯示，SGI-1027 去甲基化與細胞凋亡的形態(tài)學改變具有顯著相關(guān)性。說明 SGI-1027對Huh7細胞增殖活性的抑制主要與其能夠誘導細胞凋亡有關(guān)，而與細胞周期無關(guān)。

綜上所述，SGI-1027 去甲基化作用能夠在體外抑制Huh7細胞的增殖活性并能誘導Huh7細胞凋亡，這可能與其通過去甲基化作用逆轉(zhuǎn)一些促凋亡基因的異常甲基化狀態(tài)使其重新表達有關(guān)，但具體的分子機制仍需今后進一步的研究和探索。

［1］CHEN W，ZHENG R，BAADE PD，et al.Cancer statistics in China，2015［J］.CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132.DOI：10.3322/ caac.21338.

［2］DAI ZJ，TANG W，LU WF，et al.Antiproliferative and apoptotic effects of beta-elemene on human hepatoma HepG2 cells［J］.Cancer Cell Int，2013，13（1）：27.DOI：10.1186/1475-2867-13-27.

［3］ESTELLER M.Epigenetic gene silencing in cancer：the DNA hypermethylome［J］.Hum Mol Genet，2007，16（1）：R50-R59.DOI：10.1093/hmg/ddm018.

［4］BONASIO R，TU S，REINBERG D.Molecular signals of epigenetic states［J］.Science，2010，330（6004）：612-616.DOI：10.1126/science.1191078.

［5］FENG S，JACOBSEN SE，REIK W.Epigenetic reprogramming in plant and animal development［J］.Science，2010，330（6004）：622-627.DOI：10.1126/science.1190614.

［6］HERMAN JG，BAYLIN SB.Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation［J］.N Engl J Med，2003，349（21）：2042-2054.DOI：10.1056/NEJMra023075.

［7］KONDO Y.Epigenetic cross-talk between DNA methylation and histone modifications in human cancers［J］.Yonsei Med J，2009，50（4）：455-463.DOI：10.3349/ymj.2009.50.4.455.

［8］ESTELLER M.Epigenetics in cancer［J］.N Engl J Med，2008，358（11）：1148-1159.DOI：10.1056/NEJMra072067.

［9］DEDEURWAERDER S，DEFRANCE M，CALONNE E，et al.Evaluation of the infinium methylation 450K technology［J］.Epigenomics，2011，3（6）：771-784.DOI：10.2217/epi.11.105.

［10］DATTA J，GHOSHAL K，DENNY WA，et al.A new class of quinoline-based DNA hypomethylating agents reactivates tumor suppressor genes by blocking DNA methyltransferase 1 activity and inducing its degradation［J］.Cancer Res，2009，69（10）：4277-4285. DOI：10.1158/0008-5472.CAN-08-3669.

［11］ GROS C，F(xiàn)LEURY L，NAHOUM V，et al.New insights on the mechanism of quinoline-based DNA methyltransferase inhibitors［J］.J Biol Chem，2015，290（10）：6293-6302.DOI：10.1074/jbc. M114.594671.

［12］ HOLLIDAY R，PUGH JE，DNA modification mechanisms and gene activity during development［J］.Science，1975，187（4173）：226-232.

［13］GHOSHAL K，BAI S.DNA methyltransferases as targets for cancer therapy［J］.Drugs Today（Barc），2007，43（6）：395-422.DOI：10.1358/dot.2007.43.6.1062666.

［14］OKI Y，AOKI E，ISSA J.P.Decitabine-bedside to bench［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2007，61（2）：140-152.DOI：10.1016/j.critrevonc.2006.07.010.

［15］GORBUNOVA V，SELUANOV A，MITTELMAN D，et al.Genomewide demethylation destabilizes CTG.CAG trinucleotide repeats in mammalian cells［J］.Hum Mol Genet，2004，13（23）：2979-2989. DOI：10.1093/hmg/ddh317.

［16］MUND C，HACKANSON B，STRESMANN C，et al.Characterization of DNA demethylation effects induced by 5-Aza-2’-deoxycytidine in patients with myelodysplastic syndrome［J］.Cancer Res，2005，65（16）：7086-7090.DOI：10.1158/0008-5472.CAN-05-0695.

［17］YOO CB，JEONG S，EGGER G，et al.Delivery of 5-aza-2’-deoxycytidine to cells using oligodeoxynucleotides ［J］.Cancer Res，2007，67（13）：6400-6408.DOI：10.1158/0008-5472.CAN-07-0251.

（編輯 陳 姜）

Effect of DNA Methyltransferase Inhibitor SGI-1027 on Proliferation and Apoptosis of Human Hepatocellular Carcinoma Cells

SUN Ning，ZHANG Jialin，ZHANG Chengshuo，JIAO Ao，CHEN Baomin

（Department of Hepatobiliary and Transplantation Surgery，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo elucidate the inhibitory effect of SGI-1027 on cell proliferation and apoptosis of Huh7 cells.MethodsHuh7 cells were treated with different concentrations（0，5，10，15，20，25，30，and 35 μmol/L）of SGI-1027 for 24 h.MTS assay was performed to detect cell proliferation.Huh7 cells treated with 0.1%DMSO were used as the control group，and those treated with 30 μmol/L SGI-1027 as the experimental group.Flow cytometry was performed to study the cell cycle，and Annexin V-FITC/PI detection for studying cell apoptosis.TUNEL staining was performed to observe changes in cell morphology.ResultsThe results of the MTS assay revealed that SGI-1027 significantly inhibited the proliferation of Huh7 cells in a dose-dependent manner，and the IC50was 27.3 μmol/L.SGI-1027 did not block the cell cycle of Huh7 cells，but induced cell apoptosis in Huh7 cells.The rates of apoptosis were 3.242% ± 0.204%in the control group and 46.57% ± 2.512%in the experimental group（P ＜ 0.05）.In the experimental group，typical apoptotic nucleus alterations were observed by fluorescence microscopy after TUNEL staining.The percentage of apoptotic cells was 1.077% ± 0.407%in the control group and 58.24% ± 8.427%in the experimental group（P ＜ 0.05）.ConclusionSGI-1027 inhibits Huh7 cell proliferation and induces apoptosis in vitro.

DNA methylation；DNA methyltransferase inhibitor；SGI-1027；hepatocellular carcinoma

R979.1

A

0258-4646（2017）09-0807-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170906.1318.016.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.09.009

沈陽市科學技術(shù)計劃（F13-212-9-00）

孫寧（1986-），女，醫(yī)師，博士.

張佳林，E-mail：jlzcmu@126.com

2017-03-31

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017-09-06 13:18